Ứng dụng kỹ thuật hóa mô miễn dịch trong chuẩn đoán bệnh đốm trắng trên tôm sú

Tài liệu tham khảo chuyên ngành công nghệ sinh học Ứng dụng kỹ thuật hóa mô miễn dịch trong chuẩn đoán bệnh đốm trắng trên tôm sú

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

***000***

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

ỨNG DỤNG KỸ THUẬT HÓA MÔ MIỄN DỊCH

(IMMUNOHISTOCHEMISTRY) TRONG CHẨN ĐOÁN BỆNH ĐỐM TRẮNG (White Spot Disease – WSD) TRÊN TÔM SÚ

(Penaeus monodon)

Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2001 – 2005

Sinh viên thực hiện: TRẦN NGỌC ÁNH MAI

Thành phố Hồ Chí Minh - 2005 -

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

***000***

ỨNG DỤNG KỸ THUẬT HÓA MÔ MIỄN DỊCH

(IMMUNOHISTOCHEMISTRY) TRONG CHẨN ĐOÁN BỆNH ĐỐM TRẮNG (White Spot Disease – WSD) TRÊN TÔM SÚ

(Penaeus monodon)

ThS NGÔ XUÂN TUYẾN

Thành phố Hồ Chí Minh

2005

-iii

LỜI CẢM TẠ

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu trường Đại học Nông Lâm TPHCM và quý thầy cô Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học đã tận tình truyền đạt kiến thức trong những năm qua

Để hoàn thành luận văn tốt nghiệp này tôi đã nhận được sự giúp đỡ rất nhiều từ Viện Nghiên Cứu và Nuôi Trồng Thủy Sản II Vì vậy xin gửi lòng biết ơn sâu sắc đến:

- TS Nguyễn Văn Hảo - ThS Ngô Xuân Tuyến - BSTY Lê Thị Bích Thủy

- Các anh chị phòng Mô Học và phòng PCR thuộc Trung Tâm Quốc Gia Quan Trắc Cảnh Báo Môi Trường và Phòng Ngừa Dịch Bệnh Thuỷ Sản Khu Vực Nam Bộ - Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thuỷ Sản II

- Các anh chị phòng Sinh Học Thực Nghiệm và toàn thể nhân viên Trại Thực Nghiệm Nuôi Thuỷ Sản - Thủ Đức – TPHCM.

Những gì mà tôi học được trong thời gian thực hiện đề tài tại Viện Nghiên Cứu Và Nuôi Trồng Thủy Sản II là những bài học thực tế mà tôi sẽ không thể nào quên

Do hạn chế về thời gian cũng như kiến thức nên luận văn này không thể tránh khỏi những thiếu sót nhất định, tôi rất mong nhận được sự góp ý chân thành của thầy cô và các bạn

Penaeus monodon trong phòng thí nghiệm Việt Nam Đó là quy trình hoá mô miễn

dịch (Immunohistochemistry - IHC) dựa trên kháng thể đơn dòng Đại học Gent đã phát triển quy trình chuẩn cho kiểm nghiệm IHC sử dụng kháng thể đơn dòng (monoclonal antibody - mAb) 8B7 kháng lại protein VP28 của WSSV ứng dụng trên mẫu cố định trong paraffin và mẫu cắt lạnh Quy trình này được nghiên cứu để thay đổi một vài chi tiết cho phù hợp hơn với điều kiện ở Việt Nam

Bốn nồng độ khác nhau của kháng thể đơn dòng (nồng độ chuẩn - 1X, 0,5X, 1,5X và 2X) và ba nồng độ khác nhau của DAB (1X, 1,5X và 2X) được bố trí thử nghiệm trên các mẫu cắt cố định trong paraffin thu từ mô của các cá thể nhiễm và không nhiễm WSSV và nồng độ chuẩn (1X) của kháng thể đơn dòng vẫn chứng tỏ tính hiệu quả ứng với nồng độ DAB là 1,5X

Để so sánh phương pháp IHC với phương pháp PCR và mô học truyền thống về tính chính xác, độ nhạy và hiệu quả kinh tế, 25 mẫu mô của tôm sú post-larvae và 30 mẫu mô của tôm sú thương phẩm đã được kiểm tra bằng cả 3 phương pháp So với 2 phương pháp còn lại, trong một số trường hợp, IHC được xem là phương pháp đáng tin cậy nhất nhờ tính đặc hiệu của kháng thể đơn dòng Khác với mô học truyền thống, IHC không quá phụ thuộc vào khả năng phát hiện tế bào nhiễm của người đọc mẫu bởi vì tín hiệu màu (màu nâu) rất rõ và dễ nhận biết Bên cạnh đó, nhờ thao tác đơn giản, mAb có độ nhạy cao và mẫu kiểm tra không dễ bị ngoại nhiễm như PCR nên IHC hiếm khi có hiện tượng dương tính giả và âm tính giả Chính vì những ưu điểm nổi bật đó của IHC chúng tôi khuyến khích sử dụng phương pháp này để chẩn đoán mầm bệnh WSSV trên tôm sú trong những thí nghiệm phục vụ nghiên cứu vốn yêu cầu cao về độ chính xác

v

ABSTRACT

White spot syndrome virus (WSSV), member of a new virus family called

This study was undertaken to develop a stable, accurate and sensitive monoclonal antibody (mAb)-based immunohistochemistry (IHC) test process for detection of

WSSV in Penaeus monodon in Vietnam laboratories The standard operating protocol

for IHC test using the WSSV VP28 mAb 8B7 on paraffin-embedded and frozen section was developed by Gent University To be more suitable in Vietnam condition, this protocol was modified in some details

Four different concentrations of mAb (standard - 1X, 0.5X, 1.5X and 2X) and three different ones of 3,3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) (1X, 1.5X and 2X) were tested on paraffin embedded sections from tissues of infected and uninfected

black tiger shrimp Penaeus monodon and the standard concentration of mAb still

proved to be efficient with the 1.5X concentration of DAB

To compare IHC method with Polymerase Chain Reaction (PCR) and traditional histology about accuracy, sensitivity and economic efficiency, 25 samples

of post-larvae tissues and 30 samples of adult tissues of Penaeus monodon were tested

with these three methods Of the three, in some cases, IHC was considered to be the most reliable technique because of the specificity of the WSSV VP28 mAb 8B7 Unlike the traditional histology, IHC is not too dependent on the professionalism of the technicians to recognize the infected cells as the color signal (brown) is very clear and easily seen Besides, IHC seldom gives false positive and negative signals because the manipulation is simple, the samples are not easily contaminated by various factors in process like PCR and the mAb is highly sensitive For all of the advantages of IHC, we suggest using this method for WSSV diagnostics on Penaeids in research experiments in which accuracy is the prerequisite

2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Đặc điểm sinh học của tôm sú 3

2.2.2.2 Phân loại và tên gọi 10

2.2.2.3 Một số đặc tính của virus đốm trắng với các yếu tố lý hoá 11

2.2.2.10 Cơ chế xâm nhiễm 17

2.2.2.11 Cơ chế truyền lan 18

2.2.2.12 Triệu chứng, bệnh tích 19

2.2.2.13 Biện pháp phòng và trị bệnh 19

2.3 Các phương pháp chẩn đoán mầm bệnh WSSV trên giáp xác 20

2.4 Sơ lược về hoá mô miễn dịch (Immunohistochemistry) 21

2.4.1 Lịch sử phát triển 21

4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 41

4.1 Kết quả nội dung hoàn thiện quy trình nhuộm IHC 41

4.1.1 Thử nghiệm quy trình nhuộm IHC với 3 nồng độ DAB khác nhau 41

4.1.2 Thử nghiệm quy trình nhuộm IHC với 4 nồng độ mAB khác nhau 44

4.2 Kết quả nội dung so sánh phương pháp IHC với phương pháp Mô học truyền thống và kỹ thuật PCR về độ chính xác, độ nhạy, tính ổn định và tính hiệu quả 49

4.2.1 So sánh tính chính xác và độ nhạy của 3 phương pháp PCR, Mô học và IHC 49

4.2.2 So sánh về tính ổn định và hiệu quả của 3 phương pháp PCR, Mô học và IHC 57

5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 59

5.1 Kết luận 59

5.2 Đề nghị 59

6 TÀI LIỆU THAM KHẢO 61

6.1 Tài liệu tiếng Việt 61

6.2 Tài liệu tiếng Anh 61

PHỤ LỤC 70 Phụ lục 1: Bảng số liệu mã hoá kết quả so sánh chi tiết 4 quy trình nhuộm

IHC với 4 nồng độ mAb khác nhau trên 10 mẫu thử nghiệm

Phụ lục 2: Bảng ANOVA của nội dung so sánh 4 quy trình nhuộm IHC với 4 nồng độ mAb

Phụ lục 3: Bảng số liệu mã hoá kết quả so sánh khả năng phát hiện mầm bệnh virus đốm trắng của ba phương pháp PCR, Mô học và IHC trên tôm sú post-larvae và tôm thương phẩm

Phụ lục 4: Bảng ANOVA của nội dung so sánh khả năng phát hiện mầm bệnh virus đốm trắng của ba phương pháp PCR, Mô học và IHC

viii

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DAB : 3,3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride FAO : Food and Agriculture Organization

ix

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Các bệnh thường gặp trên tôm penaeids 7

