Tình hình nghiên cứu và mục tiêu của đề tài trình bày về việc ứng dụng các phương pháp HMMD và FISH xác định tình trạng HER2/ung thư vú nhằm đưa ra kết quả chính xác nhất để bệnh nhân nhận được phác đồ điều trị thích hợp nhất. Mời các bạn cùng tham khảo bài viết để nắm rõ nội dung chi tiết.
Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 SO SÁNH PHƯƠNG PHÁP HĨA MƠ MIỄN DỊCH VÀ LAI TẠI CHỖ HUỲNH QUANG ĐÁNH GIÁ HER2 TRONG UNG THU VÚ Đoàn Thị Phương Thảo*, Hứa Thị Ngọc Hà*, Phan Đặng Anh Thư, Nguyễn Thị Hồng Nguyệt*, Lý Thanh Thiện*, Đặng Hồng Minh* TĨM TẮT Giới thiệu: Ứng dụng phương pháp HMMD FISH xác định tình trạng HER2/ ung thư vú nhằm đưa kết xác để bệnh nhân nhận phác đồ điều trị thích hợp Đối tượng phương pháp nghiên cứu: Nghiên cứu mô tả cắt ngang Phương pháp HMMD: thực máy tự động Ventana, sử dụng PATHWAY™ HER2 (clone CB11) kháng thể đơn dòng phát kháng nguyên c-2erbB mẫu ung thư Đã FDA chấp thuận Phương pháp lai chỗ huỳnh quang (FISH): dùng kit Path Vysion, FDA chấp thuận ASCO and CAP khuyến cáo “tiêu chuẩnvàng” cho đánh giá khuếch đại gen HER2 Kết quả: Khảo sát 264 trường hợp thực đồng thời HMMD FISH -Kết HMMD: tỉ lệ dương tính 3(+) 26,9%, xem trường hợp 2(+) dương tính tỉ lệ HER2 (+) HMMD 39,8% Kết âm tính 60,2% -Kết FISH: không khuếch đại 67% khuếch đại 33% Tỉ lệ HER2/CEP17 ≥ 2,0 ngưỡng để đánh giá có khuếch đại Khuếch đại giáp biên 6,1%, khuếch đại thấp 9,5%, khuếch đại cao 17,4% Trong nghiên cứu này, thống kê Cramer’s V = 0,94 với p=0,001, cho thấy mối quan hệ hai phương pháp tương quan mạnh hai phương pháp có khác biệt nhỏ, đặc biệt nhóm HMMD 2(+) Từ khóa: Hóa mô miễn dịch, Lai chỗ huỳnh quang, HER2 ABSTRACT COMPARISON METHODS IMMUNOHISTOCHEMISTRY AND FLUORESCENT IN SITU HYBRIDIZATION ASSESSMENT HER2 GENE IN BREAST CANCER Doan Thi Phuong Thao, Hua Thi Ngoc Ha, Nguyen Thi Hong Nguyet, Ly Thanh Thien, Dang Hoang Minh, * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 15 - Supplement of No - 2011: 174 - 181 Introduction: Application of IHC and FISH methods to determine HER2 status in breast cancer in order to provide the most accurate results for patients receiving treatment most appropriate Methods: IHC: Immunohistochemical analysis was performed as specified by the autoimmunostainer using the Pathway kit The slides then were placed on an autoimmunostainer using the primary monoclonal antibody and polymer detection system supplied by Ventana FISH: FISH was performed as specified by the manufacturer, with a guideline to improve the accuracy of HER2 testing in invasive breast cancer of ASCO and CAP The PathVysion kit includes a Spectrum Orange-labeled DNA probe specific for the HER2 gene locus and a Spectrum Green-labeled probe specific for the alpha satellite DNA sequence at the centromeric region of chromosome 17 (CEP17) FISH and IHC results were compared with each other by means of Cramer's V statistics