Nghiên cứu được tiến hành nhằm phát hiện mối liên quan giữa đột biến gen ATP7B với ceruloplasmin huyết thanh và đồng niệu 24 giờ ở bệnh Wilson. Có 44 bệnh nhân được chẩn đoán xác định bệnh Wilson theo tiêu chuẩn của Ferenci mang đột biến gen được lựa chọn vào nghiên cứu. Kỹ thuật giải trình tự gen được sử dụng để xác định đột biến trên gen ATP7B.
TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC MỐI LIÊN QUAN GIỮA ĐỘT BIẾN GEN ATP7B VỚI CERULOPLASMIN HUYẾT THANH VÀ ĐỒNG NIỆU 24 GIỜ Ở BỆNH NHÂN WILSON Đỗ Thanh Hương, Trần Huy Thịnh, Nguyễn Văn Liệu, Trần Vân Khánh Trường Đại học Y Hà Nội Nghiên cứu tiến hành nhằm phát mối liên quan đột biến gen ATP7B với ceruloplasmin huyết đồng niệu 24 bệnh Wilson Có 44 bệnh nhân chẩn đốn xác định bệnh Wilson theo tiêu chuẩn Ferenci mang đột biến gen lựa chọn vào nghiên cứu Kỹ thuật giải trình tự gen sử dụng để xác định đột biến gen ATP7B Nghiên cứu phát bệnh nhân Wilson mang nhiều alen đột biến mang đột biến dạng vô nghĩa/ lệch khung gen ATP7B có nồng độ ceruloplasmin huyết thấp đồng niệu 24 cao nhóm mang alen đột biến nhóm mang dạng đột biến sai nghĩa/đột biến vùng 5'UTR Từ khóa: Bệnh Wilson, gen ATP7B, đột biến gen, alen đột biến I ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh Wilson biết đến bệnh thoái trung ương), mắt, da, thận, xương gây hóa gan - nhân đậu, tác giả Kinnear triệu chứng đa dạng lâm sàng Phân Wilson mô tả lần vào năm 1912 [1] tích mối liên quan kiểu gen ATP7B Cho đến nay, bệnh phát hầu hết biến đổi số sinh học giúp bác sỹ lâm quốc gia chủng tộc giới với sàng tiên lượng, chẩn đoán điều trị sớm tỷ lệ mắc 1/30.000 trẻ sinh Đây bệnh thể bệnh Wilson di truyền, đột biến gen lặn nhiễm sắc thể Ở Việt Nam, lần có hai trường thường 13q14.3, mã hóa gen ATP7B gây hợp bệnh nhân bị bệnh Wilson phát thiếu hụt enzyme ATPase typ P (P-ATPase) mang đột biến gen Arg778Leu vào năm 2010 [2] Gen ATP7B gồm 21 exon chiều dài [3] Các nghiên cứu sau tiếp tục xác định khoảng 80kb, mã hóa cho phân tử protein đột biến số vùng trọng điểm hoàn 1465 acid amin Gen có vai trò điều hòa thiện quy trình xác định đột biến gen ATP7B trình hấp thu, phân bố thải trừ đồng [4; 5] Như vậy, số lượng nghiên cứu đột biến thể Khi đột biến gen xảy gây gen ATP7B Việt Nam hạn chế chưa rối loạn q trình chuyển hóa đồng, đặc biệt có nghiên cứu đầy đủ mối tương quan giảm tiết đồng qua đường mật Lượng kiểu gen ATP7B kiểu hình bệnh Do đồng ứ lại thể lắng đọng dần vậy, đề tài tiến hành nhằm tìm mối liên quan tổ chức: gan, não (chủ yếu nhân xám đột biến gen ATP7B với nồng độ ceruloplasmin huyết đồng niệu 24 Địa liên hệ: Đỗ Thanh Hương - Bộ môn Nhi - Trường bệnh nhân Wilson Đại học Y Hà Nội Email: dothanhhuong@hmu.edu.vn II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP Ngày nhận: 27/7/2018 Ngày chấp thuận: 04/9/2018 38 Đối tượng TCNCYH 115 (6) - 2018 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC 44 bệnh nhân chẩn đốn xác định Kỹ thuật giải trình tự gen: Toàn 21 exon