Đề tài này được tiến hành với mục tiêu nhằm xác định tần suất mang gen sinh ESBL và AmpC của Enterobacteriaceae phân lập được trong cộng đồng tại Tp. Hồ Chí Minh năm 2013. Mời các bạn cùng tham khảo bài viết để nắm rõ nội dung chi tiết.
Trang 1CỦA ENTEROBACTERIACAE TRONG CỘNG ĐỒNG TẠI THÀNH PHỐ
HỒ CHÍ MINH NĂM 2013
Nguyễn Đỗ Phúc*, Nguyễn Lý Hoàng Ngân*
TÓM TẮT
Đặt vấn đề: Lý do chính đề kháng kháng sinh của Enterobacteriaceae đối với nhóm kháng sinh β‐lactama là
việc sinh ra men Extended spectrum β‐lactamase (ESBLs) và AmpC β‐lactamas. Tiếp theo nghiên cứu trước về tần suất vi khuẩn Enterobacteriaceae sinh ESBL trong cộng đồng Tp. Hồ Chí Minh. Nghiên cứu tiếp tục thực hiện phân tích kiểu gen của vi khuẩn sinh β‐lactamase và sự tương quan giữa kiểu hình ‐ kiểu gen ESBL và AmpC của các chủng phân lập được.
Mục tiêu: Xác định tần suất mang gen sinh ESBL và AmpC của Enterobacteriaceae phân lập được trong
cộng đồng tại Tp. Hồ Chí Minh năm 2013.
Phương pháp nghiên cứu: Nghiên cứu tiền cứu, thực hiện từ tháng 6 đến tháng 12 năm 2013 tại Tp. Hồ
Chí Minh. 148 chủng sinh men β‐lactamas đưa vào nghiên cứu, E.coli là 85 chủng; Klebsiella spp. là 61 chủng và Citrobacter là 2 chủng. Các chủng được phân tích xác định kiểu gen sinh ESBL và AmpC bằng kỹ thuật multiplex‐PCR.
Kết quả: Trong số 148 chủng Enterobacteriaceae sinh men β‐lactamase thì tỷ lệ chủng có kiểu hình ESBL là
113 (76,4%) và AmpC là 35 (23,6%). Tỷ lệ kiểu gen so với kiểu hình của ESBL là 85/113 (85%) và kiểu gen của AmpC 7/35 (20%). Đối với E. coli, có 62/73 (85%) chủng có mang gen sinh ESBL, trong đó chủng mang 1 gen phổ biến CTX‐M là 26 (35,6%), TEM là 1 (1,4%); mang 2 gen TEM+CTX‐M là 34 (46,5%) và SHV+CTX‐M là
1 (1,4%). Chủng mang gen AmpC là 2/12 (33%), trong đó tần suất mang 1 gen DHA là 2 (16,7%), mang 2 gen FOX+CYM là 2 (16,7%).Đối với Klebsiella spp., có 22/39 (56,4%) có mang gen sinh ESBL, trong đó chủng mang 1 gen CTX‐M là 6 (15,4%), TEM là 2 (5,1%), mang 2 gen SHV+CTX‐M 6 (15,4%) và TEM+CTX‐M là
4 (10,3%) và mang 3 gen SHV+TEM+CTX‐M là 3 (7,7%). Chủngmang gen sinh AmpC có 2/20 (9%), trong đó
số chủng mang 1 gen DHA là 2 (4,5%) và mang 2 gen FOX+CYM là 2 (4,5%). Đối với Citrobacter, thì 1 chủng
có kiểu hình sinh ESBL và kiểu gen là TEM ; 1 chủng có kiểu hình sinh AmpC và kiểu gen CYM.
Kết luận: Tần suất mang gen ESBL của Enterobacteriaceae: mang 1 gen CTX‐M là 28,3%, TEM là 3,5%,
SHV là 1%; mang 2 gen TEM+CTX‐M là 33,6%, SHV+ CTX‐M là 6,2% và 3 gen SHV+TEM+CTX‐M là 2,7%. Tần suất mang gen AmpC của Enterobacteriaceae: mang 1 gen DHA là 8,6%, CYM là 2,9% và mang 2 gen FOX+CYM là 8,6%.
Từ khóa: gen sinh ESBL, Ampc, cộng đồng khỏe mạnh.
ABSTRACT
PREVALENCE OF GENES EXTENDED SPECTRUM LACTAMASE (ESBL) AND AMPC PRODUCING
ENTEROBACTERIACAE
IN HEALTHY POPULATION, HO CHI MINH, 2013.
