Mục tiêu của đề tài nghiên cứu nhằm đánh giá vai trò của kỹ thuật tế bào dòng chảy trong chẩn đoán và tầm soát bệnh tiểu huyết sắc tố kịch phát về đêm (PNH). Và nghiên cứu tiến hành nghiên cứu trên những bệnh nhân nghi ngờ có bệnh tiểu huyết sắc tố về đêm và suy tủy tại bệnh viện Truyền Máu Huyết Học.
Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 Nghiên cứu Y học BƯỚC ĐẦU ỨNG DỤNG KỸ THUẬT TẾ BÀO DÒNG CHẢY TRONG CHẨN ĐOÁN BỆNH TIỂU HUYẾT SẮC TỐ KỊCH PHÁT VỀ ĐÊM Trần Thị Thiên Kim*, Nguyễn Thụy Loan Chi**, Nguyễn Phương Liên***, Nguyễn Hồng Điệp***, Nguyễn Thị Kim Yến*** TÓM TẮT Mục tiêu nghiên cứu: Đánh giá vai trò kỹ thuật tế bào dòng chảy chẩn đoán tầm soát bệnh tiểu huyết sắc tố kịch phát đêm (PNH) Phương pháp nghiên cứu: Phân tích hàng loạt ca Sử dụng kháng thể đơn dòng có gắn huỳnh quang phân tích hệ thống máy FACS Canto II phần mềm Diva Tiến hành nghiên cứu bệnh nhân nghi ngờ có bệnh tiểu huyết sắc tố đêm suy tủy bệnh viện Truyền Máu Huyết Học Kết quả: Có 16 bệnh nhân phân tích dấu ấn miễn dịch kỹ thuật tế bào dòng chảy Tuổi trung vị 22, tỉ lệ nam nữ 1:1 Có bệnh nhân giảm dòng tế bào có bệnh nhân chẩn đoán suy tủy Anti CD59 tỏ nhạy anti CD55 việc tầm sốt dòng tế bào bị đột biến Tỉ lệ thiếu CD14 50% CD16 42% trường hợp khảo sát Trường hợp thiếu CD dòng tế bào 44%, trường hợp cần theo dõi thêm Bệnh nhân suy tủy khơng có dấu hiệu tán huyết nội mạch có ca phát thiếu hụt CD dòng tế bào.Trong số bệnh nhân thiếu máu tán huyết xác định chắn PNH thiếu hụt CD dòng tế bào có 62,5% tiểu Hb 75% test Hamdacie dương tính Kết luận: Kỹ thuật xác định Dấu ấn miễn dịch phương pháp tế bào dòng chảy (Flow cytometry) thực tầm sốt dễ dàng xác bệnh PNH Cần lựa chọn đối tượng bệnh nhân thích hợp để tránh bỏ sót bệnh Trường hợp thiếu hụt CD dòng tế bào cần theo dõi thêm chưa thể khẳng định PNH Từ khố: Kỹ thuật tế bào dòng chảy, bệnh PNH, protein gắn neo GPI, tiểu hemoglobin, Hamdacie test Viết tắt: Bệnh PNH: bệnh tiểu huyết sắc tố kịch phát đêm; neo GPI: protein glycophosphatidylinositol gắn màng tế bào; tiểu Hb: tiểu huyết sắc tố ABSTRACT INITIAL APPLICATION OF FLOW CYTOMETRY IN THE DIAGNOSIS OF PAROXYMAL NOCTURNAL HEMOGLOBINURIA Tran Thi Thien Kim, Nguyen Thuy Loan Chi, Nguyen Phuong Lien, Nguyen Hong Diep, Nguyen Thi Kim Yen * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 15 - Supplement of No - 2011: 481 - 487 Objective: Accessing the role of the Flow cytometry in the diagnosis and screening for the Paroxymal nocturnal hemoglobinuria Method: Case series We used many fluorescence monoclonal antibodies and analysed the blood samples of patients who were suspected of having PNH or aplastic anemia on FACS Canto II with Diva software at Blood Transfusion and Hematology Hospital Results: There are 16 patients were analysed immunophenotypes by flow cytometry The median age is 22; * Khoa Phòng khám, bệnh viện Truyền Máu Huyết Học TP.HCM ** Bộ mơn Sinh Hóa, ĐHYK Phạm Ngọc Thạch TP.HCM *** Bộ phận Dấu ấn miễn dịch, Khoa Miễn Dịch, bệnh viện Truyền Máu Huyết Học TP.HCM Tác giả liên lạc: BS Trần Thị Thiên Kim ĐT: 0934189633 Chuyên Đề Truyền Máu Huyết Học Email: thienkim6583@yahoo.com 481 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 male and female ratio is 1:1 There are four patients who had cytopenia in two lineages in which two were diagnosed aplastic anemia Anti CD59 proved more sensitive in screening the mutant clones than CD55 The rate of deficiency CD14 is 50% and CD16 is 42% of the survey cases Cases lacking of one CD on one lineage account for 44%, these cases should be monitored longer Bone marrow failure patients had no sign of intravascular hemolysis and only one case (50%) was found lacking of one CD on one lineage Among patients who had a certain diagnosis of PNH (having two CD on two lineages) the symptoms hemoblobinuria make up 62.5% and Hamdacie test posive make up 75% Conclusion: Technique for indentyfying immunophenotypes by Flow cytometry can easily and