bệnh Wilson theo thang điểm Ferenci có gen ATP7B khuếch đại với cặp tổng số điểm WD ≥ 4, với biểu tăng mồi đặc hiệu [2] Các sản phẩm PCR enzym gan (AST ALT ≥ 60 UI/l), tăng lượng tiến hành giải trình tự trực tiếp máy ABI đồng nước tiểu 24 (≥ 100µg/ngày), 3100 Genetic Analyzer Kết thu thập ceruloplasmin huyết giảm (< 20mg/dl), xử lý phần mềm ABI PRISM có vòng Kayser-Fleischer phân loại thể lâm – Avant Data Collection, DNA Sequencing sàng theo tiêu chuẩn Hội Gan Mật quốc tế Analysis 5.2 BLAST NCBI TM 3100 năm 2003 [6; 7] Các bệnh nhân Các gen đột biến so sánh ngân điều trị Bệnh viện Bạch Mai Bệnh viện hàng gen: DNA (NG _ 008806) mRNA (NM Nhi trung ương _ 000053.3) Thời gian nghiên cứu: từ tháng năm 2012 đến tháng năm 2015 Xử lý số liệu Tính số tương quan r phương Phương pháp pháp Kendall, phân tích mối tương quan 3.1 Định lượng Cerulopasmin huyết test ANOVA (phần mềm SPSS 16.0) - Lấy huyết chống đông EDTA Đạo đức nghiên cứu Bệnh nhân hoàn toàn tự nguyện tham gia - Sử dụng phương pháp miễn dịch đo độ vào nghiên cứu có quyền rút khỏi nghiên đục máy hóa sinh tự động Beckman cứu không đồng ý tiếp tục tham gia vào Coulter AU5800, Khoa Hóa sinh, Bệnh viện nghiên cứu Bệnh nhân thông báo Nhi Trung ương kết xét nghiệm gen để giúp cho bác 3.2 Định lượng đồng niệu 24 - Lấy mẫu nước tiểu 24 - Sử dụng phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử sử dụng graphit (GF - AAS) máy tự động GFA - 7000A, khoa Sinh hóa, Bệnh viện Nhi Trung ương 3 Quy trình phân tích gen ATP7B Thực Trung tâm Nghiên cứu Gen Protein, Trường Đại học Y Hà Nội Lấy mẫu bệnh phẩm: 2ml máu tĩnh mạch chống đông EDTA Kỹ thuật tách chiết DNA từ máu ngoại vi: sỹ tư vấn di truyền lựa chọn phác đồ điều trị phù hợp Các thông tin cá nhân đảm bảo bí mật III KẾT QUẢ Nồng độ ceruloplasmin huyết thanh, nồng độ đồng niệu 24 số alen đột biến gen ATP7B Trong nghiên cứu này, 44 bệnh nhân Wilson mang đột biến, chia thành nhóm: bệnh nhân mang alen đột biến; 25 bệnh nhân mang alen đột biến; bệnh nhân mang alen đột biến bệnh nhân mang alen đột biến DNA tổng số tách chiết từ máu toàn 1.1 Mối tương quan nồng độ phần phenol-chloroform-isopropanol (25: ceruloplasmin huyết số alen đột 24: 1) biến TCNCYH 115 (6) - 2018 39 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC Hình Phân bố nồng độ ceruloplasmin huyết số alen đột biến Kết phân bố nồng độ ceruloplasmin huyết số alen đột biến cho thấy, nhóm bệnh nhân mang alen đột biến có nồng độ ceruloplasmin huyết trung bình thấp 1.2 Mối tương quan nồng độ đồng niệu 24 số alen đột biến Hình Phân bố nồng độ đồng niệu 24 số alen đột biến Kết hình cho thấy, nhóm bệnh nhân mang alen đột biến có hàm lượng đồng nước tiểu cao nhất, nhóm mang alen đột biến có hàm lượng đồng thấp Nồng độ ceruloplasmin huyết thanh, nồng độ đồng niệu 24 dạng đột biến gen ATP7B Nhóm nghiên cứu gồm 44 bệnh nhân, chia thành nhóm: nhóm có 23 bệnh nhân không mang alen đột biến vô nghĩa/lệch khung (chỉ mang đột biến sai nghĩa/đột biến