Nghiên cứu được thực hiện với mục tiêu khảo sát độc tính cấp, bán trường diễn và ảnh hưởng trên sự sinh sản của tảo xanh spirulina platensis giàu selen trên chuột nhắt trắng. Mời các bạn cùng tham khảo bài viết để nắm rõ nội dung chi tiết của đề tài nghiên cứu này.
Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 Nghiên cứu Y học KHẢO SÁT ĐỘC TÍNH CẤP, BÁN TRƯỜNG DIỄN VÀ ẢNH HƯỞNG TRÊN SỰ SINH SẢN CỦA TẢO XANH SPIRULINA PLATENSIS GIÀU SELEN TRÊN CHUỘT NHẮT TRẮNG Lê Tố Uyên*, Lưu Thị Mỹ Ngọc*, Trương Thị Thu Trang*, Lưu Huỳnh Ngọc Dũng*, Lưu Cơng Thịnh*, Lê Thanh Bình*, Nguyễn Khánh*, Nguyễn Tiến Thịnh*, Lê Võ Hoàng Yến*, Trần Ngọc Thanh Ngân*, Phan Phi Anh*, Nguyễn Thế Thiện Phương*, Trần Thị Vân Anh*, Võ Phùng Nguyên*, Lê Văn Lăng** TÓM TẮT Mục tiêu: Trong nghiên cứu này, độc tính cấp, bán trường diễn ảnh hưởng sinh sản tảo xanh Spirulina giàu Selen khảo sát chuột nhắt trắng Phương pháp: Chuột theo dõi 72 sau cho uống tảo xanh Spirulina giàu selen để xác định độc tính cấp Độc tính bán trường diễn tác động chức sinh sản tảo xanh giàu selen tương ứng nghiên cứu tháng Các thơng số huyết học, sinh hóa, giải phẫu đại thể, vi thể gan, thận xác định để đánh giá độc tính bán trường diễn Tỉ lệ chuột mang thai thành công, số chuột trung bình chuột cái, thay đổi quan sinh sản chuột cha mẹ ghi nhận Hành vi, thể trạng chung tốc độ tăng trưởng thể trọng chuột theo dõi Kết quả: Tất chuột sống khơng có biểu độc tính sử dụng liều cao thử nghiệm tảo spirulina giàu selen 6g/kg Trong nghiên cứu độc tính bán trường diễn, khơng có thay đổi bất thường số sinh hóa giải phẫu bệnh sau tháng sử dụng tảo spirulina giàu selen liều 0,6 g/kg/ngày Trong nghiên cứu độc tính sinh sản, chuột cha mẹ khơng có biến đổi phát giải phẫu quan sinh sản tinh trùng đồ số lượng chuột trung bình so với lơ chứng Chuột có tốc độ tăng trưởng thể trọng bình thường, khơng có biểu bất thường quan sát biểu độc tính selen Kết luận: Không phát dấu hiệu độc tính chuột nhắt sau tháng uống tảo spirulina giàu selen 0,6 g/kg/ngày Ở liều, tảo spirulina giàu selen khơng gây biến đổi phát quan sinh sản chuột cha mẹ hình thành phát triển thể trọng chuột 01 tháng sau sanh Từ khóa: tảo Spirulina giàu selen, độc tính sinh sản, độc tính cấp, độc tính bán trường diễn ACUTE, SUBCHRONIC AND REPRODUCTIVE TOXICITY OF SELENIUM-ENRICHED SPIRULINA BY ORAL IN MICE Le To Uyen, Luu Thi My Ngoc, Truong Thi Thu Trang, Luu Huynh Ngoc Dung, Luu Cong Thinh, Le Thanh Binh, Nguyen Khanh, Nguyen Tien Thinh, Le Vo Hoang, Yen, Tran Ngoc Thanh Ngan, Phan Phi Anh, Nguyen The Thien Phuong, Tran Thi Van Anh, Vo Phung Nguyen, Le Van Lang * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 15 - Supplement of No - 2011: 531 - 537 Objectives: In this study, the