Mục tiêu của nghiên cứu này nhằm khảo sát đối chiếu kết quả D‐ISH với kết quả FISH (tiêu chuẩn vàng) để có thể phát triển thêm một kỹ thuật mới với nhiều ưu điểm hơn. Đây là kết quả bước đầu khi thực hiện phương pháp D‐ISH để khảo sát tình trạng gen HER2 trong ung thư vú.
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 3 * 2013 Nghiên cứu Y học ĐÁNH GIÁ HER2 TRONG UNG THU VÚ BẰNG PHƯƠNG PHÁP LAI TẠI CHỖ HUỲNH QUANG VÀ LAI TẠI CHỖ GẮN BẠC Đồn Thị Phương Thảo*, Phan Đăng Anh Thư*, Hứa Thị Ngọc Hà*, Nguyễn Sào Trung* TĨM TẮT Giới thiệu: Tình trạng HER2 trong ung thư vú giữ vai trò rất quan trọng trong việc đưa ra quyết định điều trị, giúp cho các nhà lâm sàng tiên đốn đáp ứng hóa trị liệu, có hoặc khơng đáp ứng nội tiết và là yếu tố chỉ định cho điều trị kháng thể đơn dòng trastuzumab. Phương pháp lai tại chỗ huỳnh quang (FISH), được ASCO/CAP xác định là tiêu chuẩn vàng để khảo sát tình trạng HER2. Bộ mơn Giải Phẫu Bệnh Đại Học Y Dược triển khai phương pháp này từ năm 2009 đến nay. Tuy nhiên, để thực hiện phương pháp FISH đòi hỏi phòng xét nghiệm phải rất chun biệt, phải có kính hiển vi huỳnh quang, hơn nữa thời gian lưu trữ tiêu bản q ngắn nên không thể xem xét lại khi cần thiết. Song song với phương pháp FISH, từ năm 2012 Bộ môn chúng tôi đã ứng dụng thêm phương pháp lai tại chỗ gắn bạc hai màu (D‐ISH), với phương pháp này các tiêu bản được khảo sát dưới kính hiển vi quang học và đặc biệt tiêu bản có thể lưu trữ lâu dài. Phương pháp này cũng đã được FDA chấp thuận cho khảo sát HER2 vào tháng 6/2011. Mục tiêu của nghiên cứu này, chúng tơi khảo sát đối chiếu kết quả D‐ISH với kết quả FISH (tiêu chuẩn vàng) để có thể phát triển thêm một kỹ thuật mới với nhiều ưu điểm hơn. Đây là kết quả bước đầu khi thực hiện phương pháp D‐ISH để khảo sát tình trạng gen HER2 trong ung thư vú. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: Phương pháp lai tại chỗ huỳnh quang: dùng bộ kít PathVysion HER‐2 DNA Probe. Phương pháp lai tại chỗ gắn bạc (D‐ISH): dùng bộ INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe. Dùng trên máy nhuộm tự động. Phương pháp Hóa Mơ Miễn Dịch: bộ Pathway (Ventana Medical Systems Inc, Tucson, Ariz) dùng trên máy nhuộm tự động. Kết quả: Khảo sát 67 mẫu ung thư vú xâm lấn, trong đó có 47 mẫu được thực hiện đồng thời D‐ISH, FISH và HMMD. 20 mẫu thực hiện D‐ISH và HMMD. Tương hợp giữa kết quả của hai phương pháp lai với kết quả HMMD gần như tuyệt đối trong nhóm HER2(‐) và HER2(3+), nhóm HER2(2+) thì tỉ lệ khuếch đại dưới 20%. Tương hợp giữa kết quả FISH và Kết quả D‐ISH là 100% cả nhóm khơng khuếch đại và khuếch đại gen HER2. Kết luận: Trong nghiên cứu này, sự phù hợp giữa IHC và D‐ISH, FISH là trung bình. Sự phù hợp giữa kết quả FISH và D‐ISH là 100% cho cả trường hợp khuếch đại và khơng khuếch đại. Phương pháp D‐ ISH là phương pháp được chấp nhận để đánh giá HER2, kết quả nghiên cứu này đã cho thấy phương pháp D‐ISH có thể xác định được tình trạng HER2 với tỉ lệ tương hợp hai kết quả FISH và D‐ISH là 100%. Ngồi ra, xét nghiệm D‐ISH dễ sử dụng vì khảo sát được dưới kính hiển quang học, tín hiệu màu khơng phân hủy theo thời gian, mẫu có thể được lưu trữ ở nhiệt độ phòng trong thời gian dài. Phương pháp FISH hoặc D‐ISH nên được thực hiện cho tất cả các bệnh nhân cần điều trị bằng trastuzumab. Từ khóa: hóa mơ miễn dịch, lai tại chỗ huỳnh quang (FISH), lai tại chỗ gắn bạc hai màu (D‐ISH), HER2. *Bộ Mơn Giải Phẫu Bệnh – Đại Học Y Dược TP.HCM Tác giả liên lạc: TS Đồn Thị Phương Thảo ĐT: 0938008418 Chun Đề Giải Phẫu Bệnh