Bảng 2.2 Tên gọi của virus đốm trắng .11

Bảng 3.1 Các mẫu thử nghiệm cho nội dung 1 30

Bảng 3.2 Các mẫu thử nghiệm cho nội dung 2 31

Bảng 3.3 Bố trí thí nghiệm cho nội dung 1 34

Bảng 3.4 Bố trí thí nghiệm cho nội dung 2 35

Bảng 4.3 Kết quả thống kê so sánh quy trình nhuộm IHC với 4 nồng độ mAb 45

Bảng 4.4 Kết quả so sánh khả năng phát hiện mầm bệnh WSSV của 3 phương pháp PCR, Mô học và IHC trên tôm sú post-larvae và tôm thương phẩm 50

Bảng 4.5 Kết quả thống kê so sánh khả năng phát hiện mầm bệnh virus đốm trắng của ba phương pháp PCR, Mô học truyền thống và IHC 51

Bảng 4.6 So sánh ưu khuyết điểm của 3 phương pháp PCR, Mô học truyền thống và IHC 57

x

DANH SÁCH CÁC SƠ ĐỒ VÀ HÌNH ẢNH

HÌNH NỘI DUNG TRANG

Hình 2.1 Sơ đồ vòng đời tôm sú 4

Hình 2.2 Sản lượng tôm ở Châu Á và những bệnh quan trọng 8

Hình 2.3 Sự phân tán và phân bố bệnh đốm trắng trên thế giới 9

Hình 2.4 Virus đốm trắng 12

Hình 2.5 Protein của WSSV 13

Hình 2.6 Sơ đồ genome của WSSV 14

Hình 2.7 Tôm nhiễm WSSV và tế bào nhiễm WSSV 19

PHẦN 1 MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề

Những năm gần đây, nuôi tôm là một trong những ngành phát triển mạnh nhất trong ngành nuôi trồng thuỷ sản trên thế giới Kể từ khi xuất hiện, nghề nuôi tôm ngày càng chứng tỏ khả năng đem lại lợi nhuận to lớn cho nền kinh tế quốc dân Ở Việt Nam, trong 10 năm trở lại đây, phong trào nuôi tôm phát triển rất nhanh, đặc biệt là khu vực các tỉnh ven biển đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL) như Cà Mau, Bạc

Liêu, Trà Vinh, Bến Tre …, và tôm sú (Penaeus monodon) là một đối tượng nuôi chủ

lực của ngành nuôi trồng thủy sản nước ta

Tuy nhiên, việc phát triển ồ ạt không định hướng, kỹ thuật quản lý ao chưa tốt, không quan tâm đúng mức đến vấn đề môi trường làm phát sinh nhiều yếu tố rủi ro, trong đó chủ yếu là bệnh tật Trong nhiều năm gần đây, nghề nuôi tôm sú ở Việt Nam phải đối đầu với dịch bệnh đốm trắng (White Spot Syndrome Disease – WSD) do virus đốm trắng (White Spot Syndrome Virus – WSSV) gây nên, một loại bệnh nguy hiểm do tỉ lệ tôm chết có thể lên đến 80 – 100% trong vòng 7 – 10 ngày (Nakano và ctv, 1994), khả năng lây nhiễm rất cao, dễ thành dịch bệnh và cho đến hiện nay vẫn chưa có biện pháp phòng và trị hiệu quả Mức thiệt hại do bệnh đốm trắng gây ra đã lên đến hàng trăm tỷ đồng Vấn đề quan trọng là diễn biến bệnh xảy ra nhanh, khi người dân nhận biết được những biểu hiện bên ngoài của bệnh trên tôm thì chỉ một thời gian ngắn sau tôm sẽ chết hàng loạt mà không thể chữa được Vì vậy, việc chẩn đoán nhanh và chính xác mầm bệnh ở đầu vào của qui trình nuôi, cũng như xác định sự hiện diện mầm bệnh WSSV trên tôm trong quá trình nuôi là hết sức cần thiết Điều này sẽ giúp người dân kiểm soát được mối nguy đầu vào và kịp thời triển khai những biện pháp đối phó khi có mầm bệnh WSSV trên tôm đang nuôi

Cho đến nay đã có nhiều phương pháp xác định WSSV trên tôm sú và giáp xác đã được phát triển và ứng dụng như: Phương pháp mô học truyền thống, một số phương pháp dựa trên cơ chế miễn dịch đặc hiệu (ELISA, Western blot), phương pháp

kính hiển vi điện tử, các kỹ thuật PCR (one-step, two-step nested, realtime-PCR), in situ hybridization…Tuy nhiên việc tìm ra một phương pháp tối ưu vừa nhanh, vừa

chính xác, đồng thời có độ tin cậy cao hơn luôn là mối quan tâm lớn của các nhà

nghiên cứu bệnh thủy sản Việc kết hợp kết quả xét nghiệm của hai phương pháp IHC (Immunohistochemistry) và kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) trên cùng một mẫu tôm sẽ đáp ứng được mục tiêu trên

Trên cơ sở thiết thực này, được sự phân công của khoa Công Nghệ Sinh Học và được sự chấp thuận của Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II, chúng tôi đã tiến

hành đề tài “Ứng dụng kỹ thuật hóa mô miễn dịch (Immunohistochemistry) trong chẩn đoán mầm bệnh virus đốm trắng (White Spot Syndrome Virus – WSSV) trên tôm sú (Penaeus monodon)”

So sánh phương pháp hóa mô miễn dịch về độ ổn định, độ nhạy, độ chính xác, tính hiệu quả và hiệu quả kinh tế với các phương pháp khác

1.4 Yêu cầu

Phương pháp phải đạt độ chính xác theo tiêu chuẩn ngành Phải được xây dựng trên một cơ sở khoa học xác định

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Đặc điểm sinh học của tôm sú

2.1.1 Phân loại

Theo hệ thống phân loại của Hothuis (1980) và Barnes (1987) tôm sú thuộc

Ngành: Arthopoda (Chân khớp) Lớp: Crustacea (Giáp xác) Lớp phụ: Malacostraca

Bộ: Decapoda (Mười chân)

Bộ phụ: Macrura natantia (Bơi lội) Họ: Penaeidae (Tôm he)

Giống: Penaeus

Loài: Penaeus monodon

Tên tiếng Anh: Black Tiger Shrimp

2.1.2 Phân bố

Theo chiều ngang: Phân bố rộng rãi trên thế giới, ở vùng Ấn Độ Dương, Tây

Thái Bình Dương, từ Pakistan tới Nhật, từ quần đảo Malaysia đến Úc, đặc biệt phân bố tập trung ở vùng Đông Nam Á như Việt Nam, Philipines, Indonesia và Malaysia (Trần Minh Anh, 1989)

Theo chiều dọc: Ở giai đoạn ấu trùng và ấu niên Penaeus monodon sống nổi,

dần thích nghi sống đáy Ở vùng cửa sông, ấu niên và thiếu niên tôm sống ở tầng mặt trong khi phần lớn tôm trưởng thành sống ở mực nước sâu khoảng 70 m (ngoài khơi Philippines), hay 30 – 39 m (vịnh Thái Lan) , ở nhiệt độ là 340 C và độ mặn là 35 ppt

2.1.3 Vòng đời: Theo Vũ Thế Trụ (1995)

Tôm mẹ họ Penaeidae đẻ trứng ngoài biển sâu Trứng nở thành ấu trùng, trôi

nổi theo dòng nước và được sóng biển đưa vào gần bờ, nơi có nước sông ngòi đổ ra tạo thành môi trường nước lợ với độ mặn 15 – 25 ppt Ấu trùng trải qua nhiều giai

đoạn biến thái để thành larvae (Hình 2.1) Tổng thời gian từ khi nở đến larvae 1 (PL1) kéo dài khoảng 10 – 12 ngày

post-Tại môi trường nước lợ post-larvae sống khoảng vài tuần rồi bơi ngược ra biển, tiếp tục tăng trưởng và sinh đẻ, hoàn tất chu trình tăng trưởng của loài tôm

Hình 2.1: Sơ đồ vòng đời tôm sú Penaeus monodon

2.1.4 Sinh trưởng

Tôm gia tăng kích thước bằng cách lột bỏ lớp vỏ cũ của cơ thể Solid (1988) cho biết tôm sú thường lột xác vào ban đêm Thời gian để vỏ mới của tôm con cứng lại cần một vài giờ, ở tôm trưởng thành phải cần 1 đến 2 ngày (Viladolid và ctv, 1981)

2.1.5 Dinh dưỡng

Tôm sú ăn tạp (Hall, 1962) Giai đoạn ấu trùng tôm bắt mồi thụ động bằng các phụ bộ với các loại thức ăn phù hợp với cỡ miệng Apud (1984) nhận định tôm sú ở giai đoạn ấu trùng Zoea ăn thực vật phù du với 2 giống tảo Silic thích hợp là

Chaetoceros và Skeletonema Ở giai đoạn Mysis tôm chuyển sang ăn một số loài động

vật phù du, luân trùng và ấu trùng Nauplius của Artermia Giai đoạn post-larvae tôm ăn giun nhiều tơ, ấu trùng tôm, cua, nhuyễn thể, mùn bã hữu cơ Hall (1962) cho biết tôm trưởng thành thích ăn giáp xác, sản phẩm thực vật, giun nhiều tơ, nhuyễn thể, cá,

