Nghiên cứu mối liên quan giữa đột biến trong vùng điều khiển hệ gen ty thể và bệnh ung thư phổi

i Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT ****************** TRẦN MẠNH HÀ NGHIÊN CỨU MỐI LIÊN QUAN GIỮA ĐỘT BIẾN TRONG VÙNG ĐIỀU KHIỂN HỆ GEN TY THỂ VÀ BỆNH UNG THƢ PHỔI LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC Hà Nội - 2013 ii Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT **************** TRẦN MẠNH HÀ NGHIÊN CỨU MỐI LIÊN QUAN GIỮA ĐỘT BIẾN TRONG VÙNG ĐIỀU KHIỂN HỆ GEN TY THỂ VÀ BỆNH UNG THƢ PHỔI Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60 42 01 14 LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. LÊ QUANG HUẤN Hà Nội – 2013 iii Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ LỜI CẢM ƠN Trước hết, em xin bày tỏ lòng biết ơn và lời cảm ơn trân trọng nhất tới các bệnh nhân đã hiến mẫu cho nghiên cứu này. Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, em xin chân thành cảm ơn PGS.TS. Lê Quang Huấn đã tạo điều kiện cũng như tận tình chỉ bảo và động viên trong suốt thời gian thực hiện luận văn tốt nghiệp. Em xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ hết sức quý báu cả về kiến thức lẫn tinh thần từ tập thể phòng Công nghệ tế bào động vật, Viện Công nghệ sinh học. Trong suốt thời gian khóa luận, em đã nhận được sự giúp đỡ vô cùng quí báu của TS.BS Đào Huyền Quyên, Khoa Sinh Hóa Bệnh viện Bạch Mai. Em xin được gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới chị. Nhân dịp này em cũng xin bày tỏ lòng biết ơn tới các thầy, cô, bạn bè và gia đình đã chỉ dẫn và giúp đỡ em trong suốt thời gian qua. Hà Nội, ngày 9 tháng 12 năm 2013 Học viên Trần Mạnh Hà iv Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ MỤC LỤC Trang LỜI MỞ ĐẦU 1 1. Đặt vấn đề 1 2. Mục tiêu 2 3. Nội dung 2 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1.1. Giới thiệu chung về ty thể 3 1.1.1. Cấu trúc ty thể 4 1.1.2. Chức năng của ty thể 5 1.1.3. Hệ gen ty thể 6 1.1.4. Sự phân chia ty thể và quá trình sao chép gen ty thể 9 1.2. Di truyền gen ty thể và đột biến gen ty thể liên quan đến bệnh học 11 1.2.1. Di truyền gen ty thể 11 1.2.2. Đột biến gen ty thể liên quan đến bệnh học 12 1.3. Mối liên quan giữa ung thư phổi và đột biến gen ty thể 14 1.3.1. Giới thiệu chung về ung thư 14 1.3.1.1. Định nghĩa ung thu và dịch tễ học ung thư 14 1.3.1.2. Cơ chế và nguyên nhân gây ung thư 15 1.3.2. Ung thư phổi 18 1.3.2.1. Giới thiệu về ung thư phổi và tình hình dịch tễ 18 1.3.2.2. Nguyên nhân gây ung thư phổi và quá trình phát triển ung thư phổi 20 1.3.3. Mối liên quan của chức năng của ty thể và sự phát triển ung thư 21 CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 2.1. Vật liệu 23 2.1.1. Sinh phẩm 23 2.1.2. Hóa chất 23 2.2. Trang thiết bị 23 2.3. Phần mềm tin sinh học 24 2.4. Phương pháp nghiên cứu 25 2.4.1. Phương pháp tách chiết DNA từ mẫu máu 25 v Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 2.4.2. Định lượng DNA tách chiết bằng phương pháp quang phổ kế 26 2.4.3. Nhân đoạn gen bằng PCR 26 2.4.4. Phương pháp giải trình tự 30 2.4.5. Phương pháp phân tích chất lượng dữ liệu trình tự 31 2.4.6. Phương pháp tìm đột biến gen 32 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33 3.1. Kết quả tách chiết DNA 33 3.2. Kết quả nhân gen PCR 35 3.3. Kết quả giải trình tự gen 38 3.4. Kết quả phân tích đột biến 40 3.5. Thảo luận 41 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO 44 vi Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ THUẬT NGỮ VIẾT TẮT Bp Base pair (Cặp base) DNA Deoxyribonucleic acid D-loop Displacement loop EDTA Ethylene diamine tetra acetic acid HV Hypervariable regions kb kilo base mtDNA Mitochondrial Deoxyribonucleic acid(DNA ty thể) OD