vùng 5'UTR), nhóm có 10 bệnh nhân mang alen đột biến vơ nghĩa/lệch khung nhóm có 11 bệnh nhân mang alen đột biến vô nghĩa/lệch khung 1.2 Mối tương quan nồng độ ceruloplasmin huyết dạng đột biến 40 TCNCYH 115 (6) - 2018 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC Hình Phân bố nồng độ ceruloplasmin Hình Phân bố đồng niệu 24 dạng huyết dạng đột biến đột biến Nồng độ ceruloplasmin huyết trung Kết phân bố đồng niệu 24 với bình nhóm mang alen đột biến vô nghĩa/ dạng đột biến gen cho thấy hàm lượng lệch khung thấp nhất, nhóm mang đồng nước tiểu 24 nhóm mang alen đột biến vơ nghĩa/lệch khung nhóm alen đột biến dạng vơ nghĩa/lệch khung cao đột biến sai nghĩa/đột biến vùng 5' UTR nhóm mang alen đột biến khác 2.2 Mối tương quan đồng Hình ảnh minh họa bệnh nhân có đột biến thêm nucleotid: nước tiểu 24 dạng đột biến Người bình thường Bệnh nhân W37.00 Hình Hình giải trình tự gen bệnh nhân mã W37.00 Kết hình cho thấy, bệnh nhân có đột biến thêm nucleotid T vị trí 2712-2713, đột biến tạo nên mã kết thúc sớm vị trí acid amin số 905 IV BÀN LUẬN ceruloplasmin trung bình cao Nghĩa Kết từ hình cho thấy nồng độ nhóm bệnh nhân mang nhiều alen đột biến có ceruloplasmin huyết trung bình khác nồng độ ceruloplasmin huyết thấp nhóm bệnh nhân: nhóm bệnh nhóm mang alen đột biến Điều phù nhân mang alen đột biến có nồng độ hợp đặc điểm sinh học phân tử: xuất ceruloplasmin trung bình thấp nhất; nhóm nhiều biến dị/đột biến gen mang ATP7B cấu trúc tính chất protein alen đột biến TCNCYH 115 (6) - 2018 có nồng độ 41 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC thay đổi, gây ảnh hưởng đến chức nhóm mang alen đột biến vô nghĩa/lệch vận chuyển đồng Sự khác biệt có ý nghĩa khung có nồng độ ceruloplasmin thấp thống kê nhóm bệnh nhân mang nhóm mang alen đột biến vô nghĩa, alen đột biến với nhóm bệnh nhân khác biệt có ý nghĩa thống kê nhóm mang alen, alen alen đột biến (với Nghiên cứu nhóm bệnh nhi bị bệnh Wilson p 0,002; 0,001 0,001) Tác giả Ý cho kết quả: nhóm bệnh nhân mang Hyung - Doo Park (2010), nghiên cứu 71 bệnh alen đột biến vô nghĩa/lệch khung có nồng nhân thấy có mối tương quan nghịch có độ ceruloplasmin huyết trung bình ý nghĩa thống kê nồng độ ceruloplasmin thấp nhóm mang đột biến sai nghĩa [9] số alen đột biến [8] Như vậy, bệnh nhân Nghiên cứu khác Gromadzka G Ba Lan mang nhiều alen đột biến trình thấy khác dạng đột chuyển hóa đồng thể giảm làm biến: nhóm bệnh nhân mang alen đột biến cho nồng độ ceruloplasmin huyết dạng vô nghĩa/lệch khung dịch mã có nồng độ giảm lượng đồng tích lũy thể ceruloplasmin thấp nhóm mang alen đột tăng biến dạng vô nghĩa/lệch khung dịch mã, nồng Nồng độ đồng niệu nước tiểu 24 độ ceruloplasmin cao nhóm mang alen trung bình tỷ lệ thuận với số alen đột biến: đột biến sai nghĩa [10] Điều phù hợp nhóm mang alen đột biến có nồng độ đồng đặc điểm sinh học phân tử: đột biến vô nghĩa/ thấp nhất; nhóm mang alen đột biến có nồng lệch khung gen ATP7B đột biến nặng độ đồng cao (hình 