Bài viết trình bày kết quả nghiên cứu về biểu hiện CD55, CD59 mạnh và ổn định trên quần thể hồng cầu, bạch cầu hạt và bạch cầu mono, nhưng rất yếu và dao động trên quần thể bạch cầu lympho. Giá trị này có thể được sử dụng làm tham số tham chiếu cho những nghiên cứu tiếp theo.
TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2014 KHẢO SÁT ĐẶC ĐIỂM BIỂU HIỆN DẤU ẤN CD55 VÀ CD59 TRÊN QUẦN THỂ HỒNG CẦU VÀ BẠCH CẦU Ở 30 NGƯỜI BÌNH THƯỜNG Lê Xn Hải*; Nguyễn Lĩnh Tồn** TĨM TẮT иi huyết sắc tố kịch phát ban đêm (Paroxymal Noctural Haemoglobinurea, PNH) bệnh gặp, đặc trưng tình trạng thiếu máu Nghiên cứu tiến hành khảo sát dấu ấn CD55/CD59 tế bào (TB) hồng cầu bạch cầu người khỏe mạnh kỹ thuật đếm TB dòng chảy Kết cho thấy biểu CD55, CD59 mạnh ổn định quần thể hồng cầu, bạch cầu hạt bạch cầu mono, yếu dao động quần thể bạch cầu lympho Giá trị sử dụng làm tham số tham chiếu cho nghiên cứu * Từ khóa: Đái huyết sắc tố kịch phát; Dấu ấn CD55 CD59; Hồng cầu; Bạch cầu Chracteristics of CD55, CD59 on Erythrocytes and White Blood Cells in Healthy Blood Donors Summary The paroxysmal nocturnal haemoglobinurea (PNH) is a rare type of acquired hemolytic anemia In this study, we analyzed the CD55 and CD59 markers of erythrocyte and white blood cell in healthy blood donors by flow cytometry analysis The results shown that strong and stable expression of CD55 and CD59 were observed on erythrocytes, monocytes, and neutrophils In contract, weekly and unstable expression on lymphocytes of peripheral blood cells These results may be used for the data reference for the further studies * Key words: Paroxysmal nocturnal haemoglobinurea; CD55; CD59; Erythrocyte; White blood cell ĐẶT VẤN ĐỀ Đái huyết sắc tố kịch phát (ĐHSTKP) ban đêm bệnh gặp, đặc trưng tình trạng thiếu máu, tan máu nội mạch, giảm sinh tủy, khuynh hướng d tắc mạch nhi m tr ng Bệnh đột biến TB gốc tạo máu, gây thiếu hụt protein gắn màng CD55, CD59… có nhiệm vụ ngăn cản bổ thể cơng màng TB Do vậy, bổ thể d dàng cơng làm tan hồng cầu Bệnh mắc lứa tuổi, tỷ lệ nam nữ [1, 3] Tỷ lệ tử vong phụ thuộc * Viện Huyết học - Truyền máu Trung ương ** Học viện Quân y Người phản hồi (Corresponding): Lê Xuân Hải (hailexuan@yahoo.com) Ngày nhận bài: 10/09/2014; Ngày phản biện đánh giá bi bỏo: 18/11/2014 Ngày báo đ-ợc đăng: 27/11/2014 25 TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2014 vào mức độ tan máu, giảm sinh tủy biến chứng tắc mạch 1, 2, Hiện nay, phân tích CD55, CD59 hồng cầu kỹ thuật TB dòng chảy tiêu chuẩn vàng để chẩn đoán ĐHSTKP ban đêm 1, Các hướng d n đ u thống ngư ng quần thể hồng cầu có thiếu hụt CD55 và/hoặc CD59 có giá trị chẩn đoán ĐHSTKP ban đêm 1, 2, Tuy nhiên, số trường hợp truy n máu, theo d i tiến triển bệnh sau gh p TB gốc tạo máu, phân