Result: 264 cases performed simultaneously IHC and FISH IHC: HER2 3(+) 26.9%, HER2 2(+) 12.9%, HER(-): 60.2% FISH: Non Amplified: 67.0%; Border Amplified: 6.1%; Low-Copy Amplified: 9.5%; High-Copy amplified: 17.4%; Correlation between IHC and FISH assays: IHC (-) cases : Non Amplified: 153/159 (96.2%); ∗ Bộ Môn Giải Phẫu Bệnh – Đại Học Y Dược TP.HCM Tác giả liên lạc: ThS Đoàn Thị Phương Thảo ĐT: 0938008418 Email: thaodoanthiphuong@ymail.com 174 Chuyên Đề Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật BV Cấp Cứu Trưng Vương Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 Nghiên cứu Y học Border Amplified: 4/159 (2.5%); Low-Copy Amplified: 2/159 (1.3%); High-Copy amplified: Non IHC2+ cases: Non Amplified: 22/34 (64.7%); Border Amplified: 8/34 (23.5%); Low-Copy Amplified: 2/34 (5.9%); High-Copy amplified: 2/34 (5.9%) IHC 3+ cases: Non Amplified: 2/71 (2.8%); Border Amplified: 4/71 (5.6%); Low-Copy Amplified : 21/71 (29.6%); High-Copy amplified: 44/71 (62.0%) Cramer's V statistics = 0.94 with p=0.001 Conclusions: Correlation between IHC and FISH assays is intermediate FISH should be done for all patients in need of treatment with Trastuzumab Key words: IHC, FISH, HER2 ĐẶT VẤN ĐỀ Huỳnh Quang Ung thư vú có 18% đến 30%(25,29), biểu mức HER2 Sự khuếch đại gen và/hoặc biểu mức thụ thể HER2 yếu tố tiên lượng cho trường hợp di chưa, tiên đốn đáp ứng hóa trị liệu không đáp ứng nội tiết định cho điều trị kháng thể đơn dòng trastuzumab(6,15) Tầm quan trọng tình trạng HER2 việc đưa định điều trị, bệnh nhân có kết dương tính giả khơng hưởng lợi từ liệu pháp điều trị nguy gây độc cho tim điều trị kháng thể đơn dòng(26) khiến nhà nghiên cứu tập trung ý vào độ nhạy độ đặc hiệu xét nghiệm khác dùng để xác định tình trạng HER2 Các xét nghiệm đánh giá HER2 phải định lượng bán định lượng, có khả lặp lại phải xét nghiệm phân biệt rõ ràng tế bào u có khơng khuếch đại/biểu q mức HER2(12,16) ĐỐI TƯỢNG PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Để xác định tình trạng HER2, phương pháp dựa vào hình ảnh mơ học Hóa mơ miễn dịch (IHC), lai chỗ huỳnh quang (FISH) thay phương pháp khác Southern blot, xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết men (enzyme-linked immunosorbent assay), PCR, xét nghiệm đòi hỏi phải sử dụng mơ tươi, ly giải tồn mẫu mơ nên kết khơng xác trộn lẫn mô ung thư mô lành(18,13) Mục tiêu nghiên cứu Chúng thực nghiên cứu nhằm - Xác định tỉ lệ khuếch đại HER2 ung thư vú - Đánh giá mức độ tương hợp hai phương pháp Hóa Mơ Miễn Dịch Lai Tại Chỗ Đối tượng Tất bệnh nhân chẩn đoán ung thư vú Bộ môn Giải phẫu bệnh Đại Học Y Dược TP Hồ Chí Minh năm 2009 Được thực đồng thời hóa mơ miễn dịch FISH Hóa Mô Miễn Dịch Thực máy tự động Ventana, sử dụng PATHWAY™ HER2 (clone CB11) kháng thể đơn dòng phát kháng nguyên c2erbB mẫu ung thư Đã FDA (Food and Drug Administration) chấp thuận(4) Người khảo sát HMMD độc lập với