Biển

Cửa sông

Cửa sông Bờ biển

Biển

côn trùng Như vậy tập tính ăn và loại thức ăn của tôm sú khác nhau theo giai đoạn sinh trưởng

2.1.6 Môi trường sống

 Nhiệt độ: Theo Vũ Thế Trụ (1995), nhiệt độ tối ưu cho tôm Penaeus

spp tại các ao hồ vùng nhiệt đới khoảng 28 – 300C Trên 300C, tôm lớn nhanh nhưng dễ nhiễm bệnh, nhất là bệnh MBV (Monodon Baculovirus) Dưới 280C, tôm chậm lớn

 Độ mặn: Theo Valencia (1977) nhiệt độ và độ mặn tạo nên ảnh hưởng

kết hợp Các loài tôm có tỷ lệ sống cao ở nhiệt độ trung bình thấp và độ mặn trung bình cao nhưng sinh trưởng nhanh hơn ở điều kiện ngược lại

 Hàm lượng oxy hoà tan trong nước: Theo Chiu (1992) tôm sú chết khi

hàm lượng oxy hoà tan nhỏ hơn 3,5 mg/l Theo Chanratchakool và ctv (1995) thì khi hàm lượng oxy nhỏ hơn 4 mg/l tôm sử dụng thức ăn kém và dễ nhiễm bệnh

 Độ pH: Độ pH có ảnh hưởng trực tiếp hoặc gián tiếp đến tôm nuôi, pH

thấp có thể làm tổn thương các phần phụ, mang, quá trình lột xác và cứng vỏ

của tôm (Bauman và Jamandro, 1990)

 H2S và NH3-N: Theo Lê Xân (1996), H2S dạng tự do hình thành do sự phân huỷ của các vi khuẩn dị dưỡng trong điều kiện yếm khí Kungvankji và Chua (1986) khẳng định H2S rất độc hại đối với các sinh vật sống đáy và các

loài tôm có đặc tính vùi mình như tôm sú

 Độ kiềm: Độ kiềm tổng cộng trong nước liên quan đến những chất baz

(chủ yếu là bicarbonate và carbonate), được tính bằng mg calcium carbonate tương đương trong 1 lit Mặt nước có lượng kiềm tổng cộng 20 – 150 mg/l thì thích hợp cho sự phát triển của phiêu sinh và loài thủy sản trong đó (Vũ Thế Trụ, 1995)

2.1.7 Hiện trạng nuôi tôm sú trên thế giới và tại Việt Nam

Những năm gần đây, nuôi tôm là một trong những ngành phát triển mạnh nhất trong ngành nuôi trồng thuỷ sản trên thế giới Theo FAO (1995), sản lượng tôm khai

thác hằng năm trên thế giới là 2 triệu tấn, trong đó có 30% là tôm nuôi 50% sản lượng tôm sú được cung cấp từ Châu Á (Nguyễn Văn Hảo và ctv, 1998)

Bờ biển Việt Nam trải dài 3.260 km từ Quảng Ninh đến Kiên Giang là tiềm năng to lớn cho nuôi trồng thuỷ sản nước mặn và nước lợ Ông Nguyễn Việt Thắng, Thứ trưởng Bộ Thuỷ Sản cho biết nuôi trồng thuỷ sản đang có bước phát triển nhanh, đóng góp quan trọng cho sự tăng trưởng kinh tế chung của ngành thuỷ sản Diện tích nuôi trồng thuỷ sản liên tục tăng: Từ 887.500 ha năm 2001 lên khoảng 995.400 ha năm 2004 Theo đó, sản lượng nuôi trồng thuỷ sản tăng từ 879.000 tấn năm 2001 lên 1.420.000 tấn năm 2004, đạt mức tăng bình quân trên 20%/năm Tỷ lệ giá trị xuất khẩu so với tổng giá trị xuất khẩu thuỷ sản không ngừng tăng, đến nay đạt khoảng 50% Tỷ lệ sản lượng nuôi trồng trong tổng sản lượng thuỷ sản chiếm 39% năm 2001 đã tăng lên 48% năm 2004 (Kim Oanh, 2005)

Nghề nuôi tôm ở Việt Nam, đặc biệt là ở vùng đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL), tuy đã xuất hiện từ lâu nhưng chỉ mới thực sự phát triển từ những năm cuối thập niên 80 Hằng năm, ĐBSCL đóng góp trên 80% sản lượng thủy sản chung của toàn ngành Tại đây, diện tích nuôi quảng canh chiếm 88%, nuôi bán thâm canh và thâm canh không đáng kể (Nguyễn Văn Hảo và ctv, 1998)

Theo Nguyễn Thanh Phương (2002), hiện nay ở ĐBSCL đã phát triển và ứng dụng các mô hình nuôi tôm chủ yếu sau: Quảng canh (Extensive culture), quảng canh cải tiến (Improved extensive culture), bán thâm canh (Semi-intensive culture), thâm canh (Intensive culture) và nuôi sinh thái

2.2 Bệnh đốm trắng và virus gây bệnh đốm trắng 2.2.1 Tình hình dịch bệnh trên thế giới và tại Việt Nam

A Trên thế giới

Việc phát triển ồ ạt của nghề nuôi tôm sú trên thế giới là nguyên nhân dẫn đến sự suy thoái môi trường và dịch bệnh xảy ra khắp nơi (từ Đông Bán Cầu sang Tây Bán Cầu) gây nhiều thiệt hại nghiêm trọng Trong đó các bệnh do virus gây ra đang là một thách thức lớn cho sự phát triển nghề nuôi tôm toàn cầu Các bệnh truyền nhiễm do nhóm virus WSSV (White Spot Syndrome Virus), YHV (Yellow Head Virus) và

MBV là những bệnh điển hình về mức độ gây thiệt hại nghiêm trọng nhưng cho đến nay vẫn chưa có một loại thuốc hay vaccin nào điều trị hiệu quả

Bảng 2.1 Các bệnh thường gặp trên tôm penaeids (Lightner và Redman, 1998)

Mầm

bệnh virus Vi khuẩn Nấm Kí sinh trùng Loại khác WSSV

YHV BMN MBV IHHNV HPV REO TSV

Vibriosis:

-Septic HP necrosis -Hatchery vibriosis -Luminescent vibrio

-‘Syndrome Gaviota’

-Shell disease NHP bacterium

Rickettsia Larval mycosis Fusariosis

Epicommensals: -Leucothrix mucor -Peritrich protozoans Gregarines

Microsporidian Mất cân bằng dinh dưỡng Bệnh do độc tố Bệnh do môi trường

One month death syndrome

Dịch bệnh do WSSV gây ra thiệt hại nghiêm trọng ở nhiều quốc gia như: Ấn Độ (1994 – 1995) làm cho nhiều trang trại nuôi lớn phải đóng cửa (Murthy , 1997), Thái Lan (1996 – 1997) với thiệt hại ước tính lên đến 1 tỷ USD, Trung Quốc (1993) làm sản lượng xuất khẩu tôm từ 115.000 tấn năm 1992 giảm xuống còn 50.000 tấn năm 1993 (Flegel, 2000)

Trong 10 năm trở lại đây, WSSV đã khiến ngành công nghiệp nuôi tôm tiêu tốn 20 – 30 tỉ USD (Caleb, 2004)

Hình 2.2 Sản lƣợng tôm ở Châu Á và những bệnh quan trọng (Caleb, 2004)

Cuối năm 1993, tôm nuôi đã chết hàng loạt ở các tỉnh Bà Rịa - Vũng Tàu, Tiền Giang, Bến Tre, Trà Vinh, Cà Mau và Bạc Liêu Hiện tượng này tiếp tục xuất hiện trong hai năm 1994 – 1995 và lan rộng trên hầu hết các tỉnh ven biển phía Nam đã gây thiệt hại trên dưới 250 tỉ đồng (Phan Lương Tâm, 1994)

Gần đây, bệnh đốm trắng đã khiến cho nhiều gia đình nuôi tôm mất trắng, gây thiệt hại hàng trăm tỉ đồng Dịch bệnh nổ ra ở các tỉnh trên khắp đất nước nhất là tại các tỉnh nuôi tôm trọng điểm như Cà Mau, Bạc Liêu, Bến Tre, Tiền Giang … Tại ĐBSCL năm 1999 diện tích là 173.510 ha và sản lượng nuôi là 49.624 tấn, đến năm 2001 diện tích tăng lên thành 404.911 ha và sản lượng đạt 143.822 tấn Tuy nhiên, đến vụ một năm 2002 mức lây nhiễm bệnh là 30 - 60% trên tổng diện tích thả nuôi, mà bệnh đốm trắng do virus đốm trắng là một trong những bệnh nguy hiểm và gây tổn thất lớn

Trong 1 – 2 năm trở lại đây nghề nuôi tôm đã phát triển tới miền Bắc và trên những vùng nuôi tôm mới này bệnh đốm trắng vẫn xuất hiện và gây thiệt hại nghiêm trọng

Năm Sản

lượng (tấn)

2.2.2 Giới thiệu bệnh đốm trắng

2.2.2.1 Lịch sử và phân bố bệnh đốm trắng

Hình 2.3: Sự phân tán và phân bố bệnh đốm trắng trên thế giới (CSIRO, 2002)