2) Sự khác biệt có ý gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến chức nghĩa thống kê nhóm mang alen đột vận chuyển đồng Nồng độ ceruloplasmin biến alen đột biến (p = 0,035); nhóm máu giảm làm tăng nồng độ đồng tự mang alen đột biến alen đột biến (p < huyết lắng đọng đồng 0,001); nhóm mang alen đột biến alen quan đích gây nên biểu lâm sàng đột biến (p = 0,001); nhóm mang alen đột bệnh Wilson biến nhóm mang alen đột biến (p = 0,02) Khi so sánh tương quan nồng độ đồng (hình 2) So sánh nồng độ đồng nước niệu 24 nhóm đột biến, có tiểu 24h bệnh nhân Wilson Hàn Quốc nhóm mang alen đột biến dạng vơ nghĩa/ nhóm mang alen đột biến khác lệch khung với nhóm mang đột biến sai cho kết quả: bệnh nhân mang nghĩa/đột biến vùng 5'UTR có ý nghĩa thống alen đột biến có nồng độ đồng niệu cao nhất, kê với p = 0,01 (hình 4) Tác giả Gromadzka sau nhóm mang alen đột biến nhóm G nghiên cứu Ba Lan thấy nồng đồng không mang alen đột biến [8] Như vậy, bệnh nước tiểu 24 khác nhân mang nhiều alen đột biến nồng dạng đột biến: nhóm bệnh nhân mang alen độ đồng nước tiểu 24 cao đột biến dạng vô nghĩa/lệch khung dịch mã có Hình cho thấy nhóm bệnh nhân mang nồng độ đồng cao nhóm mang alen đột đột biến vơ nghĩa/lệch khung có nồng độ biến dạng vơ nghĩa/lệch khung dịch mã, nồng ceruloplasmin huyết thấp nhóm độ đồng thấp nhóm mang alen đột biến bệnh nhân mang dạng đột biến khác sai nghĩa [10] Như đề cập, bệnh bất 42 TCNCYH 115 (6) - 2018 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC thường enzyme typ P- ATPase Đây protein vận chuyển đồng từ gan tới the Menkes disease gene Nature Genet, 5, 327 - 337 quan đóng vai trò việc đào thải đồng Đỗ Thanh Hương, Nguyễn Văn Liệu, khỏi thể chủ yếu qua đường mật Khi Phan Tuấn Nghĩa, Nguyễn Thị Vân Anh (2010) Đột biến gen R778L bệnh nhân Wil- bệnh nhân mang đột biến vô nghĩa/lệch khung tạo mã kết thúc sớm làm protein bị cắt ngắn ảnh hưởng nghiêm trọng đến chức chuyển hóa đồng Lượng đồng khơng chuyển hóa, khơng đào thải ngồi qua đường mật ứ đọng gan, đồng tự tăng lưu thông máu tăng đào thải qua nước tiểu V KẾT LUẬN son Việt Nam Tạp chí Nhi khoa, 3, 231 - 235 Hồ Cẩm Tú, Tạ Minh Hiếu, Trần Vân Khánh, Tạ Thành Văn (2011) Xây dựng quy trình xác định đột biến gen ATP7B gây bệnh Wilson Tạp chí Nghiên cứu Y học, 74(3), 26 - 29 Nguyễn Thị Mai Hương, Ngô Diễm Ngọc, Nguyễn Phương Mai cộng (2013) Xác định đột biến gen ATP7B vùng hot-spots bệnh nhân Wilson Tạp chí Y Nghiên cứu phát bệnh nhân Wilson mang nhiều alen đột biến đột biến dạng vơ nghĩa/ lệch khung gen ATP7B có nồng độ ceruloplasmin huyết thấp đồng niệu 24 cao nhóm mang alen đột biến nhóm mang dạng đột biến sai nghĩa/đột biến vùng 5'UTR Lời cảm ơn Nghiên cứu thực với hỗ trợ kinh phí Đề tài cấp Bộ Y tế: “Nghiên cứu phát đột biến gen ATP7B gây bệnh Wilson” giúp đỡ cán Trung tâm nghiên cứu Gen - Protein, Trường Đại học Y Hà Nội TÀI LIỆU THAM KHẢO Wilson SAK (1912), Progressive lenticular degeneration: a familial nervous disease