Đề tài này được tiến hành nhằm xác định tỷ lệ biểu hiện EGFR và mối tương quan với biểu hiện Ki-67 trên carcinôm tuyến đại trực tràng bằng phương pháp nhuộm hóa mô miễn dịch. Nghiên cứu thực hiện trên 106 trường hợp carcinôm tuyến đại trực tràng được chẩn đoán tại Bộ môn Giải phẫu bệnh Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh từ tháng 10/2008 đến tháng 4/2009.
Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 Nghiên cứu Y học BIỂU HIỆN EGFR VÀ MỐI TƯƠNG QUAN VỚI Ki-67 TRÊN CARCINÔM TUYẾN ĐẠI TRỰC TRÀNG Phan Đặng Anh Thư*, Hứa Thị Ngọc Hà*, Nguyễn Sào Trung* TÓM TẮT Mục tiêu: Xác định tỷ lệ biểu EGFR mối tương quan với biểu Ki-67 carcinôm tuyến đại trực tràng phương pháp nhuộm hóa mơ miễn dịch Phương pháp đối tượng nghiên cứu: Mô tả cắt ngang Đối tượng nghiên cứu gồm 106 trường hợp carcinôm tuyến đại trực tràng chẩn đốn Bộ mơn Giải phẫu bệnh Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh từ tháng 10/2008 đến tháng 4/2009 Kết quả: Tỷ lệ dương tính với EGFR 61,3% Liên quan khơng có ý nghĩa thống kê với tuổi, giới, vị trí u, kích thước u, hình ảnh đại thể, loại mơ học, độ mô học, xâm nhập mạch máu Liên quan có ý nghĩa thống kê biểu EGFR với đặc điểm xâm lấn, xâm nhập mạch lymphô Liên quan khơng có ý nghĩa thống kê với biểu Ki-67 Kết luận: Biểu EGFR carcinôm tuyến đại trực tràng cao có liên quan với đặc điểm xâm lấn xâm nhập mạch lymphô Không liên quan với biểu Ki-67 Từ khóa: Carcinom tuyến đại trực tràng, biểu EGFR, biểu Ki-67 ABSTRACT EXPRESSION OF EGFR AND CORRELATION WITH Ki-67 EXPRESSTION IN COLORECTAL ADENOCARCINOMA Phan Dang Anh Thu, Hua Thi Ngoc Ha, Nguyen Sao Trung * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 15 - Supplement of No - 2011: 60 - 65 Objective: To determine the expression rate of EGFR and its correlation with expression of Ki-67 in colorectal adenocarcinoma Methods: A cross-sectional study with 106 cases of colorectal adenocarcinoma diagnosed at the department of pathology, University of Medicine and Pharmacy at Ho Chi Minh City The specimens were examined with H&E staining and immunohistochemical staining with monoclonal antibody EGFR and Ki-67 Results: In our study, the positive expression rate of EGFR is 61.3% In multivariate analysis, no correlation was found between expression of EGFR and some characteristics such as age, gender, tumor site, macroscopic findings, tumor grade, histological types and vascular invasion and expression of Ki-67 Correlation between expression of EGFR and depth of invasion and lymphatic invasion was statistically significant Conclusion: The expression rate of EGFR is rather high in colorectal adenocarcinoma and significantly correlated with depth of invasion and lymphatic invasion Key words: Colorectal adenocarcinoma, expression of EGFR, expression of Ki-67 ung thư, liệu pháp trúng đích làm giảm tỷ lệ tái ĐẶT VẤN ĐỀ phát tử vong Trong ung thư đại trực tràng, Liệu pháp trúng đích ung thư áp dụng liệu pháp trúng đích thụ thể phương pháp điều trị tiên tiến Đối với số yếu tố tăng trưởng thượng bì * Bộ mơn Giải phẫu bệnh - Đại học Y Dược TP HCM Tác giả liên lạc: ThS.BS Phan Đặng Anh Thư ĐT: Chuyên Đề Giải Phẫu Bệnh Email: phandanganhthu@yahoo.com 61 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 giới công nhận năm 2004(20) Thụ thể yếu tố tăng trưởng thượng bì gồm bốn thành viên HER-1 (EGFR), HER-2, HER-3 HER-4 EGFR hay HER-1, c-ErbB-1 thụ thể tyrosine kinase nằm bề mặt tế bào, protein xuyên màng có trọng lượng phân tử 170 kDa, kích hoạt gắn kết với ligand đặc hiệu yếu tố tăng trưởng (EGF) hay yếu tố chuyển dạng tăng trưởng anpha (TGF) EGFR bắt cặp với thành viên khác gia đình (bắt cặp khác loại) bắt cặp với (bắt cặp loại) Sau bắt cặp, miền nội bào phosphoryl hóa, kích hoạt hàng loạt dòng thác tín hiệu nội bào thơng qua hai đường tín hiệu PLC/PKC RAS/RAF/MEK/ERK(4,6) Theo nhiều nghiên cứu, EGFR dương tính ung thư đại trực tràng với tỷ lệ 2577%(10,14,17), tạo tiền đề cho nghiên cứu sâu điều trị trúng đích EGFR Mendelsohn cộng phát triển kháng thể kháng EGFR gồm mAb225 (C225, Cetuximab) mAb528 ghi nhận tác dụng mAb225 chuột thực nghiệm(16) Cetuximab định trường hợp carcinơm tuyến đại trực tràng có biểu mức EGFR (phát phương pháp nhuộm hóa mơ miễn dịch) Theo số nghiên cứu, thân EGFR yếu tố tiên lượng độc lập Ngoài ra, mức độ tăng sinh tế bào u yếu tố tiên lượng quan trọng Ki-67 kháng nguyên ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU - Đối tượng nghiên cứu 106 bệnh nhân chẩn đốn carcinơm tuyến đại trực tràng Bộ môn Giải Phẫu Bệnh Đại học Y dược Thành phố Hồ Chí Minh từ tháng 9/2008 đến tháng 5/2009 - Phương pháp nghiên cứu Mô tả cắt ngang - Các bước tiến hành - Thu thập số liệu - Các mẫu ung thư đại trực tràng cố định formol U lấy hai mẫu - Ghi nhận đầy đủ kiện lâm sàng bệnh nhân từ phiếu trả lời kết giải phẫu bệnh gồm: họ tên, tuổi, giới, vị trí u, hình ảnh đại thể (dạng lt, dạng sùi, dạng chít hẹp, dạng xâm nhiễm, dạng phối hợp) - Đọc kết tiêu nhuộm Hematoxyline Eosine + Loại mô học: Carcinôm tuyến không chế nhầy, carcinôm tuyến nhầy, carcinôm tuyến dạng tế bào mặt nhẫn + Độ mô học: Gồm biệt hóa rõ, vừa, theo phân loại AFIP + Đánh giá mức độ xâm lấn u - Khảo sát kết nhuộm hóa mơ miễn dịch EGFR, Ki-67 kính hiển vi quang học với bác sỹ giải phẫu bệnh có kinh nghiệm hóa mô miễn dịch để xác định hoạt động tế bào - Kỹ thuật nhuộm EGFR hóa mô miễn dịch Kháng nguyên Ki-67 biểu nhân tế - Sửa soạn tiêu vùi nến bào pha G1, S, G2 M chu trình tế bào, + Cắt mỏng mẫu mô – 5μm đặt vào lam có tráng silan trừ pha nghỉ Go Vì chúng tơi thực đề tài với mục đích xác định tỷ lệ biểu EGFR carcinơm tuyến đại trực tràng, góp + Ủ tiêu nhiệt độ 56oC - trước nhuộm phần nghiên cứu áp dụng điều trị nhắm trúng - Kháng thể sử dụng đích với EGFR đồng thời xác định mối tương quan với biểu Ki-67 ung thư 62 Kháng thể EGFR (clone 111.6) Neomarker, Mỹ, kháng thể đơn dòng pha sẵn Chuyên Đề Giải Phẫu Bệnh Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 - Nhuộm hóa mơ miễn dịch với EGFR - Khử peroxidase nội sinh H2O2 3% phút Nghiên cứu Y học - Ủ kháng thể đơn dòng pha lỗng 30-40 phút - Ủ kháng thể thứ hai có gắn biotin 30 phút - Ủ dung