Đánh giá HER2 trong ung thu vú bằng phương pháp lai tại chỗ huỳnh quang và lai tại chỗ gắn bạc

Mục tiêu của nghiên cứu này nhằm khảo sát đối chiếu kết quả D‐ISH với kết quả FISH (tiêu chuẩn vàng) để có thể phát triển thêm một kỹ thuật mới với nhiều ưu điểm hơn. Đây là kết quả bước đầu khi thực hiện phương pháp D‐ISH để khảo sát tình trạng gen HER2 trong ung thư vú.

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 3 * 2013  Nghiên cứu Y học ĐÁNH GIÁ HER2 TRONG UNG THU VÚ BẰNG PHƯƠNG PHÁP  LAI TẠI CHỖ HUỲNH QUANG VÀ LAI TẠI CHỖ GẮN BẠC  Đồn Thị Phương Thảo*, Phan Đăng Anh Thư*, Hứa Thị Ngọc Hà*, Nguyễn Sào Trung*  TĨM TẮT  Giới  thiệu:  Tình trạng HER2 trong ung thư vú giữ vai trò rất quan trọng trong việc đưa ra quyết định  điều trị, giúp cho các nhà lâm sàng tiên đốn đáp ứng hóa trị liệu, có hoặc khơng đáp ứng nội tiết và là yếu tố chỉ  định  cho  điều  trị  kháng  thể  đơn  dòng  trastuzumab.  Phương  pháp  lai  tại  chỗ  huỳnh  quang  (FISH),  được  ASCO/CAP xác định là tiêu  chuẩn  vàng  để  khảo  sát  tình  trạng  HER2.  Bộ  mơn  Giải  Phẫu  Bệnh  Đại  Học  Y  Dược triển khai phương pháp này từ năm 2009 đến nay. Tuy nhiên, để thực hiện phương pháp FISH đòi hỏi  phòng xét nghiệm phải rất chun biệt, phải có kính hiển vi huỳnh quang, hơn nữa thời gian lưu trữ tiêu bản  q  ngắn  nên  không  thể  xem  xét  lại  khi  cần  thiết.  Song  song  với  phương  pháp  FISH,  từ  năm  2012  Bộ  môn  chúng tôi đã ứng dụng thêm phương pháp lai tại chỗ gắn bạc hai màu (D‐ISH), với phương pháp này các tiêu  bản được khảo sát dưới kính hiển vi quang học và đặc biệt tiêu bản có thể lưu trữ lâu dài. Phương pháp này cũng  đã được FDA chấp thuận cho khảo sát HER2 vào tháng 6/2011. Mục tiêu của nghiên cứu này, chúng tơi khảo  sát đối chiếu kết quả D‐ISH với kết quả FISH (tiêu chuẩn vàng) để có thể phát triển thêm một kỹ thuật mới với  nhiều  ưu  điểm  hơn.  Đây  là  kết  quả  bước  đầu  khi  thực  hiện  phương  pháp  D‐ISH  để  khảo  sát  tình  trạng  gen  HER2 trong ung thư vú.  Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: Phương pháp lai tại chỗ huỳnh quang: dùng bộ kít PathVysion  HER‐2  DNA  Probe.  Phương pháp lai tại chỗ  gắn bạc (D‐ISH): dùng bộ  INFORM  HER2  Dual  ISH  DNA  Probe.  Dùng  trên  máy  nhuộm  tự  động.  Phương  pháp  Hóa  Mơ  Miễn  Dịch:  bộ  Pathway  (Ventana  Medical  Systems Inc, Tucson, Ariz) dùng trên máy nhuộm tự động.  Kết quả: Khảo sát 67 mẫu ung thư vú xâm lấn, trong đó có 47 mẫu được thực hiện đồng thời D‐ISH,  FISH và HMMD. 20 mẫu thực hiện D‐ISH và HMMD. Tương hợp giữa kết quả của hai phương pháp lai  với kết quả HMMD gần như tuyệt đối trong nhóm HER2(‐) và HER2(3+), nhóm HER2(2+) thì tỉ lệ khuếch  đại  dưới  20%.  Tương  hợp  giữa  kết  quả  FISH  và  Kết  quả  D‐ISH  là  100%  cả  nhóm  khơng  khuếch  đại  và  khuếch đại gen HER2.  