correctly screen PNH disease Nessesary to select approriate patients to avoid missing diagnosis Cases lacking only one CD on one lineage should be monitored more, it could not confirm PNH in these cases Keywords: flowcytometry, paroxymal nocturnal hemoglobinuria, protein linked to GPI anchors, hemoglobinuria, Hadacie test PNH: paroxymal nocturnal hemoglobinuria, GPI: glycophosphatditylinositol TP Hồ Chí Minh), từ tháng 03 năm 2011 đến ĐẶT VẤN ĐỀ bắt dầu áp dụng kỹ thuật xác định Dấu Tiểu huyết sắc tố kịch phát đêm (PNH) ấn miễn dịch phương pháp tế bào dòng bệnh lý gặp liên quan đến rối loạn chảy (Flow cytometry) 16 bệnh nhân để tầm mắc phải tế bào gốc tạo máu Ngun nhân sốt chẩn đốn xác bệnh PNH Chúng đột biến thể xô-ma gen PIG-A liên tổng kết số kết thu từ kết với NST-X, dẫn đến thiếu hụt phần việc tiến hành phương pháp chẩn đốn hồn tồn protein thường liên kết ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU với màng tế bào neo GPI (GPI-AP) CD55 CD59 Mặc dù PNH gặp Thiết kế nghiên cứu việc tầm sốt chẩn đốn xác bệnh Phân tích hàng loạt ca quan trọng, PNH bệnh mãn tính kéo Dân số nghiên cứu dài nhiều năm có ảnh hưởng lớn Những bệnh nhân thiếu máu tán huyết đến chất lượng sống biến chứng suy tủy bệnh viện TMHH TP HCM bệnh ảnh hưởng đến sống bệnh nhân(1) Tiêu chuẩn chọn bệnh Trong vòng 20 năm qua, giới người ta ứng dụng kỹ thuật xác định Dấu ấn miễn dịch phương pháp tế bào dòng chảy (Flow cytometry) để tầm soát, chẩn đoán theo dõi bệnh PNH xét nghiệm có tính đặc hiệu, nhạy nhanh chóng PNH bệnh lý rối loạn tạo dòng tế bào gốc tạo máu Hậu tất dòng tế bào máu bị ảnh hưởng Vì để tránh bỏ sót cần phải khảo sát thiếu hụt protein gắn GPI dòng tế bào máu Hiện dòng hồng cầu, bạch cầu hạt bạch cầu đơn nhân chọn lựa để khảo sát protein bề mặt này(2) Bệnh nhân nghi ngờ PNH cần tầm soát flow cytometry theo khuyến cáo Nhóm quyền lợi bệnh nhân PNH quốc tế (I-PIG)(7): Tại phận Dấu ấn miễn dịch (thuộc Khoa Miễn dịch – Bệnh viện Truyền máu huyết học - Bệnh nhân có tắc mạch vị trí đặc biệt (thường có chứng tán huyết nội mạch): hội 482 - Tiền sử tiểu huyết sắc tố đợt - Có chứng tán huyết nội mạch Coombs’test âm tính khơng hồng cầu hình cầu (phải có mức LDH tăng cao) - Bệnh nhân suy tủy (tầm sốt năm khơng có tán huyết nội mạch) - Bệnh nhân chẩn đoán loạn sinh tủy với thể thiếu máu khó chữa (RA) thể giảm dòng khó chữa (RCMD) Chun Đề Truyền Máu Huyết Học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 chứng Budd-Chiari, tắc tĩnh mạch ổ bụng, tĩnh mạch não Tiêu chuẩn loại trừ Những bệnh nhân không nằm tiêu chuẩn chọn bệnh Kỹ thuật Đối với dòng hồng cầu Pha loãng mẫu máu ngoại vi (được giữ ống chống đơng EDTA Vaccutainer®) với PBS theo tỉ lệ 1:150 trộn đều, sau đem nhuộm với CD55-APC CD59-PE khoảng 15 phút nhiệt độ phòng bóng tối, sau ly tâm rửa với PBS lần tạo dịch huyền phù để phân tích Đối với dòng bạch cầu hạt dòng mono Sử dụng mẫu máu ngoại vi (được giữ ống chống đơng EDTA Vaccutainer®) đem nhuộm với kháng thể đơn dòng gắn huỳnh quang (bao gồm: CD14-FITC/ CD45-Per.CP/ CD55-APC CD16-FITC/ CD59-PE/ CD45Per.CP) khoảng 15 phút nhiệt độ phòng bóng tối Sau đó, loại bỏ hồng cầu dung dịch ammonium chloride rửa tạo dịch huyền phù để phân tích Cuối mẫu xử lý thu thập qua hệ thống máy FACS Canto II phân tích phần mềm FACSDiva verson 2.1 hãng Becton Dickinson (Mỹ) Phân tích số liệu Sử dụng phần mềm Stata để phân tích thống kê KẾT QUẢ Hb (g/dl) PLT (x 10 /l) Bilirubin toàn phần (umol/L) Bilirubin trực tiếp (umol/L) HC hypochronic: +/ ++/ +++ Ferritine (ng/ml) LDH (U/L) Haptoglobin (mg/dL) ANA: (n = 13) Dương (%) Âm (%) Chẩn đoán: (n = 16) Thiếu máu tán huyết (%) Suy tủy (%) 5,06 ± 2,39 (2,76 – 10,56) 39,6 (19 – 85,6) 7,96 (5,45 – 10,1) (n = 12) 3/ 1/ 333 (28 – 1142) 618 (290 – 1184) 0,6 (0,1 – 10,2) 13 (100) (0) 14 (87,5) (12,5) Bảng 2: Kết phân tích Dấu ấn miễn dịch (DAMD) Tỉ lệ Dòng hồng Dòng mono Dòng bạch cầu dương cầu hạt tính với CD n (%) CD CD CD CD CD CD CD CD 55 59 55 59 14 55 59 16