Nguyen Do Phuc, Nguyen Ly Hoang Ngan
* Y Hoc Tp. Ho Chi Minh * Vol. 18 ‐ Supplement of No 6‐ 2014: 388 – 392
Background: A major reason for resistance of Enterobacteriacae to β‐lactamase is the production of ESBLs
*Viện Y tế công cộng Tp. Hồ Chí Minh
Trang 2and AmpC β‐lactamase. Continuing the previous study on prevalence of ESBL producing Enterobacteriacae in a healthy population in Ho Chi Minh City, a study on genotypes of ESBLs and AmpC are analysed according to collected Enterobacteriacae isolates.
Objectives: to determine the prevalence of genotypes of ESBLs and AmpC of Enterobacteriacae in a healthy
population in Ho Chi Minh City.
Methods: A prospective cohort study was conducted in Ho Chi Minh City from July to December, in 2013.
Of studied 148 isolates of β‐lactamase producing Enterobacteriacae, there were 85 E.coli isolates; 61 Klebsiella spp. isolates and 2 Citrobacter isolates. The isolates were examined genotypes of ESBL and AmpC by using multiplex‐PCR technique.
Result: 148 β‐lactamase producing Enterobacteriaceae iolates, phenotypes of ESBL is 113 (76.4%) and
AmpC is 35 (23.6%). The rate of genotypes compare with phenotypes of ESBL is 85/113 (85%) and of AmpC 7/35 (20%). 62/73 (85%) E. Coli isolates carry genes producing ESBL; among them, number of isolates carrying one gene CTX‐M is 26 (35.6%), TEM is 1 (1.4%); carrying TEM+CTX‐M genes is 34 (46.5%) and SHV+CTX‐
M is 1 (1.4%). Number of isolates carrying genes producing AmpC is 2/12 (33%); among them, number of isolates carrying one gene DHA is 2 (16.7%), carrying two genes FOX+CYM is 2 (16.7%).Klebsiella spp., 22/39 (56.4%) isolates carry genes producing ESBL; among them, number of isolates carrying one gene CTX‐M is 6 (15.4%), TEM is 2 (5.1%), carrying two genes SHV+CTX‐M 6 (15.4%) and TEM+CTX‐M is 4 (10.3%), and carrying three genes SHV+TEM+CTX‐M is 3 (7.7%).Number of isolates carry genes producing AmpC is 2/20 (9%); among them, number of isolates carrying one gene DHA is (4.5%) carrying two genes FOX+CYM is 2 (4.5%).Citrobacter, one phenotype and genotype of ESBL is TEM ; one phenotype and genotype of AmpC is CYM.
Conclusion: Prevalence of ESBL Enterobacteriacae genes: carrying one CTX‐M gene, TEM, SHV,
TEM+CTX‐M, SHV+CTX‐M and SHV+TEM+CTX‐M are 28.3%, 3.5%, 1%; 33.6%, 6.2% and 2.7% respectively. Prevalence of AmpC Enterobacteriacae genes: carrying one DHA gene, CYM and FOX+CYM are respectively 8.6%, 2.9% and 8.6%.
Key words: GenotypesESBL; AmpC; healthy population.
ĐẶT VẤNĐỀ
Nhiều nghiên cứu về tần suất mang gen sinh
β‐lactam được nghiên cứu tại nhiều nước trên
thế giới như Đức(5), Cộng hóa Séc(1), Thái Lan(2),
Nhật Bản(3),… trong cộng đồng người khỏe
mạnh. Tại Việt Nam, tần suất vi khuẩn sinh men
β‐lactamase của Enterobacteriacae đã được nghiên
cứu chủ yếu tại các bệnh viện tại Việt nam. Gần
đây một số nghiên cứu về tần suất người trên 18
tuổi mang vi khuẩn sinh ESBL tại Tp. Hồ Chí
Minh, nhưng chỉ tập trung ở Quận 3(6). Việc
nghiên cứu về sự tần suất phân bố các gen sinh
ESBL và AmpC của Enterobacteriacae chưa được
nghiên cứu tại cộng đồng khỏe mạnh tại Tp. Hồ
Chí Minh. Đề tài này với mục đích xác định tần
suất các gen sinh ESBL và AmpC của
Enterobacteriacae ở người khỏe mạnh trong cộng
đồng tại Tp. Hồ Chí Minh với các mục tiêu sau.
Mục tiêu nghiên cứu
Tỷ lệ chủng Enterobacteriaceae mang gen sinh
ESBL và AmpC
Tỷ lệ các gen sinh β‐lactam (ESBL và AmpC)
phân bố trong các chủng Enterobacteriaceae.