Kết  luận: Trong nghiên cứu này, sự phù hợp giữa IHC và D‐ISH, FISH là trung bình. Sự phù hợp  giữa kết quả FISH và D‐ISH là 100% cho cả trường hợp khuếch đại và khơng khuếch đại. Phương pháp D‐ ISH là phương pháp được chấp nhận để đánh giá HER2, kết quả nghiên cứu này đã cho thấy phương pháp  D‐ISH  có  thể  xác  định  được  tình  trạng  HER2  với  tỉ  lệ  tương  hợp  hai  kết  quả  FISH  và  D‐ISH  là  100%.  Ngồi ra, xét nghiệm D‐ISH dễ sử dụng vì khảo sát được dưới kính hiển quang học, tín hiệu màu khơng  phân hủy theo thời gian, mẫu có thể được lưu trữ ở nhiệt độ phòng trong thời gian dài. Phương pháp FISH  hoặc D‐ISH nên được thực hiện cho tất cả các bệnh nhân cần điều trị bằng trastuzumab.  Từ  khóa:  hóa  mơ  miễn  dịch,  lai  tại  chỗ  huỳnh  quang  (FISH),  lai  tại  chỗ  gắn  bạc  hai  màu  (D‐ISH),  HER2.  *Bộ Mơn Giải Phẫu Bệnh – Đại Học Y Dược TP.HCM  Tác giả liên lạc: TS Đồn Thị Phương Thảo ĐT: 0938008418  Chun Đề Giải Phẫu Bệnh  Email: thaodtpdhyd@gmail.com  75 Nghiên cứu Y học  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 3 * 2013 ABSTRACT  EVALUATION OF HER2 STATUS IN BREAST CANCER BY FLUORESCENCE IN SITU  HYBRIDIZATION, DUAL IN SITU HYBRIDIZATION AND IMMUNOHISTOCHEMICTRY  Doan Thi Phuong Thao, Hua Thi Ngoc Ha, Nguyen Sao Trung  * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 17 ‐ Supplement of No 3 ‐ 2013: 76 ‐ 82  Introduction: The application of FISH and D‐ISH methods to determine HER2 status in breast cancer in  order to provide the most accurate results for patients receiving treatment most appropriate.  Methods:  FISH:  Human  epidermal  growth  factor  receptor  2  (HER2)  fluorescence  in  situ  hybridization  (FISH) is a quantitative assay for selecting breast cancer patients for target therapy. D‐ISH: Our objective was to  apply  an  automated  dual  in  situ  hybridization  (D‐ISH)  application  for  HER2  gene  and  chromosome  17  centromere (CEN 17) in invasive breast carcinomas. (1) HER2 copies via silver in situ hybridisation (SISH) and  (2) Chromosome 17 (CEN17) copies via chromogenic Red in situ hybridisation (Red ISH) on a single slide. The  recognition  of  amplified  HER2  copies  which  may  require  microscopic  examination  using  objectives  as  high  as  40X to 60X.  Result: 67 invasive breast cancer samples performed simultaneously IHC and FISH or D‐ISH. Including 47  samples were carried out simultaneously D‐ISH, FISH and IHC. 20 samples performed simultaneously D‐ISH  and  IHC.  The  concordance  between  results  of  the  two  methods  ISH  with  results  IHC  almost  absolute  among  HER2(‐)  and  HER2(3  +).  However,  in  HER2(2  +),  the  amplification  rate  of  HER2  gene  below  20%.  The  correlation between D‐ISH and FISH assays are 100%.  