acute, subchronic and reproductive toxicity of selenium-enriched spirulina was investigated in mice by oral administration Methods: Mice were observed for 72 hours after given orally selenium-enriched spirulina to determine acute toxicity The subchronic and reproductive toxicity of this preparation was also investigated in for and months, * Bộ môn Dược lý, **Bộ môn Bào chế – Khoa Dược, ĐH Y Dược Tp Hồ Chí Minh Tác giả liên hệ: DS Lưu Thị Mỹ Ngọc ĐT: 01269979131 Email: myngocluu30@gmail.com Chuyên Đề Dược Khoa 531 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 respectively Biochemical and haematological indices were determined and liver and kidney histopathology was assessed in subchronic toxicity The rate of female mice had successful delivery, the mean of offsprings per female, changes in reproductive organs of parental mice were recorded The behavior, weight and development status of offsprings also observed for 30 days Results: All mice were alive and there had no signs of toxicity were observed at the highest dose of selenium enriched spirulina could be tested g/kg In the subchronic toxicity study, there were no abnormal changes in biochemical and haematological indices and histopathological examination after two months treated with selenium-enriched spirulina 0.6 g/kg/day In the reproductive toxicity study, parental mice had no detectable changes of reproductive organs anatomy as well as map of semen and sperm and the mean of offspring when were compared with control group Their offspring had normal body weight and growth status and did not show observed abnormal signs as well as toxicity of selen Conclusions: There are no toxicity signs detectable in mice after two months oral adminstration 0.6 g/kg of selenium enriched spirulina At the same dose, slenenium enriched spirulina, there are no detectable changes in the reproductive organs of parental mice as well as the formation and development of their offspring one months after delivery Keywords: selenium enriched spirulina, reproductive toxicity, acute toxicity, subchronic toxicity ĐẶT VẤN ĐỀ Selenium (Selen) siêu vi lượng thiết yếu người Vai trò Selen thể sống chủ yếu để tổng hợp enzyme Glutathione peroxidase (GSH-Px), men hoạt động với Vitamin E nhằm ngăn ngừa bảo vệ màng tế bào khỏi gốc tự tổn thương oxy hóa Cơng dụng phòng trị bệnh Selen chứng minh từ năm 1941 Thuốc chứa Selen dùng hỗ trợ cho bệnh nhân phát đồ điều trị bệnh ung thư, nhiễm khuẩn, virus HIV-AIDS Selen dùng ngồi da, tóc, kính áp tròng,…do có tác dụng kháng khuẩn, chống viêm da, trị gàu Do đó, có nhiều cơng trình tiến hành tìm kiếm hoạt chất cho nhóm Selen hữu theo ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Động vật thử nghiệm Chuột nhắt trắng giống