ĐỐI TƯỢNG ‐ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu
Chủng có kiểu hình của Enterobacteriacae
phân lập trên mẫu phân trong cộng đồng tại Tp.
Hồ Chí Minh: 148 chủng: E. coli: 85 chủng,
Klebsiella spp.: 61 chủngvà Citrobacter: 2 chủng.
Trang 3Chuẩn bị DNA
+ Chuẩn bị DNA để chạy phản ứng
multiplex PCR phát hiện gen sinh ESBL và
AmpC của Enterobacteriacae:
Từ khuẩn lạc thuần khiết trên môi trường
BHI. Hút 0,1ml dịch canh khuẩn cho vào 100μl
đệm TE (pH 8.0). Đun sôi 100°C trong 10 phút.
Ly tâm 14.000 vòng, thu dịch nổi và sử dụng cho
phản ứng multiplex‐PCR. Mẫu dịch chiết còn lại
lưu giữ ‐20°C.
+ Trình tự mồi phát hiện các gen sinh AmpC
bằng kỹ thuật Multiplex PCR: gen đích MOX‐1,
MOX‐2, CMY‐1, CMY‐8 đến CMY‐11: sản phẩm
PCR 520 bp, LAT‐1 to LAT‐4, CMY‐2 đến CMY‐
7, BIL‐1: sản phẩm PCR 462 bp, DHA‐1, DHA‐2:
sản phẩm PCR 405 bp, ACC: sản phẩm PCR 346
bp, MIR‐1T ACT‐1: sản phẩm PCR 302 bp và
FOX‐1 đến FOX‐5b: sản phẩm PCR 190 bp(1, 4).
‐ Trình tự mồi phát hiện các gen sinh ESBL
bằng kỹ thuật Multiplex PCR: gen đích SHV: sản
phẩm PCR 1018 bp, TEM: sản phẩm PCR 1080
bp và CTX: sản phẩm PCR 544 bp(1, 5).
Chu kỳ nhiệt phản ứng multiplex‐PCR
Sử dụng 2 μl dịch chiết DNA cho vào master
mix và chạy PCR theo chu kỳ nhiệt: 1 chu kỳ:
95oC/15 phút; 30 chu kỳ: 95oC/30 giây, 60oC/30
giây và 72oC/60 giây và 1 chu kỳ: 72oC/10 phút.
Sản phẩm PCR được điện di trong agarose 2% có
bổ sung Gel Red.
Điện di
Trộn đều sản phẩm PCR và hút 5μl cho vào
1μl thuốc nhuộm màu.
Cho vào giếng agarose 2% bổ sung Gel Red
10.000X.
Điện di 100V trong 40 phút tại nhiệt độ phòng.
Chụp band sản phẩm PCR trên máy điện di
BioRad.
Phân tích thống kê
Nhập dữ liệu bằng phần mềm Epidata 3.0 và
phân tích dữ liệu bằng phần mềm Stata 10.0.
Thống kê mô tả tính tần số và tỷ lệ phần trăm được dùng để mô tả đặc tính của mẫu. Dùng phép kiểm χ2 để kiểm định sự khác biệt của các biến số. Giá trị p <0,05 được xem như khác biệt
có ý nghĩa thống kê.
KẾT QUẢ
Bảng 1: Đặc điểm kiểu hình của Enterbacteriacae
sinh men β‐lactamase (n=148)
Kiểu hình sinh men β-lactamase
Tần số (%)
Trong 148 chủng Enterbacteriacae sinh men β‐
lactamase, qua kết quả xác nhận kiểu hình bằng phương pháp đĩa kháng sinh kết hợp, có 113/148 (76,4%) chủng mang kiểu hình sinh ESBL và 35/148 (23,6%) chủng mang kiểu hình AmpC.
Bảng 2: Tần suất các gen của Enterbacteriacae sinh
ESBL trong cộng đồng (n=113)
Các gen đích của ESBL
Số chủng mang gen ESBL (n/%)
E coli
(n=73) (+/%)
Klebsiella spp (n=39)
(+/%)
Citrobacter
(n=1) (+/%)
TEM,
CTX-M
SHV,
SHV, TEM,
Không phát hiện
Trong số 113 chủng có kiểu hình sinh ESBL, chỉ có 85/113 (75%) chủng mang gen sinh ESBL.