Kể từ khi xuất hiện đầu tiên vào năm 1992-1993 tại Đông Bắc Châu Á, bệnh đốm trắng đã lan nhanh, rộng khắp khu vực Châu Á và khu vực Châu Á-Thái Bình Dương, nhất là các nước có nuôi tôm công nghiệp thâm canh Dịch bệnh được phát hiện trước tiên tại Đài Loan năm 1992, Trung Quốc (1993), sau đó là Nhật Bản (1993), Indonesia, Thái Lan, Malaysia, Ấn Độ, Bangladesh, Texas (Hoa Kỳ, 1995) kèm theo sự sa sút nghiêm trọng sản lượng tôm ở các quốc gia trên (Wang và ctv, 1998)

Bệnh xuất hiện bất thường và được xem như là một hiện tượng của năm 1991 và đầu năm 1992 tại một điểm riêng lẻ ở đông bắc Đài Loan Bệnh được phát hiện đầu

tiên trên Marsupenaeus japonicus nhưng sau đó lan rộng đến Penaeus monodon và Fenneropenaeus penicillatus (Walker, 2000)

Chưa phát hiện Đã phát hiện Chưa có số liệu

Tháng 3/1992, WSSV lần đầu tiên được phát hiện tại Trung Quốc Có giả thuyết rằng virus được du nhập vào Trung Quốc từ Đài Loan thông qua nhập khẩu nauplius và post-larvae Trong 5 tháng sau đó bệnh nhanh chóng lan rộng ở nhiều tỉnh dọc theo bờ biển Trung Quốc (Walker, 2000)

Tháng 3 năm 1993, WSSV xuất hiện trên tôm nuôi P japonicus ở Nhật Ngay

đầu tiên, bệnh gây ảnh hưởng nghiêm trọng đối với tất cả các trang trại ở Hiroshima, Yamagushi, Ohita, Kumamoto, Kagoshima và Okinawa (Walker, 2000)

Năm 1993, WSSV cũng được phát hiện trên loài P orientalis ở vùng biển phía

Nam và Tây Triều Tiên (Walker, 2000)

Vùng Tây bán cầu: Năm 1995, báo cáo đầu tiên về WSSV xảy ra trên ao nuôi

tôm Litopenaeus setiferus ở Texas, Hoa Kỳ Các quốc gia sau đó phát hiện đốm trắng

lần lượt là Guatamela, Elsalvador, Panama, Ecuador và Columbia năm 1999, Nicaragua và Mexico năm 2000 (Walker , 2000)

2.2.2.2 Phân loại và tên gọi

A Phân loại

WSSV đầu tiên được phân loại thuộc họ Baculoviridae (Francki và ctv, 1991)

Tuy nhiên những phân tích trình tự gần đây của hệ gen WSSV cho thấy chúng mã hóa một số loại protein không giống protein của Baculovirus như protein ribonucleotide reductase (RR1 và RR2) (van Hulten và ctv, 2000b), protein VP26, VP28 (van Hulten và ctv, 2000c) của WSSV không giống bất kì một protein đã biết nào trong database Ngoài ra, trình tự nucleotide toàn bộ hệ gen WSSV cho thấy nhiều gen không giống gen của virus nào khác (van Hulten và ctv, 2001; Yang và ctv, 2001) Sự khác biệt về genome và phổ kí chủ rộng của WSSV (Flegel, 1997) chứng tỏ WSSV là đại diện cho một họ virus mới (van Hulten và ctv, 2000a)

Gần đây nhất, M.A.Mayo (2002) công bố phân loại mới nhất được thẩm định trong Hội nghị Quốc tế về phân loại virus (International Committee on Taxonomy of

Virus - ICTV), trong đó xếp WSSV là bộ phận của chi Whispovirus trong họ virus mới gọi là Nimaviridae

B Tên gọi:

Bảng 2.2 Tên gọi của virus đốm trắng

Tên Vị trí Tài liệu tham khảo Penaeid Hemacytic Rod Shaped Virus

(PHRV)

Owens và ctv, 1993 China Baculovirus (CBV) Trung Quốc Chamberlain, 1994 Hypodermal and hematopoietic necrosis

White Spot Syndrome Virus (WSSV) Đài Loan Lo và Kou, 1998

2.2.2.3 Một số đặc tính của virus đốm trắng với các yếu tố lý hóa

Cũng như đa số các virus, virus gây bệnh đốm trắng WSSV có sức chịu đựng yếu với các yếu tố môi trường Theo Chang và ctv (1998):

 Sau 48 –72 giờ sau khi tiếp xúc môi trường nước mà không tìm được vật chủ thì WSSV sẽ bị phân hủy

 Virus mất khả năng gây nhiễm sau 60 phút dưới tia UV (Ultraviolet) 9 x 105 µWs/cm2

2.2.2.4 Độc lực

Thí nghiệm gây nhiễm mầm bệnh đốm trắng trên giáp xác gồm: 5 loài tôm biển (trong đó có tôm sú), 2 loài tôm nước ngọt (có tôm càng xanh), 4 loài cua và 3 loài tôm hùm, bằng cách cho tiêm hoặc cho ăn WSSV được tách chiết từ tôm sú

(P.monodon) nhiễm bệnh cho thấy tất cả các loài đều bị nhiễm đốm trắng với nhiều

mức độ gây chết khác nhau Tôm càng xanh sau khi tiêm 20 ngày tỷ lệ chết 20%, nếu cho ăn tỷ lệ này là 10% Không có dấu hiệu lâm sàng hoặc chỉ nhìn thấy những chấm nhỏ dưới kính hiển vi Tôm sú bị nhiễm trong thí nghiệm có cùng triệu chứng lâm sàng như tôm tự nhiên bị nhiễm (Rajendran và ctv, 1999)

Tôm bị nhiễm bệnh đốm trắng thường chết hàng loạt, bệnh này có khả năng gây thành dịch trong vòng 2-7 ngày với tỷ lệ chết từ 20-70% Nếu thu hoạch chậm tỷ lệ chết sẽ lên đến 70 -100% trong vòng 3-7 ngày kể từ khi có dấu hiệu phát bệnh mạnh (Wang và ctv, 1998) Bệnh này có tốc độ lây lan rất nhanh và nhiễm trên mọi giai đoạn trong vòng đời của tôm sú đặc biệt nhạy cảm từ sau 1-2 tháng nuôi (Lightner, 1996)

2.2.2.5 Hình thái

Virion có dạng hình que đến elip hay hình trứng, một đầu bẹt (Vlak và ctv, 2002) Virion có kích thước lớn (80-120 x 250 – 380nm) Virion tinh sạch từ tôm sau khi nhuộm cho thấy có một phần phụ giống như đuôi (Woongteerasupaya và ctv, 1995; Wang, 1995)

Virion chứa 5 protein chính: VP28, VP26, VP24, VP19, VP15 (trọng lượng phân tử là 28, 26, 24, 19 và 15 kDa) VP28 và VP19 kết hợp với phần envelope, còn VP26, VP24, VP15 gắn với nucleocapsid của virion (van Hulten, 2002) VP24 – có 41 aminoacid tận cùng bằng đầu N – đã được phân tích sinh hóa và xác định gen mã hóa

(vp24) trên genome Phân tích cho thấy VP24, VP26, VP28 rất giống nhau ở mức

aminoacid và nucleotide (van Hulten, 2000a)

Trong một phát hiện mới nhất, các nhà khoa học đã công bố một protein cấu trúc khổng lồ của WSSV, protein VP664, có chức năng chưa rõ, có thể là tham gia vào quá trình lắp ráp virion Nhiều kháng huyết thanh đa dòng kháng protein này được tạo ra và một trong số đó đã được ứng dụng thành công trong phân tích immunoelectron microscopy để định vị protein này trên virion (Leu và ctv, 2005)

Hình 2.5 Protein của WSSV (Vlak và ctv, 2002)

(A) Điện di protein của WSSV đã được tinh sạch

1: Marker; 2: protein tinh sạch từ tôm sông (P clarkii) không nhiễm WSSV; 3: WSSV đã tinh sạch; 4: Nucleocapsid của WSSV

(B) Mô hình cấu trúc đơn giản của virion WSSV

2.2.2.7 Vật chất di truyền

WSSV là virus trên động vật không xương sống biển đầu tiên được giải mã trình tự hoàn chỉnh (Yang và ctv, 2001) Genome của WSSV là DNA vòng kép lớn, kích thước thay đổi tùy theo các mẫu phân lập khác nhau: 305107 bp (GenBank Accession No AF332093), 292967 bp (GenBank Accession No AF369029) và 307287 bp (GenBank Accession No AF440570) tuần tự ứng với virus phân lập từ Trung Quốc, Thái Lan và Taipei China

Hình 2.6 Sơ đồ genome của WSSV.(Yang và ctv, 2001)

Hình mũi tên (vòng ngoài): Vị trí của 181 ORFs (màu đỏ và màu xanh chỉ hướng dịch mã khác nhau) Hình chữ nhật màu xanh lá chỉ 9 hrs B: Vị trí cắt giới hạn của enzyme BamHI (vòng trong, số trong ngoặc đơn chỉ vị trí)

Genome virus chứa 184 khung đọc mở (open reading frame – ORFs) (van Hulten và ctv, 2001) Theo Yang và ctv (2001), genome WSSV có 9 vùng đồng dạng chứa 47 tiểu phần lặp lại, gồm lặp trực tiếp (direct repeat), lặp đảo ngược không điển hình (atypical inverted repeat), và những trình tự thuận nghịch không hoàn chỉnh Tuy WSSV tương tự như Baculovirus về hình thái nhưng hai loại virus này lại không liên hệ đáng kể ở mức amino acid Vài gen của WSSV lại giống với gen của eukaryote hơn là với gen virus Phân tích trình tự cho thấy WSSV khác với tất cả những virus đã biết trước đây dù có một số gen tương đồng yếu với gen herpesvirus Hầu hết các ORFs mã hoá protein không tương đồng với bất cứ protein đã biết nào, cho thấy WSSV đại diện cho một lớp virus mới hay một khoảng tiến hoá quan trọng giữa virus biển và virus mặt đất Điểm đặc biệt nhất của WSSV là sự hiện diện của một gen mã hoá colagen

nguyên vẹn, vốn là gen mã hoá một protein matrix ngoại bào của tế bào động vật chưa bao giờ thấy trong bất cứ virus nào.