Swiss albino hai phái, thể trọng chuột từ 25 - 30 gam cung cấp Viện Vắc-xin Sinh phẩm Y tế Nha Trang Chuột nuôi ổn định ngày trước tiến hành thử nghiệm Trong suốt trình thử nghiệm chuột cung cấp đầy đủ thức ăn (thức ăn viên giá) nước uống Hóa chất sử dụng Bột tảo Spirulina giàu Selen hữu (Se-sa) (135 mcg Se/1g tảo) nguyên liệu bào chế dạng nang 25 mcg 50 mcg, chất chống đông EDTA, dung dịch formol 10 % pha đệm Phosphat, dịch ni cấy tinh trùng có tính chất giống dịch âm đạo (Do Khoa Hiếm muộn Bệnh viện Từ Dũ cung cấp) đường tổng hợp hóa học sinh học Trong Tiến hành nhiều cơng trình nghiên cứu Khảo sát độc tính cấp(2) Dựa vào liều dùng người 200 mcg Se/ngày/50 kg hàm lượng Selen có tảo 135 mcg Se/g, chúng tơi tiến hành khảo sát độc tính Selen liều cao tăng dần để xác định liều LD0 liều tối đa không gây chết thú vật liều LD100 liều tối thiểu gây chết 100% thú vật thử nghiệm Spirulina platensis giàu Selen Với mục tiêu làm sở cho nghiên cứu sử dụng lâu dài tảo xanh Spirulina giàu Selen lâm sàng chúng tơi tiến hành khảo sát độc tính cấp, độc tính bán trường diễn ảnh hưởng chúng sinh sản chuột nhắt tảo xanh giàu Selen 532 Chuyên Đề Dược Khoa Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 Chuột chia ngẫu nhiên thành lô, lô 10 với điều kiện cho uống 0,2 ml/10g thể trọng Chuột lô chứng cho uống nước cất lô thử uống bột tảo giàu Selenium g/kg Theo dõi chuột sau cho uống 72 hoạt động, hành vi bất thường, số lượng chuột chết tiếp tục theo dõi 14 ngày Chuột sau chết sau 14 ngày thử nghiệm hy sinh, mổ để quan sát đại thể xem bất thường xảy gan, thận, tim phổi Khảo sát độc tính bán trường diễn Chuột hai phái tính ni riêng lẻ, chia ngẫu nhiên thành lô, cho sử dụng chất 60 ngày với điều kiện cho uống 0,1 ml/10g thể trọng/ngày, lô chứng uống nước cất, lô thử uống bột tảo giàu selen với liều 1/20 – 1/10 liều LD50 1/10 liều tối đa sử dụng không gây độc cho chuột thử nghiệm độc tính cấp Kết thúc thử nghiệm, chuột lựa chọn ngẫu nhiên hai phái tính 20 lô hy sinh để thực xét nghiệm cơng thức máu, sinh hóa chức gan thận giải phẫu bệnh Các xét nghiệm huyết học, sinh hóa đo Phòng Sinh Hóa Và Huyết Học Bệnh viện Chợ Rẫy Các xét nghiệm đại thể, vi thể mẫu sinh thiết gan thận thực Bộ môn Giải Phẫu Bệnh-Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh Khảo sát độc tính sinh sản(1,2) Số chuột sử dụng tảo giàu selen 60 ngày lại sau kết thúc thử nghiệm độc tính bán trường diễn lựa chọn ngẫu nhiên để ghép sinh sản với tỷ lệ ghép “1 đực: cái” bao gồm: Lô chứng: 11 đực – 22 cái, uống nước cất Lô thử: 18 đực – 36 cái, uống bột tảo giàu selen 0,6 mg/kg Chuột thời gian ghép cặp, mang thai sau sinh tiếp tục cho dùng nước bột tảo ngày kết thúc thử nghiệm 30 ngày sau sinh chuột tách mẹ Chuyên Đề Dược Khoa Nghiên