Trong số các chủng E. coli, tần số xuất hiện kiểu
gen sinh ESBL là 85%, trong đó tỷ lệ chủng mang 1 gen vượt trội là CTX‐M 35,6%, chủng mang 2 gen TEM/CTX‐M là 46,5%. Trong số các
chủng Klebsiella spp. tần số xuất hiện kiểu gen
sinh ESBL là 57,4%, trong đó tỷ lệ chủng mang 1 gen CTX‐M là 15,4%, chủng mang 2 gen TEM/CTX‐M và 2 gen SHV/CTX‐M lần lượt là
10,3% và 15,4%. Trong số các chủng Klebsiella
spp., tần số xuất hiện kiểu gen sinh ESBL là
57,4%, trong đó tỷ lệ chủng mang 1 gen vượt trội
Trang 4là CTX‐M 15,4%, mang 2 gen TEM/CTX‐M và
SHV/CTX‐M lần lượt là 10,3% và 15,4%. Chủng
mang gen SHV chỉ tìm thấy trong chủng
Klebsiella spp. (chỉ 1 chủng, tỷ lệ 2,6%). Citrobacter
hiện nay chỉ phát hiện 1 chủng mang gen TEM.
Bảng 3: Tần suất các gen của Enterbacteriacae sinh
AmpC trong cộng đồng (n=35)
Các gen
đích của
AmpC
E coli
(n=12)
(+/%)
Klebsiella spp
(n=22) (+/%)
Citrobacter
(n=1) (+/%)
Trong số 35 chủng có kiểu hình sinh AmpC,
chỉ có 7 chủng(20%) mang gen sinh AmpC.
Trong số các chủng E. coli, tần số xuất hiện kiểu
gen sinh AmpC là 33,3%, trong đó tỷ lệ chủng
mang 1 gen DHA, chủng mang 2 gen FOX/CYM
cùng tỷ lệ là 16,7%. Trong số các chủng Klebsiella
spp. tần số xuất hiện kiểu gen sinh AmpC là
9,1%, trong đó 1 chủng mang gen DHA (4,5%)
và 1 chủng mang 2 gen FOX/CYM (4,5%).
Chủng mang gen CYM chỉ tìm thấy trong chủng
Citrobacter (chỉ 1 chủng, tỷ lệ 2,6%). Citrobacter
hiện nay chỉ phát hiện 1 chủng mang gen CYM.
Trong số 85 chủng E. coli, thì 73 chủng có
kiểu hình sinh ESBL và 12 chủng có kiểu hình
sinh AmpC. Phân tích kiểu gen chủng có kiểu
hình sinh ESBL cho thấy có 62/73 (85%) chủng có
mang gen sinh ESBL, trong đó số lượt chủng
mang 1 gen phổ biến CTX‐M là 26 (35,6%), TEM
là 1 (1,4%) mang 2 gen TEM/CTX‐M là 34
(46,5%) và SHV/CTX‐M là 1 (1,4%).Chủng mang
gen AmpC là 2/12 (33%), trong đó tần suất xuất
hiện gen DHA là 2 (16,7%), mang 2 gen
FOX/CYM là 2 (16,7%).
Trong số 61 chủng Klebsiella spp., 39 chủng có
kiểu hình sinh ESBL và 22 chủng có kiểu hình
sinh AmpC. Phân tích kiểu gen chủng có kiểu
hình sinh ESBL cho thấy có 22/39 (56,4%) có
mang gen sinh ESBL, trong đó số lượt chủng
mang 1 gen phổ biến CTX‐M là 6 (15,4%), TEM
là 2 (5,1%), mang 2 gen SHV/CTX‐M 6 (15,4%) và TEM/CTX‐M là 4 (10,3%), và mang 3 gen SHV/TEM/CTX‐M là 3 (7,7%).Chủng có kiểu hình mang gen sinh AmpC cho thấy có 2/20 (9%), trong đó tần suất xuất hiện vi khuẩn mang
1 gen DHA là 2 (4,5%) và mang 2 gen FOX/CYM
là 2 (4,5%).
Trong số 2 chủng Citrobacter, thì 1 chủng có
kiểu hình sinh ESBL và kiểu gen là TEM; 1 chủng
có kiểu hình sinh AmpC và kiểu gen CYM.