Conclusions:  In this study, the  concordance between IHC and D‐ISH, FISH assays is intermediate. The  concordance between FISH and D‐ISH was 100% for amplified and nonamplified cases. D‐ISH has become an  accepted method for HER2 testing, in this study, have shown that D‐ISH is an effective test for the determination  of HER2 status, with generally excellent concordance with FISH analysis. In addition, D‐ISH assays are easy to  use because they require only a standard bright‐field microscope and stained samples do not decay over time, that  we can be stored at room temperature. D‐ISH is, therefore, a viable alternative to FISH in laboratories in which  FISH testing is not, or cannot be, established. FISH or D‐ISH should be done for all patients in need of treatment  with Trastuzumab.  Keywords: IHC, FISH, D‐ISH, gene HER2  ĐẶT VẤN ĐỀ  Khuếch  đại  gen  HER2  là  nguyên  nhân  của  25% đến 30% ung thư vú(9,12), biểu hiện quá mức  của  quá  mức  HER2  và/hoặc  khuếch  đại  gen  là  yếu  tố  tiên  lượng  xấu,  thường  kèm  với  thụ  thể  nội tiết âm tính, tỉ lệ phân bào cao, nhân dị dạng,  đột biến gen p53 cho cả các trường hợp ung thư  vú di căn hoặc chưa. Tình trạng HER2 giúp cho  các nhà lâm sàng tiên đốn đáp ứng hóa trị liệu,  có hoặc khơng đáp ứng nội tiết và là yếu tố chỉ  định  cho  điều  trị  kháng  thể  đơn  dòng  trastuzumab(1,7).  Vì  tình  trạng  HER2  giữ  vai  trò  rất quan trọng trong việc đưa ra quyết định điều  trị, những bệnh nhân có kết quả dương tính giả  76 khơng những khơng được hưởng lợi từ các liệu  pháp điều trị mà còn có nguy cơ bị gây độc cho  cơ tim khi điều trị kháng thể đơn dòng(10) ngược  lại, những bệnh nhân âm tính giả sẽ khơng nhận  được điều trị thỏa đáng. Điều này, đã khiến các  nhà nghiên cứu tập trung chú ý vào độ nhạy và  độ đặc hiệu của các xét nghiệm khác nhau dùng  để  xác  định  tình  trạng  HER2.  Các  xét  nghiệm  đánh  giá  HER2  phải  là  định  lượng  hoặc  bán  định  lượng,  có  khả  năng  lặp  lại  và  phải  là  xét  nghiệm  phân  biệt  rõ  ràng  giữa  các  tế  bào  ung  thư vú xâm lấn có hoặc khơng khuếch đại/biểu  hiện q mức HER2(5,8).  Chun Đề Giải Phẫu Bệnh   Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 3 * 2013  Nghiên cứu Y học Để xác định tình trạng HER2, phương pháp  lai  tại  chỗ  huỳnh  quang  được  xem  như  là  tiêu  chuẩn vàng, tuy nhiên phương pháp này đòi hỏi  phải có kính hiển vi huỳnh quang và phòng xét  nghiệm  chun  biệt,  hơn  nữa  là  các  tiêu  bản  huỳnh quang khơng thể lưu trữ được lâu dài để  xem xét lại vì tín hiệu huỳnh quang sẽ mất dần.  Administration) chấp thuận để đánh giá thụ thể  HER2.  Hiện  nay,  phương  pháp  lai  tại  chỗ  gắn  bạc  dựa trên nguyên tắc phản ứng men có thể thay  thế  được  kỹ  thuật  FISH  để  đánh  giá  cả  gen  HER2  và  centromere  của  nhiễm  sắc  thể  17  trên  cùng  một  tiêu  bản.  