tích CD55, CD59 hồng cầu không th c s tốt đời sống hồng cầu khoảng 120 ngày nên kết bị ảnh hưởng hồng cầu truy n vào ì vậy, nhi u tác giả đ phân tích CD55, CD59 bạch cầu để bổ trợ cho phân tích hồng cầu chẩn đốn theo d i §HSTKP ban đêm 4, Tuy nhiên, việc sử dụng quần thể TB ngư ng phát thiếu hụt có giá trị chẩn đốn, u nghiên cứu chưa có s thống Để áp dụng phân tích CD55/CD59 bạch cầu, chúng tơi d ng kỹ thuật TB dòng chảy phân tích CD55, CD59 b mặt hồng cầu bạch cầu người khỏe mạnh bình thường với mục đích: tìm quần thể TB có giá trị chẩn đốn ĐHSTKP ban đêm ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu 30 m u máu ngoại vi (2 ml m u, chống đông EDTA) từ người hiến máu tình nguyện iện Huyết học - Truy n máu Trung ương tháng - 2013 Loại trừ lấy m u từ người không 26 đủ tiêu chuẩn sức khỏe để hiến máu theo quy định Bộ Y tế * Hóa chất trang thiết bị: - Các kháng thể đơn dòng CD45-PC5, CD55-PE, CD59-FITC (Beckman Coulter, Mỹ); nước muối sinh lý; dung dịch ly giải hồng cầu (Beckton Dickinson) - Máy đếm TB dòng chảy Navious (Beckman Coulter, Mỹ) Phư ng ph p nghiên cứu * m u: Lấy ml máu t nh mạch, chống đông EDTA từ người khỏe mạnh tham gia hiến máu tình nguyện Th c x t nghiệm sớm 12 sau lấy máu * Khảo sát biểu CD55, CD59 quần thể TB hồng cầu bạch cầu máu ngoại vi b ng thu t tế TB d ng chảy: - Phân tích CD55, CD59 hồng cầu: pha lo ng máu toàn phần 100 lần nước muối sinh lý Ủ 100 ul máu pha lo ng với 20 µl anti CD55-PE 20 µl antiCD59-FITC 20 phút nhiệt độ phòng, tránh ánh sáng Sau ủ, thêm ml dung dịch PBS phân tích CD55, CD59 hồng cầu máy đếm TB dòng chảy - Phân tích CD55, CD59 bạch cầu: phân lập bạch cầu phương pháp ly giải hồng cầu Ly giải 100 µl máu toàn phần ml dung dịch ly giải hồng cầu Sau ly giải, ly tâm loại bỏ dịch (chứa tiểu cầu xác hồng cầu), giữ tái huy n dịch phần cặn bạch cầu 100 µl nước muối sinh lý Ủ huy n dịch bạch cầu với 20 µl anti-CD55-PE, 20 µl anti-CD59-FITC 20 µl anti-CD45-PC5 20 phút nhiệt độ phòng, tránh ánh sáng Sau ủ, rửa lần nước muối TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2014 sinh lý để loại bỏ kháng thể thừa, b ml nước muối sinh lý, trộn đ u đem phân tích CD55, CD59 bạch cầu máy đếm TB dòng chảy - Xử lý số liệu thuật tốn thống kê y học với phần m m Excel 2007 sát 30 người bình thường, chúng tơi thấy khơng có trường hợp có mức thiếu hụt CD55, CD59 < ì vậy, chúng tơi cho mức ngư ng với hồng cầu ph hợp KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN Đặc điểm đối tượng nghiên cứu * Đặc điểm giới: nam: 13 BN (43,3%); nữ: 17 BN (56,7 ) * Đặc điểm tuổi: Tuổi trung bình: 24,8; tuổi nhỏ nhất: 19; tuổi lớn nhất: 31 Nghiên cứu sử dụng m u máu 30 người hiến máu tình nguyện khơng phân biệt nam nữ, độ tuổi trẻ (19 - 31 tuổi, trung bình 24,8 tuổi) ì