Gần đây, các nhà khoa học đã phát hiện genome của WSSV có một ORF khổng lồ chứa 18.234 nucleotide mã hóa một polypeptide gồm 6.077 aminoacid với chức năng chưa biết Polypeptide này được gọi là protein VP664 và thuộc nhóm protein cấu trúc của virus (Leu và ctv, 2005)

2.2.2.8 Đa dạng di truyền

Theo Marks và ctv (2003) cho đến nay virus WSSV phân lập từ tôm penaeids ở các vùng địa lý khác nhau thì rất giống nhau về hình thái và proteome, chỉ khác nhau một chút trong sự đa hình về độ dài đoạn giới hạn (restriction fragment length polymorphism - RFLP) chủ yếu do có nhiều đoạn chèn nhỏ (insertions) và một đoạn loại bỏ (deletion) lớn (khoảng 12 kbp) (Chen và ctv, 2002) Mark và ctv (2003) đã xác định được trên bản đồ di truyền những khác biệt giữa ba dòng WSSV: Dòng Thái Lan (WSSV – TH), dòng Trung Quốc (WSSV – CN) và dòng Đài Loan (WSSV – TW) Các dòng virus này có nucleotide tổng số giống nhau đến 99,32% Sự khác biệt chủ yếu là trên cùng một vùng gen tương ứng của 3 dòng có sự loại bỏ khoảng 13 kb ở dòng WSSV – TH, 1 kb ở dòng WSSV – CN và không có gì thay đổi ở dòng WSSV – TW Sự khác biệt thứ hai liên quan đến một vùng biến đổi di truyền khoảng 750 bp Tất cả những sai biệt khác > 2 bp giữa 3 dòng đều nằm ở những vùng lặp lại dọc theo

genome, chủ yếu ở những ORFs (trừ vùng đồng dạng hr1, hr3, hr8 và hr9)

Theo Dieu và ctv (2004), sự khác biệt nói trên đã đưa đến một giả thuyết là đã có một sự phân nhánh virus từ một dòng tổ tiên bắt nguồn từ eo biển Đài Loan đến Thái Lan nhưng cần tiến hành thêm nhiều phân tích khác biệt giữa nhiều dòng ở các vùng địa lý khác nữa mới khẳng định được giả thuyết Các nhà khoa học này đã phân tích RFLP tám dòng WSSV Việt Nam (VN), trong đó có 6 dòng thu từ bờ biển miền Trung và 2 dòng từ bờ biển miền Nam và cho thấy sự khác biệt trình tự ở các vị trí biến đổi đã được đề cập Những vị trí này được phân tích chi tiết bằng PCR, tạo dòng và đọc trình tự Tương ứng với dòng WSSV-TW, tất cả những dòng từ miền Trung đều mất 85 kb ở vùng biến đổi chính ORF23/24, trong khi đó những dòng từ miền Nam thì lại mất 115 hay 122 kb tương tự như sự loại bỏ 12 hay 132 kb ở WSSV-CN

và WSSV-TH Ở vùng biến đổi phụ ORF14/15, so với dòng WSSV-TH, tất cả các dòng Việt Nam đều mất đoạn với kích thước khác nhau Dữ liệu cho thấy các dòng VN và dòng WSSV-TH có cùng nguồn gốc từ WSSV-TW và WSSV-CN, và WSSV đã xâm nhập vào Việt Nam theo nhiều đường khác nhau

Vật chủ chính: P.monodon; P.japonicus; P.penicillatus; P.chinensis

Đã có nhiều báo cáo về nhóm vật chủ của virus gây hội chứng đốm trắng WSSV

 WSSV gây nhiễm trên các loài tôm He ở Châu Á như: Penaeus monodon, P japonicus, P merguiensis, P chinensis, P.semiculatus, P indicus, P penicillatus, Trachypenaeus cuvirostris, Metapenaeus ensis

(Lightner, 1996, 1997)

 WSSV hiện diện trên một số bộ phận cơ thể của một số loài cua :

Charypdis feriatus, C natator, Portunus pelagicus, P sanguilonentus (Kou và ctv, 1998), Scylla serrata (Chen và ctv, 2000)

 Qua sử dụng kỹ thuật PCR đã phát hiện có sự hiện diện của

WSBV trên các loài tôm: P monodon ; P japonicus; P penicillatus; P semiculatus; và Metapenaeusensis ( Lo và ctv, 1996)

 Một thí nghiệm về tính mẫn cảm đối với WSBV trên một số loài tôm và giáp xác khác của Rajendra và ctv (1999) đã kết luận, 5 loài tôm

biển ở vùng Đông Nam Ấn Độ: Penaeus monodon, P japonicus, P merguiensis, P semiculatus, P indicus, Metapenaeus monoceros, M

dobsoni; hai loài tôm nước ngọt: Macrobranchium rosenbergii và M idella; 4 loài cua: Sylla serrata, S tranquebarica, Metapograpus sp., Sesarma sp.; 3 loài tôm hùm: Panulirus homarus, P.ornatus, P polyphagus đều bị nhiễm WSBV sau khi cho tiêm hoặc cho ăn dịch

tôm hoặc tôm bị nhiễm đốm trắng

2.2.2.10 Cơ chế xâm nhiễm

Cơ quan đích của WSSV: WSSV xuất hiện ở hầu hết các mô hoặc cơ quan có nguồn gốc ngoại bì hoặc trung bì như biểu mô thành dạ dày, biểu mô dưới lớp vỏ cutin, mô liên kết, mang, buồng trứng, lõi dây thần kinh bụng, mô tạo máu, cơ quan lymphoid, các tế bào máu, tim (Woongteerasupaya và ctv, 1995; Lightner, 1996; Wang và ctv, 1999)

Tuy chưa có báo cáo về đường xâm nhập của WSSV vào tế bào nhưng các nhà khoa học đã xác định sự sao chép, trưởng thành và lắp ráp của virion xảy ra trong nhân Ở nhân, trong giai đoạn đầu của quá trình xâm nhiễm, xuất hiện những thể hình sợi, hình hạt (có thể là chất nền của virus), những cấu trúc giống như màng Sau đó có thể quan sát thấy những ống dài và rỗng Những ống nhỏ này vỡ ra thành từng mảnh nhỏ, hình thành nucleocapsid (Woongteerasupaya và ctv, 1995; Durand và ctv, 1997; Wang và ctv, 2000) Có hai giả thuyết về sự phát triển hình dạng WSSV Theo một số tác giả (Durand và ctv, 1997), trước khi phần lõi đi vào trong thì nucleocapsid đã được bao phủ bởi màng (envelop), để lại một khoảng hở Protein nhân (nucleopotein) dạng sợi chui vào trong capsid qua khoảng hở này Khi phần lõi hoàn tất, phần bao thu hẹp đầu hở và tạo thành đuôi của virion trưởng thành Trái lại, một số tác giả khác lại cho rằng nucleocapsid hoàn chỉnh được lắp ráp đầu tiên, sau đó mới được bao lại (Wang và ctv, 2000) Sau khi lắp ráp, virion trưởng thành có thể kết lại với nhau thành một dãy hoặc phân tán trong dịch nhân Làm thế nào WSSV virion rời khỏi tế bào chủ vẫn chưa được biết rõ nhưng sau khi virion phá vỡ tế bào nhiễm bệnh thoát ra ngoài, chúng tiếp tục xâm nhập vào các tế bào bên cạnh hoặc theo phân thải ra môi trường ngoài Tôm ăn phải virus tự do trong bùn ao và nước sẽ nhiễm bệnh (Chou và ctv, 1996; trích bởi Trần Thị Hoàng Dung, 2001)

2.2.2.11 Cơ chế truyền lan

Quá trình truyền lây xảy ra khi mầm bệnh được truyền từ nguồn bệnh (cá thể bệnh, yếu tố truyền lây, trực tiếp từ môi trường ngoài) vào cơ thể cá thể khỏe, lúc này cá thể đã bị nhiễm bệnh Mầm bệnh WSSV có thể truyền lan theo hai trục:

 Trục ngang: là con đường chủ yếu Từ nguồn nước, từ thức ăn, từ các giáp xác hoang dã trong ao, đặc biệt là do tôm khỏe ăn tôm chết do bị bệnh đốm trắng trong ao, đây là con đường lây lan rất nhanh gây chết tôm hàng loạt (Tookwinas, 1998)