Với  phương  pháp  này,  tiêu  bản được khảo sát dưới kính hiển vi quang học  và  đặc  biệt  là  lưu  trữ  tiêu  bản  được  lâu  dài,  có  thể  chẩn  đoán,  hội  chẩn,  xem  xét  lại  khi  cần  thiết. Chính vì thế, sau một thời gian thực hiện  kỹ  thuật  FISH  để  khảo  sát  sự  khuếch  đại  gen  HER2  hiện  nay  bộ  môn  chúng  tôi  thực  hiện  thêm kỹ thuật D‐ISH để khảo sát sự khuếch đại  HER2  và  cơng  trình  nghiên  cứu  này  là  kết  quả  bước đầu.  Người  khảo  sát  HMMD  độc  lập  với  người  khảo sát FISH, D‐ISH.  ĐỐI TƯỢNG ‐ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU  Đối tượng  Bệnh nhân được chẩn đốn ung thư vú xâm  lấn tại Bộ mơn Giải phẫu bệnh Đại Học Y Dược  TP. Hồ Chí Minh.  Tiêu chuẩn chọn  Chọn  những  trường  hợp  đã  thực  hiện  phương pháp FISH, HMMD trước đó, trong đó,  15  mẫu  HER2(‐),  17  mẫu  HER2(2+),  15  mẫu  HER2(3+).  Chọn  ngẫu  nhiên  20  các  trường  hợp  bệnh  nhân  bị  ung  thư  vú  được  chẩn  đoán  vào  năm  2013,  chưa  có  kết  FISH  nhưng  có  kết  quả  HMMD.  Phương pháp  Hóa  Mơ  Miễn  Dịch:  thực  hiện  trên  máy  tự  động  Ventana,  sử  dụng  PATHWAY™  HER2  (clone  CB11)  là  một  kháng  thể  đơn  dòng  phát  hiện  kháng  nguyên  c‐2erbB  trong  các  mẫu  ung  thư.  Đã  được  FDA  (Food  and  Drug  Chuyên Đề Giải Phẫu Bệnh  Bộ  môn  Giải  Phẫu  Bệnh  đã  tham  gia  kiểm  định  chất  lượng  xét  nghiệm  HMMD  HER2  với  tổ  chức  United  Kingdom  National  External  Quality  Assessment  Service  (UK  NEQUAS)  và  đã đạt kết quả tốt.  Đánh giá theo thang điểm của nhà sản xuất:  0:  màng tế bào u xâm lấn hồn tồn khơng  bắt màu.  1(+):  rác, nhạt.  màng tế bào u xâm lấn bắt màu rải  2(+):  màng  tế  bào  u  xâm  lấn  bắt  màu  hoàn toàn, mỏng, nhạt ≥ 30%.  3(+):  màng  tế  bào  u  xâm  lấn  màu  hoàn  toàn, dày, đậm ≥ 30%.  Lai tại chỗ  huỳnh quang (FISH)(13): dùng bộ  kít  PathVysion  HER‐2  DNA  Probe.  Đã  được  FDA  (Food  and  Drug  Administration)  chấp  thuận để đánh giá gen HER2.  FISH được thực hiện theo quy trình của nhà  sản xuất với thay đổi nhỏ. Bộ kit bao gồm đoạn  dò PathVysion DNA Spectrum Orange‐đặc hiệu  cho gen HER2 và đoạn dò Spectrum Green đặc  hiệu  cho  các  trình  tự  DNA  tại  tâm  động  của  nhiễm sắc thể 17 (CEP17).  Bộ  môn  Giải  Phẫu  Bệnh  đã  tham  gia  kiểm  định  chất  lượng  xét  nghiệm  FISH  HER2  với  tổ  chức United Kingdom National External Quality  Assessment  Service  (UK  NEQUAS)  và  đã  đạt  kết quả chấp nhận được.  Cách  đánh  giá  tiêu  bản  FISH:  theo  hướng  dẫn  của  ASCO/CAP.  Tín  hiệu  SpectrumOrange  và  SpectrumGreen  được  đếm  trong  20  nhân  tế  bào ung thư xâm lấn không chồng chất, trường  hợp  tỉ  lệ  chưa  phân  định  được  khuếch  đại  hay  không  hoặc  giáp  biên,  chúng  tôi  đếm  thêm  40  nhân tế bào ung thư. Tổng số tín hiệu màu cam  (HER2)  và  tín  hiệu  màu  xanh  lá  cây  (CEP17)  được ghi nhận và tính tỷ lệ HER2/CEP17.  77 Nghiên cứu Y học  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 3 * 2013 Tỉ lệ HER2/CEP17