cứu Y học Trên chuột cha mẹ: Chọn ngẫu nhiên 10 chuột đực lô chứng lô thử sau kết thúc thử nghiệm, tiến hành gây mê giải phẫu thu mẫu Khảo sát quan sinh sản: quan sát đại thể, vi thể, khối lượng quan sinh sản,… Trên chuột cha: giải phẫu đại thể, vi thể tinh hoàn, lấy tinh dịch từ mào tinh, ống dẫn tinh túi tinh để làm tinh trùng đồ Trên chuột mẹ: Theo dõi tỉ lệ chuột mẹ sinh sản được, thời gian từ lúc ghép cặp đến lúc sinh, số lượng trung bình lần sinh, sau thử nghiệm giải phẫu đại thể, vi thể buồng trứng, tử cung Các mẫu xét nghiệm tinh hoàn, buồng trứng, tử cung thực Bộ môn Giải Phẫu Bệnh - Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh Các mẫu mào tinh, ống dẫn tinh, túi tinh cho vào dung dịch nuôi cấy tinh trùng xét nghiệm Khoa Hiếm Muộn, Bệnh viện Từ Dũ Trên chuột con: Quan sát hình thể, hành vi chức bình thường chuột con, theo dõi thể trọng ngẫu nhiên 30 chuột ngày thời gian 30 ngày Phân tích thống kê liệu Dữ liệu trình bày dạng số trung bình ± SEM Sự khác biệt nhóm phân tích phương pháp Kruskal-Wallis sau Mann-Whitney test với phần mềm Minitab 14.0, p< 0,05 cho khác có ý nghĩa thống kê Đồ thị vẽ phần mềm SigmaPlot 10.0 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Độc tính cấp Liều tối đa qua đầu kim cho uống tảo xanh Spirulina g/Kg thể trọng tương đương với 8,1 mcg Se/0,2 ml/ 10 g thể trọng tức 40500 mcg Selen/ 50 kg thể trọng, cao gấp 202,5 lần liều sử dụng người (200 mcg selen/50 kg thể trọng) Ở liều khảo sát cao này, chuột khỏe mạnh, hoạt động bình thường, khơng có 533 Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 Nghiên cứu Y học dấu hiệu bất thường xảy ra, khơng có chuột chết vòng 48 Thể trọng chuột 14 ngày sau cho uống tảo giàu selen không khác lơ chứng lơ thử (khơng trình bày kết quả) Giải phẫu đại thể tất chuột sau 14 ngày dùng tảo giàu selen không phát bất thường gan, thận, tim phổi chuột hai lơ Do đó, chúng tơi chọn liều để tính liều khảo sát độc tính bán trường diễn độc tính sinh sản Độc tính bán trường diễn Về thể trạng chung Chuột khơng có biểu hành vi bất thường, phát triển bình thường Khơng quan sát thấy dấu hiệu độc tính selen chuột Tốc độ tăng trọng chuột không khác biệt lô chứng lô dùng tảo spirulina giàu selen (số liệu không trình bày) Về huyết học Các số hồng cầu Bảng Các số hồng cầu lô chứng lô thử chuột đực chuột sau tháng thử nghiệm độc tính bán trường diễn RBC (x10 mm ) Chứng (n = 7) 9,37 ± 0,43 Chuột đực Thử(n =8) 9,47 ± 0,13 Chứng (n = 6) 10,33 ±0,39 Chuột Thử(n = 7) 9,96 ± 0,18 Giới tính Lơ Hemoglobin Hematocrit MCV (g/dl) (%) (µm3) 136,7 ± 4,9 47,81 ± 3,3 50,8 ± 157,14 ±1,2 44,767 ± 0,27 46,63 ± 1,3 167 ± 3,7 49,77 ± 1,1 49,37 ± 1,2 163,29 ± 2,3 48,23 ± 1,1 48,51 ± 1,4 Khơng có khác biệt số hồng cầu chuột đực chuột lô chứng