Một số loài tôm hoang dã và giáp xác khác được xem là vật truyền lan gây bùng nổ bệnh đốm trắng trong ao nuôi khi chúng xâm nhập vào thông qua con đường thay nước (Limsuwan và ctv,1997)

Bằng xét nghiệm sinh học (bioassay) và mô học cho thấy cua, tôm nước ngọt, tôm hùm có thể đóng vai trò như là vật chủ mang hoặc chuyên chở mầm bệnh không triệu chứng (asymtomatic) Tôm hùm đóng vai trò chính như là vật chủ dự trữ đối với WSSV; nó có thể bị nhiễm từ phân chim, nước thải ra biển và có thể mang WSSV trong thời gian dài mà không bị bệnh, là nguồn lây nhiễm cho nguồn tôm bố mẹ tự nhiên (Rajendran và ctv, 1999)

Ngoài ra còn có những tác nhân khác như các loài vật ăn thịt như cá, chim, chó, mèo sẽ đưa mầm bệnh từ ao này sang ao khác làm lan tràn dịch bệnh, những tác động của con người qua thao tác trong quá trình nuôi

Sử dụng phương pháp lai DNA chỉ ra rằng ruột và mang tôm sú là đường xâm nhập của virus đốm trắng vào cơ quan tạo máu, mang là nơi sinh sản ra virus (Chang và ctv, 1996)

 Trục dọc: biểu hiện sự truyền bệnh từ bố mẹ sang con Tuy nhiên khả năng truyền theo trục dọc vẫn chưa được chứng minh mặc dù SEMBV đã được phát hiện trong một số giai đoạn trứng tôm khi quan sát dưới kính hiển vi điện tử (Tookwinas, 1998)

2.2.2.12 Triệu chứng, bệnh tích

Tôm bệnh có biểu hiện bỏ ăn, lờ đờ, kém hoạt động, thường có khuynh hướng cặp mé bờ, sau đó chết và chìm xuống đáy (Takahashi và ctv, 1994; Wang và ctv, 1998) Bên trong vỏ giáp xuất hiện những đốm trắng đường kính từ 0,5 – 2 mm, xuất hiện đầu tiên ở vỏ giáp và đốt bụng thứ V, VI Những đốm này chính là sự tích tụ calcite (Wang và ctv, 1996b), sự tạo thành chúng cần các tế bào biểu bì cutin bị nhiễm virus nặng (Chang và ctv, 1998) và sự bao bọc các sợi trong tế bào chất và các kênh trong biểu bì (Wang và ctv, 1999) Đốm trắng thường xuất hiện cùng với sự đổi màu thành tái hay đỏ hồng (Nakano và ctv, 1994) Tuy nhiên, những biểu hiện như xuất hiện đốm trắng và đổi màu cũng có thể xảy ra do điều kiện môi trường hay bệnh vi khuẩn (Charatchakool và ctv, 1995) Gan tụy trương, có màu trắng hoặc hơi vàng Tôm bệnh có dấu hiệu trương nhân trong tế bào bị nhiễm do tích tụ hạt virus (Chou và ctv, 1996; trích bởi Trần Thị Hoàng Dung)

Tỉ lệ tôm chết lên đến 80 – 100% trong vòng 7 – 10 ngày (Nakano và ctv, 1994)

Hình 2.7 Tôm nhiễm WSSV và tế bào nhiễm WSSV (Vlak., 2002)

(A) Tôm bị nhiễm WSSV

 Chẩn đoán chính xác, kịp thời, lập chương trình kiểm soát dịch bệnh đặc biệt là giai đoạn tôm mẫn cảm với WSSV

 Quản lý tốt ao nuôi để phòng bệnh:

+ Sử dụng biện pháp thay nước có kiểm soát

+ Mỗi trại phải có hệ thống xử lý nước riêng, nước phải được khử trùng trước khi vào ao nuôi

+ Chất lượng nước được duy trì ở điều kiện ổn định

+ Giảm các tác nhân gây stress trong ao nuôi: pH, DO, nhiệt độ, độ mặn, amonia và sản phẩm thải, dư thừa trong ao

+ Sử dụng một cách chọn lọc các chế phẩm vi sinh (probiotic) để tăng cường sức đề kháng của tôm đối với WSSV

+ Cung cấp đầy đủ chất dinh dưỡng, tăng sức đề kháng bằng vitamin

+ Phòng ngừa bệnh lây lan từ trại này sang trại khác

+ Loại trừ tôm, cua, ruốc xâm nhập vào ao nuôi (lưới lọc, lưới ngăn bờ ao)

+ Có ao trữ nước chiếm 20 - 30% ao nuôi, nước được trữ lắng 7

ngày trước khi dùng

+ Ngăn ngừa và kiểm soát sự lan truyền của bệnh trong cộng đồng

2.3 Các phương pháp chẩn đoán mầm bệnh WSSV trên giáp xác

Theo Hőstein (2000), mục tiêu chính trong việc phát hiện virus WSSV là nhằm khẳng định có xảy ra bệnh hay không và kiểm tra xem tôm bố mẹ và con giống có mang mầm bệnh hay không

 Để chẩn đoán có hay không có bệnh trong ao phải tiến hành phân tích mô học bằng cách nhuộm mô tôm bằng Hematoxylin và Eosin, sau đó xem dưới kính hiển vi (Hőstein, 2000) Nếu tôm bệnh sẽ quan sát được các thể vùi trong nhân bị trương to của các tế bào biểu mô cutin và tế bào mô liên kết (Lightner, 1996)

 Để khẳng định chẩn đoán và xác định tình trạng nhiễm WSSV của nguồn tôm bố mẹ và con giống nên dùng kĩ thuật PCR (Hőstein, 2000) Các kỹ thuật PCR đã được phát triển gồm 1-step, 2-step PCR (Lo và ctv, 1996), one-tube nested PCR (Lo và ctv, 1998)

Ngoài ra cũng có thể chẩn đoán bằng:

 Transmission eletron microscopy (TEM) Mặc dù WSSV có thể phát hiện được bằng phương pháp này nhưng kĩ thuật này chủ yếu dùng trong chẩn đoán khẳng định (Lightner, 1996)

 In situ DNA hybridisation (cho phép xác định WSSV khi không

có những dấu hiệu mô bệnh học – Chang và ctv, 1996): Xử lý và cố định mô theo phương pháp mô học truyền thống, lai và phát hiện virus WSSV bằng probe có đánh dấu, quan sát dưới kính hiển vi

 Western blot analysis (Nadala và ctv, 1997)  Dot blot (Nadala and Loh, 2000)

Ngoài những phương pháp xác định WSSV dựa trên vật liệu di truyền, các xét nghiệm dựa trên miễn dịch cũng được sử dụng, một trong số đó là phương pháp hóa mô miễn dịch Từ khi kháng thể đơn dòng nhận diện epitope trên vỏ virus hay trên capsid được sản xuất thành công và xuất hiện test kit hóa mô miễn dịch thương phẩm sử dụng kháng thể đơn dòng, kĩ thuật này càng phát huy được thế mạnh của nó về độ chính xác, độ nhạy và hiệu quả trong chẩn đoán mầm bệnh virus đốm trắng trên tôm Trong khoá luận này, dựa vào những điều kiện sẵn có, chúng tôi tiến hành ứng dụng hoá mô miễn dịch để chẩn đoán bệnh đốm trắng trên tôm sú

2.4 Sơ lƣợc về hoá mô miễn dịch (Immunohistochemmistry) 2.4.1 Lịch sử phát triển

Coons và cộng sự (1941) là những người đầu tiên đánh dấu kháng thể bằng chất nhuộm huỳnh quang và dùng chúng để xác định vị trí kháng nguyên trên mặt cắt mô Kĩ thuật hoá mô miễn dịch ngày càng phát triển, một số enzyme đã được dùng để đánh dấu kháng thể như peroxidase (Nakane và Pierce, 1966) và alkaline phosphatase (Mason và Sammons, 1978) Keo vàng được phát hiện bởi Faulk và Taylor (1971) và

có thể sử dụng để phát hiện phản ứng hoá mô miễn dịch bằng cả kính hiển vi quang học lẫn kính hiển vi điện tử Những chất đánh dấu khác bao gồm những phân tử phóng xạ và phản ứng miễn dịch được nhận biết bằng phóng xạ tự ghi (autoradiography)

Ngày nay hoá mô miễn dịch đã trở thành một kĩ thuật chủ yếu và được sử dụng rộng rãi trong nhiều phòng thí nghiệm, đặc biệt là trong y học (chẩn đoán lâm sàng) (IHC world, 2005)

2.4.2 Nguyên lý

Theo IHC world (2005) hoá mô miễn dịch là phương pháp định vị kháng nguyên trên mặt cắt của mô bằng cách sử dụng kháng thể đã được đánh dấu như là thuốc thử đặc hiệu Phương pháp này dựa trên cơ sở tương tác đặc hiệu giữa kháng nguyên – kháng thể có thể nhìn thấy qua các chất nhuộm hiện màu là enzyme khi chúng tác dụng với cơ chất

2.4.3 Kháng nguyên (antigen hay immunogen)

Theo Stites và ctv (1987) kháng nguyên là những chất khi đưa vào cơ thể một động vật có thể kích ứng một phản ứng miễn dịch mà ta có thể nhận biết được (miễn dịch thể dịch, miễn dịch tế bào, hay thường là cả hai loại)