dịch Proteinase K phút - Ủ với kháng thể thứ 30 phút - Ủ polymer khuếch đại tín hiệu 30 phút - Ủ dung dịch DAB 5-10 phút - Ủ dung dịch phát tín hiệu 30 phút - Nhuộm tương phản với Hematoxyline - Ủ dung dịch DAB 10 phút - Nhuộm tương phản với Hematoxylin - Đánh giá EGFR carcinôm tuyến đại trực tràng Dựa vào tỷ lệ % tế bào u bắt màu màng bào tương cường độ bắt màu (ở độ phóng đại x 200)(9) Âm tính Khơng bắt màu màng bào tương bắt màu bào tương Dương tính 1(+): màng bào tương bắt màu nhạt > 0% tế bào u, bắt màu hoàn toàn phần màng bào tương - Ủ phức hợp streptavidine peroxydase 20 phút - Cách đánh giá Ki-67 carcinôm tuyến đại trực tràng Đánh giá biểu Ki-67 dựa vào tỷ lệ % nhân tế bào bắt màu cường độ bắt màu Sự biểu Ki-67 đánh giá tổng thể xem xét vùng khác (ở độ phóng đại x 200)(8) Tỷ lệ dương tính với Ki-67 tế bào u phân loại sau(15): - Dương tính 1(+) với 20-30% tế bào u bắt màu Ki-67 - Dương tính 2(+) với 40-50% tế bào u bắt màu Ki-67 - Dương tính 3(+) với 60% tế bào u bắt 2(+): màng bào tương bắt màu trung bình > 0% tế bào u, bắt màu hoàn toàn phần màng bào tương màu Ki-67 3(+): màng bào tương bắt màu đậm > 0% tế bào u, bắt màu hoàn toàn màng bào tương tạo hình ảnh mạng lưới hợp, phân tích xử lý phần mềm SPSS 11.5 Kỹ thuật nhuộm Ki-67 hóa mơ miễn dịch Biểu EGFR - Sửa soạn tiêu vùi nến + Cắt mỏng mẫu mơ – 5μm đặt vào lam có tráng silan + Ủ tiêu nhiệt độ 56oC - trước nhuộm - Xử lý số liệu Số liệu phiếu thu thập tổng KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Biểu EGFR Âm tính Dương tính 1(+) Dương tính 2(+) Dương tính 3(+) Tỷ lệ % 38,7 15,1 24,5 21,7 Khảo sát 106 trường hợp carcinôm tuyến đại - Kháng thể sử dụng trực tràng ghi nhận, tỷ lệ dương tính với EGFR Kháng thể MIB-1 (Ki-67) DakoCytomation, Đan Mạch, với độ pha lỗng 1/25 61,3%, dương tính 3(+) chiếm 21,7% - Nhuộm hóa mơ miễn dịch với Ki-67 hợp) Những trường hợp âm tính (khơng bắt - Khử peroxidase nội sinh H2O2 3% phút (23 trường hợp), dương tính 2(+) 24,5% (26 trường hợp), dương tính 1(+) 15,1% (16 trường màu màng bào tương, bắt màu bào tương) chiếm 38,7% (41 trường hợp) Chuyên Đề Giải Phẫu Bệnh 63 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 độ mô học xâm nhập mạch máu biểu Ki-67 Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê biểu EGFR độ xâm lấn xâm nhập mạch lymphô Biểu Ki-67 Bảng 2: Biểu Ki-67 Dương tính 1(+) Dương tính 2(+) Dương tính 3(+) Tỷ lệ % 17 19 64 BÀN LUẬN Tỷ lệ dương tính với Ki-67 nghiên cứu 100% Tế bào u dương tính với Ki-67 dao động từ 20-90%, trung bình 61,4% tế bào Trong tỷ lệ dương tính tế bào u phân loại sau: - Dương tính 1(+) với 20-30% tế bào u bắt màu Ki-67 17% - Dương tính 2(+) với 40-50% tế bào u bắt màu Ki-67 19% - Dương tính 3(+) với 60% tế bào u bắt màu Ki-67 64% Liên quan biểu EGFR với đặc điểm giải phẫu bệnh biểu Ki-67 Đặc điểm Nam Giới Nữ 50 Đại tràng Vị trí Trực tràng Loét Chồi sùi Dạng đại thể Vòng siết Xơ chai Phối hợp Khơng chế nhầy Loại mơ học Chế nhầy Biệt hóa rõ Độ mơ học Biệt hóa vừa Biệt hóa Tại chỗ Độ xâm lấn Lớp Thanh mạc Xâm nhập Mạch máu mạch máu, mạch lymphô Mạch lymphô >40% Biểu Ki-67 40% nhóm u dương tính với EGFR 78,1% nhóm u âm Chuyên Đề Giải Phẫu Bệnh Nghiên cứu Y học tính với EGFR 91,7% Sự khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê (p = 0,08) Kết phù hợp nghiên cứu Hemming(11), Jong(13) Nghiên cứu Rego(18) lại cho thấy có mối liên quan biểu EGFR Ki-67 KẾT LUẬN Qua nghiên cứu biểu EGFR 106 trường hợp carcinôm tuyến đại trực tràng rút kết luận sau: - Tỷ lệ dương tính với EGFR 61,3% Trong dương tính 3(+) 21,7%, dương tính 2(+) 24,5%, dương tính 1(+) 15,1%, âm tính 38,7% - Khơng có mối liên quan biểu EGFR với tuổi, giới, vị trí u, hình ảnh đại thể, loại mô học, độ mô học, xâm nhập mạch máu - Liên quan có ý nghĩa thống kê biểu EGFR với đặc điểm xâm lấn, xâm nhập mạch lymphơ - Khơng có mối liên quan biểu EGFR với biểu Ki-67 TÀI LIỆU THAM KHẢO Antonacopoulou AG, Tsamandas AC, Petsas T, Liava A, Scopa CD, Papavassiliou AG, Kalofonos HP (2008) “EGFR, HER-2 and COX levels in colorectal cancer”, Histopathology 53:698-706 Atkins D, Reiffen KA, Tegtmeier CL, Winther H, Bonato MS, Stokel S (2004) “Immunohistochemical Detection of EGFR in Paraffin-embeddedTumor Tissues: Variation in Staining Intensity Due to Choice of Fixative and Storage Time of Tissue Sections”, Journal of Histochemistry & Cytochemistry, Volume 52(7): 893–901, Azria D, Bibeau F, Barbier N, Zouhair A, Lemanski C, Rouanet P, Ychou M, Senesse P, Ozsahin M, Dubois JB, Thezenas S (2005) “Prognostic impact of epidermal growth factor receptor (EGFR) expression on loco - regional recurrence after preoperative radiotherapy in rectal cancer”, BMC Cancer 5:62 Box C, Peak J, Rogers S, Eccles S, “EGFR signaling in invasion angiogenesis and metastasis”, Cancer drug discovery and development: EGFR signaling networks in cancer therapy, pp 257276 Buffet W, Geboes KP, Dehertogh G, Geboes K (2008) “EGFRimmunohistochemistry in colorectal cancer and non- small cell lung cancer: comparison of commercially available EGFRantibodies”, Acta Gastroenterol Belg 71: 213-8 Burgess AW, Garrett TPJ, “EGF receptor family extracellular domain structures and functions”, Cancer drug discovery and development: EGFR signaling networks in cancer therapy, pp3-14 Cheirsilpa A, Ruangvejvorachai P, Karalak A, Sangprakarn S, Pummai S, Sangrajrang S (2007) “Determination of epidermal growth factor receptor (EGFR) in patients with colorectal cancer (institutional series)”, Cancer Therapy, 5:137-142 65 Nghiên cứu Y học 10 11 12 13 14 15 66 Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 Cohen T, Prus D, Shia J, Abu-Wasel B, Pinto MG, Freund HR, Stojadinovic A, Grakov A, Peretz T, Nissan A (2008) “Expression of p53, p27 and Ki-67 in colorectal cancer patients of various ethnic origins: clinical and tissue microarray based analysis”, J Surg Oncol, 97: 416-422, Wiley- Liss, Inc Dako, “The EGFR pharmDx TM Interpretation Manual”, 2007 El-Rayes BF, LoRusso PM (2004) “Targeting the epidermal growth factor receptor”, British Journal of Cancer, 91, 418-424 Hemming AW, Davis NL, Kluftinger A, Robinson B, Quenville NF, Liseman B, LeRiche J (1992) “Prognostic markers of colorectal cancer: An evaluation of DNA content, epidermal growth factor receptor, and Ki-67”, Journal of Surgical Oncology 51: 147-152 Italiano A, Saint-Paul MC, Caroli-Bosc FX, Franỗois E, et al (2005) Epidermal growth factor receptor (EGFR) status in primary colorectal tumors correlates with EGFR expression in related metastasis sites: Biological and clinical implications”, Annals of Oncology 16: 1503-1507 Jong KPD, Stellema R, Karrenbeld A, Koudstaal J, Annette S et al (1998) “Clinical relevance of transforming growth factor á, epidermal growth factor receptor, p53, and Ki-67 in colorectal liver metastases and corresponding primary tumors”, Hepatology 28: 971-979 Kang YJ, Jung CK, Choi YJ, Lee KY, Kim HJ, Kang WK (2010) “Clinicopathologic significances of EGFR expression at invasive front of colorectal cancer”, The Korean Journal of Pathology 44: 1621 Kubota Y, Petras R, Easley K, et al (1992) “Ki-67 – determined growth fraction versus standard staging and grading parameters in colorectal carcinoma”, Cancer Vol 70, No.11 16 17 18 19 20 21 Mendelsohn J (2001) “The epidermal frowth factor receptor as a target for cancer therapy”, Endocrine-related Cancer 8:3-9 Normanno N, Bianco C, De Luca A, Strizzi L, Gallo M, Mancino M, Salomon DS “Expression and prognostic significance of the EGFR in solid tumors”, Cancer drug discovery and development: EGFR signaling networks in cancer therapy, pp 221-234 Rego RL, Foster NR, Smyrk TC, Le M, O'Connell MJ, Sargent DJ, Windschitl H, Sinicrope FA (2010) “Prognostic effect of activated EGFR expression in human colon carcinomas: comparison with EGFR status”, Bristish Journal of Cancer, 102, 165-172 Spano JP, Lagorce C, Atlan D, Milano G, Domont J, Benamouzig R, Attar A, Benichou J, Martin A, Morere JF, Raphael M, Penault-Llorca F, Breau JL, Fagard R, Khayat D, Wind P (2005) “Impact of EGFR expression on colorectal cancer patient prognosis and survival”, Annals of Oncology 16: 102-108 Stintzing S, Heinemann V, Jung A, Moosmann N, Hiddemann W, Kirchner T (2009) “The treatment of colorectal carcinoma with monoclonal antibodies”, Deutsches Arzteblatt International 106(12):202-6 Theodoropoulos GE, Karafoka E, Papailiou JG, Stamopoulos P, Zambirinis CP, Bramis K, Panoussopoulos SG, Leandros E, Bramis J (2009) “p53 and EGFR expression in colorectal cancer: A reappraisal of “old” tissue marker in patients with long followup”, Anticancer 29:785-791 Chuyên Đề Giải Phẫu Bệnh ... Rego(18) lại cho thấy có mối liên quan biểu EGFR Ki-67 KẾT LUẬN Qua nghiên cứu biểu EGFR 106 trường hợp carcinôm tuyến đại trực tràng rút kết luận sau: - Tỷ lệ dương tính với EGFR 61,3% Trong dương... bắt màu Ki-67 19% - Dương tính 3(+) với 60% tế bào u bắt màu Ki-67 64% Liên quan biểu EGFR với đặc điểm giải phẫu bệnh biểu Ki-67 Đặc điểm Nam Giới Nữ 50 Đại tràng Vị trí Trực tràng. .. Đánh giá EGFR carcinôm tuyến đại trực tràng Dựa vào tỷ lệ % tế bào u bắt màu màng bào tương cường độ bắt màu (ở độ phóng đại x 200)(9) Âm tính Khơng bắt màu màng bào tương bắt màu bào tương Dương