lô MCH MCHC RDW (pg) (g/dl) (%) 16,43 ±0,14 333,9 ± 12 16,8 ± 0,71 16,21 ±0,33 348,3 ± 16,87 ± 0,36 16,233 ± 0,36 335,33 ± 2,2 17,43 ± 0,72 16,43 ± 0,34 339 ± 4,3 17,23 ±0,36 thử, hai phái tính (khoảng tin cậy 95%) trị số nằm khoảng bình thường Các số bạch cầu Bảng Các số bạch cầu lô chứng lô thử chuột đực chuột sau tháng thử nghiệm độc tính bán trường diễn Giới tính Chuột đực Chuột Lô Chứng (n = 7) Thử (n = 8) Chứng (n = 6) Thử (n = 7) Neutrophile WBC 3 (%) (x10 /mm ) 8,39 ± 1,1 32,8 ± 2,1 11,04 ± 0,81 34,3 ± 3,6 13,48 ± 2,2 23,68 ± 3,1 14,58 ± 1,5 18,1 ± 1,7 Chuột hai phái có số số lượng bạch cầu lô thử tăng so với lô chứng khác Lymphocyte (%) 60,63 ± 1,8 55,2 ± 3,5 71,02 ± 3,6 72,63 ± 2,8 Monocyte (%) Eosinophile (%) Basophile (%) 4,89 ± 0,78 8,79 ± 2,1 3,98 ± 0,52 7,39 ± 2,1 0,54 ± 0,12 0,3 ± 073 0,283 ± 0,091 0,241 ± 0,046 1,214 ± 0,11 1,5 ± 0,26 1,45 ± 0,17 1,67 ± 0,25 khơng có ý nghĩa thống kê với khoảng tin cậy 95% Các số tiểu cầu Bảng Các số tiểu cầu lô chứng lô thử chuột đực chuột sau tháng thử nghiệm độc tính bán trường diễn Giới tính Chuột đực Chuột Lô Chứng (n = 7) Thử (n = 8) Chứng (n = 6) Thử (n = 7) Plt (x103/mm3) 271 ± 49 380 ± 59 417 ± 124 377 ± 60 MPV (µm) 5,67 ± 0,17 5,53 ± 0,11 5,633 ± 0,14 5,714 ± 0,11 %PCT 0,16 ± 0,032 0,21 ± 0,031 0,233 ± 0,07 0,22 ± 0,037 PDW 13,13 ± 1,3 11,15 ± 0,26 11,97 ± 0,75 11,73 ± 0,35 Sự khác biệt số lượng tiểu cầu chuột lô chứng thử hai phái tính khơng có ý nghĩa thống kê, với khoảng tin cậy 95% 534 Chuyên Đề Dược Khoa Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 Nghiên cứu Y học Về chức gan thận Bảng Các số sinh hóa tế bào gan gan mật, nồng độ BUN Creatinin huyết chuột đực chuột sau tháng thử độc tính bán trường diễn Giới tính SGOT (U/L) Lơ SGPT (U/L) Bilirubin (T) Bilirubin (D) (mg/dl) (mg/dl) Bilirubin (I) (mg/dl) Creatinin huyết (mg/dl) 25,4 ± 1,8 0,75 ± 0,043 28 ± 1,7 0,8 ± 0,039 BUN (mg/dl) 0,28 ± 0,02 Chuột Lô chứng (n = 10) 174,3 ± 18 52,8 ± 3,9 0,4 ± 0,026 0,12 ± 0,013 đực Lô thử (n = 10) 119,8 ± 19 50,1 ± 5,1 0,37 ± 0,015 0,11 ± 0,013 0,26 ± 0,016 0,2183 ± 0,125 ± 0,018 0,1083 ± 0,0083 17,25 ± 1,5 0,86 ± 0,022 Chuột Lô chứng (n = 10) 202 ± 33 55,7± 4,8 0,012 Lô thử (n = 10) 164,8 ± 17 47,36 ± 2,6 0,2167± 0,0110,1231± 0,012 0,1077 ± 0,0077 22,36 ± 2,3 0,838 ± 0,029 Khơng phát có khác biệt hai lô tất số sinh hóa tế bào gan, gan mật với độ tin cậy 99% Quan sát đại thể giải phẫu vi thể Quan sát đại thể: Gan, thận, tim chuột láng, hồng, bình thường Dạ dày, ruột bình thường, khơng phát điểm xuất huyết Phổi trắng, Giải phẫu vi thể tế bào gan, thận tiến hành lô chứng (n=6) lơ thử (n=6) phái tính Mẫu mô gan (lô chứng lô thử): Các tế bào gan, khoảng cửa gan có hình thái bình thường Khơng có tượng hủy hoại tế bào gan Mẫu mô