associated with cirrhosis of the liver Brain, 34, 295 – 507 học Việt Nam, 407(2), 132 - 135 Peter Ferenci (2006) Regional distribution of mutations of the ATP7B gene in patients with Wilson disease: impact on genetic testing Hum Genet, 120, 151 – 159 Ferenci P, Caca K, Loudianos G, Mieli -Vergani G, Tanner S, Sternlieb I et al (2003) Diagnosis and phenotypic classification of Wilson disease Liver International, 23, 139 - 142 Huyng-Doo Park, Huyn Kyung Park (2010) Association of ATP7B mutation detection rate with biochemical characteristics in Korean patients with Wilson disease Annals of clinical laboratory science, 40(1), 15 - 19 Emanuele Nicastro (2009) Genotypephenotype correlation in Italian children with Wilson's disease Hepatology, 50, 555 - 561 10 Gromadzka G, Schmidt HJ, Genschel J et al (2005) Frameshift and nonsense mutations in the gene for ATP7B are associa- Bull PC, Thomas G R, Forbes J et al ted with severe impairment of cooper metabolism and with an early clinical manifestation (1993) The Wilson disease gene is a putative copper transporting P-type ATPase similar to of Wilson's disease Clinical Genetics, 68, 524 - 532 TCNCYH 115 (6) - 2018 43 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC Summary GENOTYPE AND SERUM CERULOPLASMIN-URINARY COPPER 24-HOUR CORRELATION IN WILSON DISEASE PATIENTS The study was performed in order to identify the correlation between genotype and serum ceruloplasmin -urinary copper 24-hour in Vietnamese patients diagnosed with Wilson disease Fourty four patients diagnosed with Wilson disease based on Ferenci’s criteria DNA were included in this study; samples from these patients were analyzed by direct sequencing to identify ATP7B mutation The results: Patients with more than mutant alleles have lower serum ceruloplasmin and higher urinary copper 24-hour concentration than patients with mutant allele Patients with nonsense/frameshift mutant alleles have lower serum ceruloplasmin concentration than patients with nonsense/frameshift mutant allele or missense/5'UTR regional mutant alleles Patients with nonsense/frameshift mutant alleles have higher urinary copper 24-hour concentration than patients with nonsense/frameshift mutant allele or missense/5'UTR regional mutant alleles Keywords: Wilson disease, ATP7B gene, mutation, mutant allele 44 TCNCYH 115 (6) - 2018 ... ceruloplasmin Hình Phân bố đồng niệu 24 dạng huyết dạng đột biến đột biến Nồng độ ceruloplasmin huyết trung Kết phân bố đồng niệu 24 với bình nhóm mang alen đột biến vô nghĩa/ dạng đột biến gen. .. alen đột biến cho thấy, nhóm bệnh nhân mang alen đột biến có nồng độ ceruloplasmin huyết trung bình thấp 1.2 Mối tương quan nồng độ đồng niệu 24 số alen đột biến Hình Phân bố nồng độ đồng niệu 24. .. cá nhân đảm bảo bí mật III KẾT QUẢ Nồng độ ceruloplasmin huyết thanh, nồng độ đồng niệu 24 số alen đột biến gen ATP7B Trong nghiên cứu này, 44 bệnh nhân Wilson mang đột biến, chia thành nhóm: bệnh