người khảo sát FISH Chúng cho điểm theo thang điểm khuyến cáo nhà sản xuất 0: màng tế bào ung thư xâm lấn hồn tồn khơng bắt màu 1(+): màng tế bào ung thư xâm lấn bắt màu rãi rác, nhạt 2(+): màng tế bào ung thư xâm lấn bắt màu hoàn toàn, mỏng, nhạt ≥30% 3(+): màng tế bào ung thư xâm lấn bắt màu hoàn toàn, dày, đậm, ≥30% Tất trường hợp nhuộm bào tương nhuộm lại Lai chỗ huỳnh quang (FISH)(30) FISH thực theo quy trình nhà sản xuất Bộ kit bao gồm đoạn dò PathVysion DNA Spectrum Orange-đặc hiệu cho gen HER2 đoạn dò Spectrum Green đặc hiệu cho trình tự DNA tâm động nhiễm sắc thể 17 (CEP17) Chuyên Đề Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật BV Cấp Cứu Trưng Vương 175 Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 Nghiên cứu Y học Luôn cắt hai tiêu song song, nhuộm H&E làm FISH Trên tiêu H&E xác định xác vùng tế bào ung thư xâm lấn, đối chiếu với tiêu thực FISH Mẫu cắt mỏng 4-μm, gắn lên tiêu tráng organosilane Số tín hiệu màu xanh xác định số lượng nhiễm sắc thể 17 tùy theo số lượng 1, nhiều tương ứng nhiễm sắc thể 17 đơn bội, lưỡng bội, đa bội Phương pháp thông kê Sử dụng phần mềm SPSS 17.0 KẾT QUẢ Khử protein màng nhân dung dịch Sau loại bỏ trường hợp không đạt yêu cầu (tín hiệu huỳnh quang khơng rõ ràng), chúng tơi khảo sát 264 mẫu ung thư vú làm đồng thời HMMD FISH, kết sau: protease 37°C 6-7’, tùy mẫu (thay 10’, Các đặc điểm nhóm bệnh nhân nghiên cứu theo quy định bao bì) Tuổi: tuổi trung bình 50,8 ± 11,1, trung vị 50 tuổi Khử sáp Pretreate axit Clohydric 0.2N natri thiocyanate theo quy định Sau rửa, tiêu cố định formalin đệm trung tính 10’ Rửa sạch, sấy khô Lai với hỗn hợp đoạn dò kép HER2/CEP17 vòng 18 Rửa sau lai, sấy khô, nhuộm tương phản với DAPI Bảo quản tiêu -20°C khảo sát vòng 24 Cách đánh giá tiêu FISH Chúng khảo sát FISH theo hướng dẫn nhà sản xuất Tín hiệu Spectrum Orange Spectrum Green đếm 20 nhân tế bào ung thư xâm lấn không chồng chất, trường hợp tỉ lệ chưa phân định khuếch đại hay không giáp biên, đếm 40 nhân, 60 nhân ung thư Tổng số tín hiệu màu cam (HER2) tín hiệu màu xanh (CEP17) ghi nhận tính tỷ lệ HER2/CEP17 -Tỉ lệ HER2/CEP17 < 2,0: không khuếch đại -Tỉ lệ HER2/CEP17 ≥ 2,0: khuếch đại -2,0 ≤ Tỉ lệ HER2/CEP17 < 2,5: khuếch đại GIÁP BIÊN -2,5 < Tỉ lệ HER2/CEP17 < 5: khuếch đại THẤP Nhóm tuổi Số ca Tỉ lệ % 20-29 1,5 30-39 32 12,1 40-49 86 32,6 50-59 94 35,6 60-69 26 9,8 70-79 18 6,8 >80 1,5 Tổng cộng 264 100,0 Loại Số ca Tỉ lệ NOS 244 92,4 Tiểu thùy 2,3 Nhú 1,5 Bã khô 1,5 Nhầy 2,3 Tổng cộng 264 100,0 Phân độ mô học ung thư Phân độ mơ học: nhóm 244 ca NOS đánh giá độ mô học theo bảng sau: Độ mô học Số ca Tỉ lệ NOS độ1 ,8 NOS độ 90 36,9 NOS độ 152 62,3 Tổng cộng 244 100,0 -Tỉ lệ HER2/CEP17 ≥ 5: khuếch đại CAO 176 Chuyên Đề Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật BV Cấp Cứu Trưng Vương Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 Kết hóa mơ miễn dịch Bảng 1: Kết hóa mơ miễn dịch Nghiên cứu Y học Kết FISH Số trường hợp Tỉ lệ % Không khuếch đại 177 67,0 HMMD Số trường hợp Tỉ lệ % Khuếch đại giáp biên 16 6,1 Âm tính 159 60,2 Khuếch đại thấp 25 9,5 2+ 34 12,9 Khuếch đại cao 46 17,4 3+ 71 26,9 Tổng cộng 264 100,0 Tổng cộng 264 100 Tỉ lệ dương tính 3(+) 71 trường hợp (26,9%), xem trường hợp 2(+) dương tính tỉ lệ HER2 (+) HMMD 39,8% Không khuếch đại gen HER2 67% khuếch đại 33% Tỉ lệ HER2/CEP17 = 2,0 ngưỡng để đánh giá có khuếch đại Khuếch đại giáp biên 16 trường hợp (6,1%) Kết FISH Khuếch đại thấp 25 trường hợp (9,5%) Bảng Kết FISH Khuếch đại cao 46 trường hợp (17,4%) Tương hợp hai kết Kết FISH Âm tính Kết HMMD 2+ 3+ Tổng cộng Không khuếch đại Khuếch đại giáp biên Khuếch đại thấp Khuếch đại cao Tổng cộng Số ca 153 159 % IHC 96,2 2,5 1,3 100 Số ca 22 2 34 % IHC 64,7 23,5 5,9 5,9 100 Số ca 21 44 71 % IHC 2,8 5,6 29,6 62,0 100 Số ca 177 16 25 46 264 % IHC 67,0 6,1 9,5 17,4 100 Cramer’s V = 0,649 với p= 0,001 Đánh giá tương quan hai kết HER22(+)/HMMD hai phương pháp HMMD FISH, chúng tơi Nhóm HMMD âm tính có 6/159 trường hợp dùng phép thống kê Cramer’s V phương khuếch đại gen HER2 chiếm 3,8%, có pháp thơng kê đánh giá mức độ quan hệ mật trường hợp khuếch đại thấp trường hợp thiết hai mẫu Thống kê Cramer’s V có hai khuếch đại giáp biên, khơng có khuếch đại cao giá trị 1, giá trị cho biết khơng có mối Nhóm HMMD 3(+) có 2/71 trường hợp quan hệ giá trị cho biết mối quan hệ không khuếch đại gen HER2 chiếm 2,8% hai phương pháp hoàn hảo khuếch đại cao 62% Trong nghiên cứu này, Cramer’s V = 0,649 Nhóm HMMD 2(+) nhóm khó tiên với p=0,001, cho thấy mối quan hệ hai đốn có khuếch đại gen hay khơng, bắt buộc phương pháp tương quan hai phải làm thêm FISH Trong nhóm có 12/34 phương pháp có khác biệt nhỏ xác định khuếch đại gen HER2 chiếm 35,3% tình trạng HER2, đặc biệt nhóm Chuyên Đề Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật BV Cấp Cứu Trưng Vương 177 Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 Nghiên cứu Y học So sánh tỉ lệ đa bội nhiễm sắc thể 17 với HMMD Bảng So sánh tỉ lệ đa bội nhiễm sắc thể 17 với HMMD Số trường hợp Tỉ lệ % Âm tính 58,4 3+ 41,6 Tổng cộng 12 100 Tỉ lệ đa bội nhiễm sắc thể 17: 12/264 trường hợp, chiếm 4,5% So sánh trung bình HER2 với tỉ lệ HER2/CEP17 Bảng So sánh trung bình tín hiệu HER2 với tỉ lệ HER2/CEP17 Trung bình HER2/nhân ≤4 >4 Tổng cộng Không Số ca khuếch đại % 165 12 178 92,7% 7,3% 100 Khuếch đại Số ca 87 86 0% 100,0% 100 165 99 264 62,4% 37,5% 100 % Tổng cộng Số ca % Trong nghiên cứu sử dụng kít Path Vysion, đánh giá đồng thời HER2 CEP 17 Mục đích nghiên cứu khơng phải so sánh khuếch đại gen phương pháp, cung cấp số liệu thấy cần thiết phải chọn kít có đánh giá CEP 17 HER2, Nếu định nghĩa số HER2/nhân ≥ xem trị số tuyệt đối(30) có khuếch đại gen nghiên cứu có đến 99 trường hợp Sau tính tỉ lệ số HER2/CEP17 kết có 13/94 trường hợp khơng khuếch đại tỉ lệ HER2/CEP17