Bản chất hóa học của kháng nguyên thường là những đại phân tử protein Polysaccharide, các polypeptide tổng hợp và những polypeptide khác cũng là kháng nguyên trong những điều kiện thích hợp (Stites và ctv, 1987)

Những phân tử lớn là những kháng nguyên mạnh nhưng chỉ có một số vùng giới hạn trên những phân tử đó tham gia gắn kết thật sự với vị trí kết hợp trên kháng thể Những vùng này quyết định tính đặc hiệu của phản ứng kháng nguyên – kháng thể và được gọi là vùng quyết định (antigen determinant) hay vùng phản ứng Epitope là dạng đơn giản nhất của vùng phản ứng trong phân tử kháng nguyên phức tạp Lượng vùng phản ứng trên kháng nguyên thay đổi tùy theo kích thước và tính phức tạp của kháng nguyên (Stites và ctv, 1987)

2.4.4 Kháng thể (antibody)

Theo Boenisch và ctv (2002) kháng thể thuộc nhóm protein gọi là globulin miễn dịch (immunoglobulin – Ig) Globulin miễn dịch gồm 5 nhóm chính, được xếp theo thứ tự giảm dần trong huyết thanh: IgG, IgA, IgM, IgD và IgE Trong đó, IgG và IgM thường được dùng trong hóa mô miễn dịch

Có hai loại kháng thể (Hình 2.8)

Hình 2.8 Kháng thể đa dòng và kháng thể đơn dòng (Boenisch và ctv, 2002)

A: Kháng thể đa dòng gắn với các epitope khác nhau trên kháng nguyên B: Kháng thể đơn dòng phản ứng với một epitope đặc hiệu trên kháng nguyên

 Kháng thể đa dòng (polyclonal antibodies): Được tạo ra bởi

những tế bào plasma khác nhau nên thường không đồng nhất về hóa miễn dịch, chúng phản ứng với những epitopes khác nhau trên kháng nguyên đã kích thích tạo ra chúng Động vật đáp ứng miễn dịch và tạo ra kháng huyết thanh bao gồm nhiều loại kháng thể đặc hiệu và không đặc hiệu Kháng thể đa dòng dễ sản xuất hơn kháng thể đơn dòng nhưng có khuyết điểm là ngay cả sau khi tinh sạch, kháng thể đa dòng vẫn có thể chứa những kháng thể phản ứng không đặc hiệu với kháng nguyên

 Kháng thể đơn dòng (monoclonal antibody): Được tạo ra từ một

dòng tế bào plasma nên đồng nhất về hoá miễn dịch, chúng phản ứng với một epitope nhất định trên kháng nguyên đã kích thích tạo ra chúng Ưu điểm của kháng thể đơn dòng là độ đồng nhất cao, rất tinh khiết và đặc hiệu

Nghiên cứu ứng dụng kháng thể đơn dòng để phát hiện virus WSSV trên tôm đã được phát triển bởi Poulos và ctv (2001) Chaivisuchangkura và ctv (2004), phát triển ứng dụng kháng thể đơn dòng kháng protein envelop VP28 để phát hiện virus WSSV trên tôm nhiễm bệnh Phương pháp tạo ra kháng thể này như sau:

 Một phần của gen VP28 (VP28F118) được clone vào vector

 Chuyển vector vào E Coli, mục đích là tạo ra một protein

(rVP28F118) thiếu vùng liên màng tận cùng bằng đầu N

 Protein VP28F118 được tinh sạch bằng SDS-FAGE và dùng để gây miễn dịch trên chuột Swiss thu kháng huyết thanh

 Chọn một dòng tế bào plasma từ kháng huyết thanh thu được cho lai với tế bào u tuỷ bằng phương pháp cell fusion Tế bào lai (hybridoma) tạo thành được dòng hoá Thu kháng thể đơn dòng kháng protein VP28 từ dòng tế bào lai này

Trong bài khóa luận chúng tôi dùng kháng thể đơn dòng kháng protein VP28 trong phương pháp hóa mô miễn dịch để phát hiện mầm bệnh virus WSSV trên tôm sú

Penaeus monodon

Các yếu tố ảnh hưởng đến kháng thể

 Độ pha loãng kháng thể: tùy thuộc vào phương pháp, thời gian ủ

và nhiệt độ Nếu không có những thông tin từ nhà cung cấp kháng thể ta phải chuẩn độ để xác định nồng độ thích hợp nhất cho các chất tham gia phản ứng hóa mô miễn dịch Kháng thể được pha loãng ở nồng độ thích hợp và không đổi sẽ nâng cao chất lượng nhuộm Người ta thường xác định nồng độ thích hợp bằng cách đầu tiên chọn một thời gian ủ cố

định, sau đó thử nghiệm với một lượng nhỏ kháng thể ứng với một chuỗi các nồng độ pha loãng thử nghiệm Kháng thể đơn dòng có khoảng pI và cấu tạo phân tử giới hạn hơn kháng thể đa dòng nên chúng nhạy cảm hơn với pH và ion trong dung dịch đệm Vì vậy để ước lượng kháng thể đơn dòng cần chuẩn độ ở pH 6,0 và 8,6 và không có NaCl Độ pha loãng cao nhất và pH duy trì phản ứng miễn dịch mạnh nhất được gọi là độ pha loãng tối ưu (Boenisch và ctv, 2002)

 Thời gian ủ: thường trái ngược với độ chuẩn của kháng thể, độ

chuẩn càng cao thì thời gian ủ để có kết quả tối ưu càng ngắn Tuy nhiên trên thực tế thường thì người ta đưa ra một thời gian ủ thích hợp trước khi xác định độ pha loãng tối ưu Nồng độ kháng thể đặc hiệu càng cao thì thời gian ủ càng ngắn (Boenisch và ctv, 2002)

 Nhiệt độ ủ: Trạng thái cân bằng trong phản ứng kháng nguyên –

kháng thể đạt được nhanh ở 370C Với nhiệt độ ủ khá cao ta có thể rút ngắn thời gian ủ và tăng độ pha loãng kháng thể Tuy nhiên không thể biết được là nhiệt độ chỉ thúc đẩy phản ứng đặc hiệu kháng nguyên – kháng thể hay kích ứng tất cả những phản ứng nền

Để phát triển kĩ thuật hóa mô miễn dịch chẩn đoán mầm bệnh virus đốm trắng trên tôm sú trong điều kiện phòng thí nghiệm ở Việt Nam chúng tôi chọn thử nghiệm một chỉ tiêu quan trọng quyết định kết quả nhuộm là độ pha loãng kháng thể và 1 yếu tố phụ là nồng độ DAB

2.4.5 Các phương pháp nhuộm

Có nhiều phương pháp hoá mô miễn dịch có thể dùng để định vị kháng nguyên việc lựa chọn phương pháp thích hợp dựa trên các thông số như loại mẫu vật và độ nhạy yêu cầu (IHC world, 2005)

Hình 2.9 Các phương pháp nhuộm

A: Phương pháp trực tiếp (direct method)

B: Phương pháp gián tiếp hai bước (two-step indirect method) C: Phương pháp gián tiếp ba bước (three-step indirect method) D: Kĩ thuật phức hợp miễn dịch enzyme tan (APAAP)

E: Kỹ thuật (strept)avidin-biotin (ABC)

F: Kỹ thuật (strept)avidin-biotin (LAB hay LSAB)

A Trực tiếp (direct method): Đây là kỹ thuật cổ điển nhất Quá trình thực hiện

như sau: Một kháng thể sơ cấp được đánh dấu enzyme phản ứng với kháng nguyên trên mô, sau đó sử dụng cơ chất tạo màu để phát hiện phản ứng Vì phương pháp này chỉ dùng một kháng thể nên tiết kiệm thời gian và rất ít phản ứng không đặc hiệu Tuy nhiên cũng vì phản ứng chỉ gồm một kháng thể đánh dấu nên tín hiệu thu được rất ít và không đủ nhạy để đáp ứng nhu cầu ngày nay (Hình 2.8.A) ( Boenisch và ctv, 2002)

Enzyme Khángnguyên

Kháng thể 1 Kháng thể 2

B Gián tiếp hai bước (two-step indirect method): Đầu tiên cho một kháng thể

sơ cấp kết hợp với kháng nguyên, sau đó bổ sung một kháng thể thứ cấp đánh dấu enzyme kháng lại kháng thể sơ cấp (bây giờ là kháng nguyên), và cuối cùng bổ sung cơ chất tạo màu Phương pháp này linh hoạt hơn phương pháp trực tiếp vì nhiều loại kháng thể sơ cấp khác nhau từ cùng một loài có thể được sử dụng với cùng kháng thể thứ cấp cộng hợp Quy trình này cũng nhạy hơn nhuộm trực tiếp vì nhiều kháng thể thứ cấp sẽ phản ứng với nhiều epitope khác nhau trên kháng thể sơ cấp và khuyếch đại tín hiệu lên nhiều lần vì nhiều enzyme được cố định trên mỗi vị trí đích (Hình 2.8.B) (Boenisch và ctv, 2002)

Thông thường, kháng thể sơ cấp là kháng thể đơn dòng và kháng thể thứ cấp là kháng thể đa dòng