Email: thaodtpdhyd@gmail.com 75 Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 3 * 2013 ABSTRACT EVALUATION OF HER2 STATUS IN BREAST CANCER BY FLUORESCENCE IN SITU HYBRIDIZATION, DUAL IN SITU HYBRIDIZATION AND IMMUNOHISTOCHEMICTRY Doan Thi Phuong Thao, Hua Thi Ngoc Ha, Nguyen Sao Trung * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 17 ‐ Supplement of No 3 ‐ 2013: 76 ‐ 82 Introduction: The application of FISH and D‐ISH methods to determine HER2 status in breast cancer in order to provide the most accurate results for patients receiving treatment most appropriate. Methods: FISH: Human epidermal growth factor receptor 2 (HER2) fluorescence in situ hybridization (FISH) is a quantitative assay for selecting breast cancer patients for target therapy. D‐ISH: Our objective was to apply an automated dual in situ hybridization (D‐ISH) application for HER2 gene and chromosome 17 centromere (CEN 17) in invasive breast carcinomas. (1) HER2 copies via silver in situ hybridisation (SISH) and (2) Chromosome 17 (CEN17) copies via chromogenic Red in situ hybridisation (Red ISH) on a single slide. The recognition of amplified HER2 copies which may require microscopic examination using objectives as high as 40X to 60X. Result: 67 invasive breast cancer samples performed simultaneously IHC and FISH or D‐ISH. Including 47 samples were carried out simultaneously D‐ISH, FISH and IHC. 20 samples performed simultaneously D‐ISH and IHC. The concordance between results of the two methods ISH with results IHC almost absolute among HER2(‐) and HER2(3 +). However, in HER2(2 +), the amplification rate of HER2 gene below 20%. The correlation between D‐ISH and FISH assays are 100%. Conclusions: In this study, the concordance between IHC and D‐ISH, FISH assays is intermediate. The concordance between FISH and D‐ISH was 100% for amplified and nonamplified cases. D‐ISH has become an accepted method for HER2 testing, in this study, have shown that D‐ISH is an effective test for the determination of HER2 status, with generally excellent concordance with FISH analysis. In addition, D‐ISH assays are easy to use because they require only a standard bright‐field microscope and stained samples do not decay over time, that we can be stored at room temperature. D‐ISH is, therefore, a viable alternative to FISH in laboratories in which FISH testing is not, or cannot be, established. FISH or D‐ISH should be done for all patients in need of treatment with Trastuzumab. Keywords: IHC, FISH, D‐ISH, gene HER2 ĐẶT VẤN ĐỀ Khuếch đại gen HER2 là nguyên nhân của 25% đến 30% ung thư vú(9,12), biểu hiện quá mức của quá mức HER2 và/hoặc khuếch đại gen là yếu tố tiên lượng xấu, thường kèm với thụ thể nội tiết âm tính, tỉ lệ phân bào cao, nhân dị dạng, đột biến gen p53 cho cả các trường hợp ung thư vú di căn hoặc chưa. Tình trạng HER2 giúp cho các nhà lâm sàng tiên đốn đáp ứng hóa trị liệu, có hoặc khơng đáp ứng nội tiết và là yếu tố chỉ định cho điều trị kháng thể đơn dòng trastuzumab(1,7). Vì tình trạng HER2 giữ vai trò rất quan trọng trong việc đưa ra quyết định điều trị, những bệnh nhân có kết quả dương tính giả 76 khơng những khơng được hưởng lợi từ các liệu pháp điều trị mà còn có nguy cơ bị gây độc cho cơ tim khi điều trị kháng thể đơn dòng(10) ngược lại, những bệnh nhân âm tính giả sẽ khơng nhận được điều trị thỏa đáng. Điều này, đã khiến các nhà nghiên cứu tập trung chú ý vào độ nhạy và độ đặc hiệu của các xét nghiệm khác nhau dùng để xác định tình trạng HER2. Các xét nghiệm đánh