vậy, số liệu thu tương đối đại diện cho hai giới lứa tuổi tương đối trẻ CD55-PE Đặc điểm biểu CD5 CD59 c c quần thể TB m u ngoại vi người bình thường Bảng 1: Đặc điểm biểu CD55 CD59 hồng cầu người bình thường (n = 30) CD59 Trung bình SD Min - Max Trung bình SD Min - Max 97,65 1,52 95,4 - 100 97,34 1,30 95,1 - 100 Khảo sát 30 m u máu bình thường thấy CD55 CD59 ln dương tính mức cao CD55 mức 95,4 - 100 (trung bình 97,65 ), CD59 mức 95,1 - 100% (trung bình 97,34 ) Các hướng d n chẩn đoán ĐHSTKP ban đêm lấy mức quần thể hồng cầu có thiếu hụt CD55/CD59 làm tiêu chuẩn vàng cho chẩn đoán Khảo 27 CD59-FITC H nh : Biểu CD55, CD59 quần thể hồng cầu người bình thường, mức độ dương tính CD55 CD59 đ u > 95% TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2014 Bảng : Đặc điểm biểu CD55 CD59 bạch cầu người bình thường (n = 30) Trung bình SD Min - Max Trung bình SD Min - Max Bạch cầu hạt 98,24 1,49 95,8 - 100 98,25 1,28 96,2 - 100 Bạch cầu mono 96,24 2,99 91,2 - 99,8 97,16 2.81 90,8 - 99,6 Bạch cầu lympho 32,84 11,00 17,5 - 52,7 32,77 11,92 20,8 - 56,7 Biểu CD55, CD59 bạch cầu quần thể bạch cầu mono, không thấy khác quần thể bạch cầu trường hợp có biểu thiếu hụt hạt trung tính, bạch cầu mono bạch CD55 CD59 cầu lympho Biểu CD55, CD59 mạnh thấp 91,2 , CD59 thấp 90,8%) r Tuy nhiên, biểu CD55, CD59 quần thể bạch cầu lympho người bình thường thay đổi, 30 người đ u có mức thiếu hụt CD55, CD59 thấp 47,3 43,3 Mức độ thiếu hụt CD55, CD59 lên tới 80 Quần thể TB d ng để chẩn đoán ngư ng thiếu hụt CD55, CD59 có ý ngh a chẩn đốn ĐHSTKP ban đêm phân tích CD55, CD59 bạch cầu chưa thống hướng d n chẩn đoán ĐHSTKP ban đêm ới nghiên cứu này, chúng tơi đ xuất phân tích CD55, CD59 bạch cầu nên phân tích quần thể bạch cầu hạt bạch cầu mono, không d ng với quần thể bạch cầu lympho ngư ng thiếu hụt, CD55, CD59 có ý ngh a chẩn đốn ĐHSTKP ban đêm, nghiên cứu đ xuất với quần thể hồng cầu bạch cầu hạt, 10 với quần thể bạch cầu mono ràng quần thể bạch cầu hạt trung tính (98,24 1,49 98,25 1,28 ) bạch cầu mono (96,24 2,99 97,16 2,31 ), bộc lộ yếu quần thể bạch cầu lympho (32,84 11,00 32,77 11,92 ) Qua khảo sát 30 người bình thường khỏe mạnh chúng tơi thấy, mức độ biểu CD55, CD59 quần thể bạch cầu hạt bạch cầu mono cao đồng Đối với quần thể bạch cầu hạt, không thấy trường hợp có biểu thiếu hụt CD55 CD59 (biểu CD55 thấp 95,8 , CD59 thấp 96,2 ) Đối với 28 10 (biểu CD55 TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2014 H nh : Biểu CD55, CD59 quần thể bạch cầu người bình thường Trên đồ thị chia v ng, khơng có biểu thiếu hụt CD55, CD59 quần thể bạch cầu hạt trung tính (đỏ) bạch cầu mono (xanh lục), thiếu hụt r CD55 CD59 quần thể bạch cầu lympho (xanh lam) Nếu có, quần thể thiếu hụt CD55 nằm phía bên trái trục tung, quần thể thiếu hụt CD59 nằm bên trục hoành đồ thị v ng KẾT LUẬN Khảo sát biểu CD55, CD59 30 người hiến máu khỏe mạnh, thấy: - Biểu CD55, CD59 mạnh ổn định quần thể hồng cầu, bạch cầu hạt bạch cầu mono, 29 yếu dao động quần thể bạch cầu lympho - Các quần thể TB thích hợp d ng phân tích thiếu hụt CD55, CD59 để chẩn đoán ĐHSTKP ban đêm là: hồng cầu, bạch cầu hạt bạch cầu mono Không d ng quần thể bạch cầu lympho TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2014 - Đ xuất ngư ng chẩn đốn ĐHSTKP ban đêm có thiếu hụt CD55, CD59 > 5% với quần thể hồng cầu quần thể bạch cầu hạt, 10 với quần thể bạch cầu mono TÀI LIỆU THAM KHẢO Schubert J, Alvarado M, Uciechowski P et al Diagnosis of paroxysmal nocturnal haemoglobinuria using immunophenotyping of peripheral blood cells Br J Haematol 1991, 79, pp.487-492 Richards SJ, Rawstron AC, Hillmen P Application of flow cytometry to the diagnosis of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria Cytometry 2000, 42, pp.223-233 Moyo VM, Mukina GL, Barrett ES, Brodsky RA Natural history of paroxysmal nocturnal haemoglobinuria using modern diagnostic assays Br J Haematol 2004, 126, pp.133-138 Cherian S, Moore J, Bantly A, Vergilio JA, Klein P, Luger S et al Flow-cytometric analysis of peripheral blood neutrophils: a simple, objective, independent 30 and potentially clinically useful assay to facilitate the diagnosis of myelodysplastic syndromes Am J Hematol 2005, 79, pp.243-245 Stachurski D, Smith BR, Pozdnyakova O, Andersen M, Xiao Z, Raza A et al Flow cytometric analysis of myelomonocytic cells by a pattern recognition approach is sensitive and specific in diagnosing myelodysplastic syndrome and related marrow diseases: emphasis on a global evaluation and recognition of diagnostic pitfalls Leuk Res 2008, 32, pp.215-224 Borowitz MJ, Craig FE, Digiuseppe JA, Illingworth AJ, Rosse W, Sutherland DR, Wittwer CT, Richards SJ Cytometry Society Guidelines for diagnosis and mornitoring of Paroxysmal Nocturnal Hemoglobinuria and related disorders by flow cytometry Cytometry Part B (Clinical cytometry) 2010, 78B, pp.211-230 TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 9-2014 31 ... đối trẻ CD55- PE Đặc điểm biểu CD5 CD59 c c quần thể TB m u ngoại vi người bình thường Bảng 1: Đặc điểm biểu CD55 CD59 hồng cầu người bình thường (n = 30) CD59 Trung bình SD Min - Max Trung bình. .. trung tính, bạch cầu mono bạch CD55 CD59 cầu lympho Biểu CD55, CD59 mạnh thấp 91,2 , CD59 thấp 90,8%) r Tuy nhiên, biểu CD55, CD59 quần thể bạch cầu lympho người bình thường thay đổi, 30 người đ... lấy mức quần thể hồng cầu có thiếu hụt CD55/ CD59 làm tiêu chuẩn vàng cho chẩn đoán Khảo 27 CD59- FITC H nh : Biểu CD55, CD59 quần thể hồng cầu người bình thường, mức độ dương tính CD55 CD59 đ u