BÀN LUẬN
Bảng 2, có 85 chủng Enterobacteriaceae mang
gen sinh ESBL trong số 113 chủng (75%), kết quả này cho thấy rằng kiểu gen đưa vào nghiên cứu tập trung vào 3 gen chính TEM, SHV và CTX‐M,
có nhiều loại cũng như nhiều biến thể của của TEM hoặc SHV điều khiển sinh β‐lactamase mà trong nghiên cứu chưa thể phát hiện được. Trong
số các chủng Enterobacteriaceae, tỷ lệ mang 1 gen
CTX‐M chiếm ưu thế, kết quả này cũng cho thấy tương tự như nghiên cứu của tác giả Tadahiru,
2010 trên mẫu phân tại cộng đồng Thái Lan, tỷ lệ CTX‐M là 58,2%. Nhưng theo nghiên cứu của Ulzii‐Orshikh Luvsansharav, 2011 cũng có sự khác nhau về tỷ lệ mang gen CTX‐M trong cộng đồng người Thái Lan tại các miền khác nhau: 29,3% ở Nan (43/147), 29,9% ở Nakhon Si Thammarat (43/144) và 50,6% ở Kanchanaburi
(78/154) và E. coli là vi khuẩn nổi trội trong họ
Enterobacteriaceae mang gen sinh CTX‐M
Bảng 3, tỷ lệ kiểu gen AmpC của
Enterobacteriaceae trong nghiên cứu này thấp, chỉ
chiếm 20%. Tần suất xuất hiện gen DHA trội hơn so với các gen khác, trong khi đó nghiên cứu của M. Kolar, 2010 thì gen CYM lại cao hơn so với các gen khác khi nghiên cứu trên gia cầm tại Cộng hòa Séc. Một nghiên cứu tại Hàn Quốc về
kiểu gen sinh ESBL và AmpC của E. coli tại các
bệnh viện năm 2007, cho thấy tần suất gen sinh ESBL thường gặp là CTX‐M và gen sinh AmpC
là DHA(7).
Trang 5Khi phân tích kiểu gen ESBL và AmpC của
Enterobacteriaceae ở người khỏe mạnh trong công
đồng tại Tp. Hồ Chí Minh chỉ có 75% chủng có
kiểu gen ESBL và 20% chủng có kiểu gen AmpC
khi so sánh với kiểu hình.
Tần suất mang gen ESB: mang 1 gen CTX‐M
là 28,3%, TEM là 3,5%, SHV là 1%; mang 2 gen
TEM, CTX‐M là 33,6%, SHV, CTX‐M là 6,2% và 3
gen SHV, TEM, CTX‐M là 2,7%.
Tần suất mang gen AmpC: mang 1 gen DHA
là 8,6%, CYM là 2,9% và mang 2 gen FOX/CYM
là 8,6%.
Tiếp tục nghiên cứu về các kiểu gen dạng
biến thể của ESBL và AmpC.
LỜI CẢM ƠN
Nghiên cứu này được thực hiện dưới sự tài
trợ của Tổ chức Y tế thế giới khu vực Châu Á‐
Thái Bình Dương (WHO ‐ Western Pacific
Region) ‐ Văn phòng đại diện WHO tại Hà Nội,
Việt Nam.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Kolar M, Bardon J, et al (2010). ESBL and AmpC β‐
lactamase‐producing Enterobacteriacae in poultry in the
Czech Repulic. Veterinarni Medicina. 55(3): 119–124.
2 Luvsansharav UO, Hirai I, Niki M, et al (2011). Analysis of risk factor for a high prevalence of Extended‐spectrum β – lactamase – producing Enterobacteriaceae in asymptomatic individuals in rural Thailand. Journal of Medical Microbiology. 60. 619‐624.
3 Nakano R, Nakano A, Abe M, Inoue M, Okamoto R (2012). Regional outbreak of CTX‐M‐2 b‐lactamaseproducing Proteus mirabilis in Japan. Journal of Medical Microbiology. 61. 1727–1735.
4 Pérez‐Pérez FJ, Hanson ND. (2002). Detection of Plasmid‐ Mediated AmpC‐Lactamase Genes in Clinical Isolates by Using Multiplex PCR. Journal of Clinical Microbiology. Vol. 40. No. 6. p. 2153–2162.
5 Schmitt J, Jacobs E, Schmidt H. (2007). Molecular characterization of extended‐spectrum β‐lactamases in Enterobacteriaceae from patients of two hospitals in Saxony. Germany. Journal of Medical Microbiology. 56. 241–249.
6 Trần Ngọc Lâm (2013). Tần suất người trên 18 tuổi mang
vi khuẩn sinh ESBL tại Tp. Hồ Chí Minh. Luận văn BSCKI. Đại học Y dược Tp. Hồ Chí Minh. Tr. 45‐34.
7 Wonkeun S. Hyukmin L. Kyungwon L. et al (2009). CTX‐ M‐14 and CTX‐M‐15 enzymes are the dominant type of extended‐spectrum β ‐lactamase in clinical isolates of Escherichia coli from Korea. Journal of Medical Microbiology. 58. 261–266.
Ngày nhận bài báo: 26/5/2014 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 19/6/2014 Ngày bài báo được đăng: 14/11/2014