giá HER2 phải là định lượng hoặc bán định lượng, có khả năng lặp lại và phải là xét nghiệm phân biệt rõ ràng giữa các tế bào ung thư vú xâm lấn có hoặc khơng khuếch đại/biểu hiện q mức HER2(5,8). Chun Đề Giải Phẫu Bệnh Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 3 * 2013 Nghiên cứu Y học Để xác định tình trạng HER2, phương pháp lai tại chỗ huỳnh quang được xem như là tiêu chuẩn vàng, tuy nhiên phương pháp này đòi hỏi phải có kính hiển vi huỳnh quang và phòng xét nghiệm chun biệt, hơn nữa là các tiêu bản huỳnh quang khơng thể lưu trữ được lâu dài để xem xét lại vì tín hiệu huỳnh quang sẽ mất dần. Administration) chấp thuận để đánh giá thụ thể HER2. Hiện nay, phương pháp lai tại chỗ gắn bạc dựa trên nguyên tắc phản ứng men có thể thay thế được kỹ thuật FISH để đánh giá cả gen HER2 và centromere của nhiễm sắc thể 17 trên cùng một tiêu bản. Với phương pháp này, tiêu bản được khảo sát dưới kính hiển vi quang học và đặc biệt là lưu trữ tiêu bản được lâu dài, có thể chẩn đoán, hội chẩn, xem xét lại khi cần thiết. Chính vì thế, sau một thời gian thực hiện kỹ thuật FISH để khảo sát sự khuếch đại gen HER2 hiện nay bộ môn chúng tôi thực hiện thêm kỹ thuật D‐ISH để khảo sát sự khuếch đại HER2 và cơng trình nghiên cứu này là kết quả bước đầu. Người khảo sát HMMD độc lập với người khảo sát FISH, D‐ISH. ĐỐI TƯỢNG ‐ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng Bệnh nhân được chẩn đốn ung thư vú xâm lấn tại Bộ mơn Giải phẫu bệnh Đại Học Y Dược TP. Hồ Chí Minh. Tiêu chuẩn chọn Chọn những trường hợp đã thực hiện phương pháp FISH, HMMD trước đó, trong đó, 15 mẫu HER2(‐), 17 mẫu HER2(2+), 15 mẫu HER2(3+). Chọn ngẫu nhiên 20 các trường hợp bệnh nhân bị ung thư vú được chẩn đoán vào năm 2013, chưa có kết FISH nhưng có kết quả HMMD. Phương pháp Hóa Mơ Miễn Dịch: thực hiện trên máy tự động Ventana, sử dụng PATHWAY™ HER2 (clone CB11) là một kháng thể đơn dòng phát hiện kháng nguyên c‐2erbB trong các mẫu ung thư. Đã được FDA (Food and Drug Chuyên Đề Giải Phẫu Bệnh Bộ môn Giải Phẫu Bệnh đã tham gia kiểm định chất lượng xét nghiệm HMMD HER2 với tổ chức United Kingdom National External Quality Assessment Service (UK NEQUAS) và đã đạt kết quả tốt. Đánh giá theo thang điểm của nhà sản xuất: 0: màng tế bào u xâm lấn hồn tồn khơng bắt màu. 1(+): rác, nhạt. màng tế bào u xâm lấn bắt màu rải 2(+): màng tế bào u xâm lấn bắt màu hoàn toàn, mỏng, nhạt ≥ 30%. 3(+): màng tế bào u xâm lấn màu hoàn toàn, dày, đậm ≥ 30%. Lai tại chỗ huỳnh quang (FISH)(13): dùng bộ kít PathVysion HER‐2 DNA Probe. Đã được FDA (Food and Drug Administration) chấp thuận để đánh giá gen HER2. FISH được thực hiện theo quy trình của nhà sản xuất với thay đổi nhỏ. Bộ kit bao gồm đoạn dò PathVysion DNA Spectrum Orange‐đặc hiệu cho gen HER2 và đoạn dò Spectrum Green đặc hiệu cho các trình tự DNA tại tâm động của nhiễm sắc thể 17 (CEP17). Bộ môn Giải Phẫu Bệnh đã tham gia kiểm định chất lượng xét nghiệm FISH HER2 với tổ chức United Kingdom National External Quality Assessment Service (UK NEQUAS) và đã đạt kết quả chấp nhận được. Cách đánh giá tiêu bản FISH: theo hướng dẫn của ASCO/CAP. Tín hiệu SpectrumOrange và SpectrumGreen được đếm trong 20 nhân tế bào ung thư xâm lấn không chồng chất, trường hợp tỉ lệ chưa phân định được khuếch đại hay không hoặc giáp biên, chúng tôi đếm thêm 40 nhân tế bào ung thư. Tổng số tín hiệu màu cam (HER2) và tín hiệu màu xanh lá cây (CEP17) được ghi nhận và tính tỷ lệ HER2/CEP17. 77 Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 3 * 2013 Tỉ lệ HER2/CEP17