thận (lô chứng lô thử): cầu thận, ống thận mơ kẽ có hình thái bình thường hồng, bình thường Tác động sinh sản chuột cha - mẹ Tinh dịch đồ chuột cha Bảng6 pH tinh dịch, tỷ lệ sống, hình dạng bình thường, phân loại tinh trùng Lơ Tỷ lệ sống Hình dạng bình pH tinh dịch (%) thường (%) Lơ chứng (n = 10) Lô thử (n = 10) 35,3 ± 3,9 36,8 ± 3,3 7,4 ± 0,99 6,8 ± 0,88 7,52 ± 0,088 7,45 ± 0,056 Khơng phát có khác biệt hai lô tinh dịch đồ pH tinh dịch, hình dạng, số lượng sống sót tốc độ di động tinh trùng Phân loại tinh trùng dựa tốc độ di động Loại A (%) Loại B (%) Loại C (%) Loại D (%) 2,2 ± 0,65 10,3 ± 1,8 18,8 ± 68,7 ± 3,5 3,1 ± 0,74 10,3 ± 1,6 19,6 ± 1,7 67 ± 3,3 không bị thay đổi sau chuột dùng chất thử nghiệm khoảng tháng Khối lượng quan sinh sản chuột cha, mẹ Bảng Tỷ lệ thể trọng trung bình tinh hồn (TLTBTH) buồng trứng (TLTBBT) thể trọng trung bình chuột (TLTBC) Giới tính Chuột đực Chuột Lô Lô chứng (n = 10) Lô thử (n = 10) Lô chứng (n = 10) Lô thử (n =10) Thể trọng trung Thể trọng trung bình tinh hồn/ Tỷ lệ TLTBTH/TLTBC bình chuột (gam) buồng trứng (miligam) TLTBBT/TLTBC 50,35 ± 2,7 153,7 ± 8,6 3,079 ± 0,15 46,86 ± 1,9 138,5 ± 6,4 2,985 ± 0,15 37,97 ± 1,4 6,72± 0,46 0,1784 ± 0,012 36,61 ± 1,5 6,04 ± 0,52 0,1637 ± 0,011 Khơng có khác biệt có ý nghĩa thể trọng tinh hoàn chuột cha buồng trứng chuột mẹ lô chứng lô thử với khoảng tin cậy 95% Giải phẫu bệnh quan sinh sản chuột cha, mẹ - Giải phẫu đại thể: Chuyên Đề Dược Khoa Mỗi chuột đực có tinh hồn tròn, dẹt, mềm, màu hồng nhạt, bình thường Mỗi chuột có buồng trứng, tròn, nhỏ, màu hồng nhạt, tử cung ống nhỏ nối với phần cuối, thành bên có nhiều mạch máu Ở chuột mang thai thành ống nơi 535 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 phôi thai đậu vào phát triển thành chuột Khi chuột mang thai, kích thước ống to nhiều so với lúc không mang thai Thể trọng chuột - Giải phẫu vi thể: Tất 20 mẫu (bao gồm tinh hoàn không phân biệt bên) diện ống sinh tinh bình thường Trong đa số ống sinh tinh có tinh ngun bào (khơng phân biệt tinh bào Ι Π), tiền tinh trùng, tinh trùng trưởng thành Khơng có hình ảnh ống sinh tinh teo đét Khơng diện tế bào u mô chứng lẫn mô thử Tất mẫu buồng trứng diện nang trứng nhiều giai đoạn khác nhau, từ nang ngun thủy đến nang trưởng thành Khơng có tế bào u Vách tử cung nội mạc tử cung bình thường Một số mẫu có hình ảnh dãn rộng khơng có hình ảnh biến đổi nhân (3 mẫu lô thử mẫu lô chứng) Tỉ lệ chuột mang thai ghép cặp Chuột Số chuột sinh Lô chứng (n=22) Lô thử (n=36) 14 Tỉ lệ (%) 40,9 38,8 Tỉ lệ chuột mang thai lô chứng lô thử không khác (p>0,05) Số lượng chuột trung bình lần sanh chuột mẹ lô chứng lô thử Số chuột trung bình Chuột mẹ Chuột lần sinh Lô chứng (n= 9) 67 7.444 ± 0.669 Lô thử (n= 14) 72 5.071* ± 0.518 * p