C Gián tiếp ba bước (three-step indirect method): Trong phương pháp này

người ta bổ sung thêm 1 kháng thể đánh dấu enzyme nữa vào phương pháp B Hai kháng thể thứ cấp được bố trí theo thứ tự như hình 2.8.C Ví dụ như nếu kháng thể thứ cấp thứ 1 tạo ra từ dê, thì kháng thể thứ cấp thứ 2 phải đặc hiệu với globulin miễn dịch của dê Cả hai kháng thể thứ cấp này phải được đánh dấu với cùng enzyme Việc bổ sung thêm một lớp kháng thể thứ 3 là để khuyếch đại tín hiệu Phương pháp này đặc biệt hữu dụng khi nhuộm những kháng nguyên có ít epitope (Boenisch và ctv, 2002)

D Kĩ thuật phức hợp miễn dịch enzyme tan: còn được gọi là phương pháp

không đánh dấu kháng nguyên Quá trình nhuộm cần có kháng thể sơ cấp, phức hợp miễn dịch hòa tan enzyme – kháng thể kháng enzyme và dung dịch cơ chất Phức hợp miễn dịch được tạo ra bằng cách cho enzyme phản ứng với kháng thể của nó, loại bỏ kết tủa, thu dịch hòa tan Kháng thể sơ cấp và kháng thể của enzyme phải tạo ra từ cùng một loài Kháng thể thứ cấp phải trực tiếp kháng lại globulin miễn dịch của loài đó

Trước tiên cho kháng thể sơ cấp và phức hợp enzyme – kháng thể kháng enzyme phản ứng với kháng nguyên, sau đó bổ sung kháng thể thứ cấp Kháng thể thứ cấp phải được bổ sung với một lượng thừa để một vị trí Fab sẽ gắn với kháng thể sơ cấp, vị trí còn lại gắn với kháng thể trong phức hợp miễn dịch của enzyme

Kĩ thuật này được đặt tên theo phức hợp miễn dịch enzyme sử dụng.Ví dụ: Phương pháp PAP (peroxidase anti peroxidase) sử dụng phức hợp peroxidase – kháng peroxidase, APAAP (alkaline phosphatase anti alkaline phosphatase) sử dụng phức hợp alkaline phosphatase – kháng alkaline phosphatase Phức hợp PAP gồm 3 phân tử peroxidase và 2 kháng thể, phức hợp APAAP gồm 2 phân tử alkaline phosphatase và 1 kháng thể (Hình 2.8.D) (Boenisch và ctv, 2002)

E Kỹ thuật (strept)avidin-biotin: Hầu hết những phương pháp nhuộm ngày nay

đều dựa trên ái lực lớn giữa (strept)avidin (Streptomyces avidinii ) và avidin (trứng gà)

với biotin Kỹ thuật này có độ nhạy và khả năng khuyếch đại rất cao Thành phần cơ bản gồm kháng thể sơ cấp kháng kháng nguyên, kháng thể thứ cấp có gắn biotin kháng kháng thể sơ cấp, phức hợp enzyme-(strept)avidin-biotin (kỹ thuật avidin-biotin complex – ABC) hay streptavidin có đánh dấu enzyme (kỹ thuật labelled streptavidin-biotin – LSAB), và cuối cùng là dung dịch cơ chất Enzyme đánh dấu thường được sử dụng nhất là horseradish peroxidase và alkaline phosphatase Phương pháp LSAB nhạy hơn phương pháp ABC (Hình 2.8.E, F) (Boenisch và ctv, 2002)

Để đáp ứng mục tiêu là chẩn đoán mầm bệnh virus đốm trắng trên tôm sú, trong điều kiện của phòng thí nghiệm, chúng tôi sử dụng phương pháp ABC với kháng thể thứ cấp gắn biotin, phức hợp streptavidin-biotinylated horseradish peroxidase và cơ chất là 3,3-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB)

2.4.6 Ứng dụng phương pháp trong chẩn đoán mầm bệnh trên động vật nuôi thủy sản

Kể từ khi ra đời phương pháp IHC đã chứng tỏ tính ưu việt trong chẩn đoán bệnh, các thí nghiệm khẳng định trong nhân y (chẩn đoán bệnh ung thư vú, ung thư phổi) (Hayat, 2004), thú y và trong thủy sản hay ứng dụng trên lĩnh vực nghiên cứu cơ

bản về hệ miễn dịch (dùng IHC để phát hiện kháng thể kháng Enteromyxum scophthalmi (Myxozoa) trong cá bơn Scophthalmus maximus L (Sitja-Bobadilla và

ctv, 2005)

Đối với thủy sản, xác định nhanh mầm bệnh quyết định tính hiệu quả trong kiểm soát bệnh Phát hiện mầm bệnh không những quan trọng với cá nhiễm bệnh mà còn với môi trường (giữa thời kì thu hoạch và tái xuống giống) và như là một hệ thống

cảnh báo sớm Ứng dụng probe kháng thể và probe/primer DNA đã có những ảnh hưởng quan trọng trong phát triển những phương pháp chẩn đoán nhanh mới (Hiney và Smith, 1998)

Phương pháp IHC và một số phương pháp dựa trên kháng thể khác như miễn dịch huỳnh quang trực tiếp (flourescence antibody tests – FAT), gián tiếp (indirect flourescence antibody tests – IFAT), ELISA (enzyme link immunosorbent assays)

được ứng dụng trên nhiều dạng mầm bệnh khác nhau gồm vi khuẩn (Aeromonas salmonicida, Aeromonas hydrophila, Photobacterium damsela subspecies piscicida, Renibacterium salmoninarum, Mycobacterium spp., Vibrio anguillarum và Flavobacterium psychrophilum; (Adams và Thompson, 1990; Adams, 1995;

Bakopoulos và ctv., 1997; Adams và ctv., 1996), kí sinh trùng (Morris và ctv., 1997),

virus (infectious salmon anaemia virus), và rickettsia trên cá Piscirickettsia salmonis

(Alday-sanz và ctv., 1994) Trong một số trường hợp các phương pháp dựa trên kháng thể rất hiệu quả và đạt được độ nhạy, độ đặc hiệu cần thiết Tuy nhiên trong những trường hợp khác, như với mẫu nước và bệnh sau lâm sàng, cần có những phương pháp

dựa trên DNA (PCR, in situ hybridisation) với độ nhạy cao hơn

Đối với tôm (tôm nước mặn và tôm nước ngọt), phương pháp IHC cũng chứng tỏ tính hiệu quả khi được ứng dụng trong chẩn đoán các loại mầm bệnh, đặc biệt là khi sử dụng kháng thể đơn dòng (monoclonal antibodies – mAbs)

 Với mầm bệnh virus, IHC dùng trong chẩn đoán mầm bệnh virus đốm trắng WSSV với kháng thể đơn dòng và kháng thể đa dòng kháng protein VP28 (Liu và ctv, 2002; Poulos và ctv, 2001; Yoganandhan và ctv, 2004), phát hiện và phân biệt các dạng khác nhau của phức hợp virus đầu vàng (Yellow head complex virus – YHV) bằng kháng thể đơn dòng V – 3 – 2B, Y – 18, Y – 19 (Soowannayan và ctv, 2003), virus hội chứng Taura (Taura syndrome virus – TSV) với kháng thể đơn dòng TSV – 1A1 (Anil và ctv, 2002; OIE, 2003)

 Với mầm bệnh vi khuẩn nhiều kháng thể đơn dòng kháng các loại vi khuẩn (15 kháng thể đơn dòng kháng một dòng vi khuẩn nguy hiểm

là Vibrio harveyi 639 – Phianphak và ctv, 2005) đã được xác định nhằm

phát triển kĩ thuật chẩn đoán dựa trên miễn dịch như IHC

PHẦN 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

A Thời gian thực hiện đề tài: 3/2005 – 8/2005 B Địa điểm thực hiện:

Phòng Mô Học - Trung Tâm Quốc Gia Quan Trắc Cảnh Báo Môi Trường và Phòng Ngừa Dịch Bệnh Thuỷ Sản Khu Vực Nam Bộ - Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thuỷ Sản II (116 Nguyễn Đình Chiểu – Q.1 – Thành phố Hồ Chí Minh)

3.2 Vật liệu

3.2.1 Mẫu xét nghiệm:

- 10 mẫu tôm sú thương phẩm thu từ các ao nuôi tại tỉnh Cà Mau và tỉnh Sóc Trăng (nội dung 1)

Bảng 3.1 Các mẫu thử nghiệm cho nội dung 1

45D 45P 101 53 103

97 50 98 453

99

Sóc Trăng Sóc Trăng Cà Mau Sóc Trăng

Cà Mau Cà Mau Sóc Trăng

Cà Mau Cà Mau Cà Mau

30 ngày tuổi 30 ngày tuổi 3 tháng tuổi 45 ngày tuổi 3 tháng tuổi 2 tháng tuổi 28 ngày tuổi 2 tháng tuổi 50 ngày tuổi 2 tháng tuổi

10/4/2005 10/4/2005 21/1/2005 10/4/2005 21/1/2005 21/1/2005 10/4/2005 21/1/2005 17/3/2004 21/1/2005

- 25 mẫu tôm sú post-larvae chọn ngẫu nhiên từ 200 mẫu thu từ các trại giống ở khu vực miền Trung (Đà Nẳng, Phan Rang, Bình Định), miền Nam (Vũng Tàu, Cà Mau) 30 mẫu tôm sú thương phẩm chọn ngẫu nhiên từ 200 mẫu