Optical Density (mật độ quang) PCR Polymerase Chain Reaction (phản ứng chuỗi tổng hợp nhờ enzyme Polymerase) RNA Ribonucleic acid rRNA Ribosome Ribonucleic acid SDS Sodium Dodecyl Sulfate SSC Standard saline citrate TAE Tris - Acetate - EDTA TE Tris - EDTA Tm Melting Temperature (nhiệt độ nóng chảy) tRNA Transfer Ribonucleic acid vii Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ DANH SÁCH CÁC HÌNH VẼ Danh mục hình Tên hình Trang 1.1 Cấu trúc ty thể 4 1.2 Quá trình sinh tổng hợp ATP trong ty thể 5 1.3 Cấu trúc hệ gen ty thể 7 1.4 Sự phân chia ty thể 10 1.5 Cơ chế sao chép mtDNA 11 1.6 Di truyền ty thể theo dòng mẹ 12 1.7 Cơ chế phát triển ung thư 15 1.8 Quá trình chết theo chương trình của tế bào 17 1.9 Sự phát triển của ung thư phổi 20 2.1 Sơ đồ nguyên lý PCR 28 2.2 Các bước của một chu kỳ PCR 29 2.3 Kiểm tra chất lương tín hiệu dựa trên dữ liệu trình tự 31 2.4 Kiểm tra chất lượng giải mã trình tự bằng phương pháp phổ thông 32 3.1 Kết quả tách chiết DNA tổng số 33 3.2 Đồ thị kiểm tran độ tinh sạch bằng phương pháp đo OD 35 3.3 Trình tự vùng D-loop và vị trí bắt cặp mồi 36 3.4 Sản phẩm PCR kiểm tra trên gel agarose 1% 38 3.5 Kết quả giải trình tự trên một số mẫu bệnh và mẫu đối chứng 40 3.6 Kết quả phân tích đột biến 41 viii Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ DANH SÁCH BẢNG BIỂU Danh mục bảng Tên bảng Trang 1.1 So sánh mã di truyền của gen nhân và gen ty thể 8 1.2 Các triệu chứng của ung thư phổi 18 2.1 Danh sách các trang thiết bị sử dụng cho nghiên cứu 24 2.2 Phần mềm sử dụng 24 2.3 Sơ đồ nguyên lý PCR 30 3.1 Kết quả kiểm tra độ tinh sạch DNA bằng phương pháp OD 34 3.2 Thành phần dùng cho 1 phản ứng PCR 37 3.3 Chương trình thực hiện phản ứng PCR 37 1 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ LỜI MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Từ những năm 1805 ty thể được các nhà khoa học phát hiện là một cấu trúc ngoài nhân tế bào (Ernster and Schatz, 1981). Sau gần 100 năm nghiên cứu kéo dài, mối liên hệ của ty thể và hô hấp tế bào được xác định và ngày nay ty thể được đánh giá là “trung tâm năng lượng của tế bào” (“Powerhouse of the Cell”). Ngoài ra, một trong những phát hiện đột phá về ty thể là việc xác định được sự tồn tại của vật liệu di truyền ty thể vào những năm đầu thập kỷ 60 của thế kỷ trước. Từ đó đến nay, các nghiên cứu trong lĩnh vực ty thể đã phát triển mạnh từ giải trình tự hệ gen ty thể, nghiên cứu chức năng cơ bản của ty thể và những bệnh liên quan tới rối loạn chức năng ty thể. Tầm ảnh hưởng của ty thể tới sự phát triển bệnh ung thư ngày càng được giới nghiên cứu công nhận. Các đột biến của mtDNA (Mitochondrial Deoxyribonucleic) đã được phát hiện ở các bệnh ung thư như ung thư bàng quang, ung thư phổi, ung thư đại tràng, ung thư cổ và đầu, ung thư thận, gan, phổi, dạ dày và ung thư máu ác tính. Quan trọng hơn, vùng D-loop (displacement loop) của hệ gen ty thể lại là nơi có tần suất đột biến cao, đặc biệt là tại các vùng siêu biến như HV1 (hypervariable regions). Vì vậy đột biến tại vùng D-loop tiềm ẩn nhiều mối liên quan tới phát triển ung thư. Ung thư phổi trên thế giới nói chung và ở Việt Nam nói riêng là bệnh phổ biến và nguy hiểm trong tất cả các loại ung thư. Đây là bệnh có tiên lượng xấu bởi tiến triển nhanh, di căn sớm, phát hiện bệnh thường ở giai đoạn muộn. Ung thư phổi thường không có triệu chứng đặc biệt và có thể có các đặc điểm giống như ở các bệnh lý khác gây ra. Vì vậy việc tiến hành các chẩn đoán y học tin cậy là rất cần thiết. Việc xác định trình tự nucleotide vùng điều khiển DNA ty thể được xem là công cụ hữu hiệu để đánh giá sự liên quan mật thiết giữa tỉ lệ đột biến vùng điều khiển gen ty thể với sự phát triển, biểu hiện 2 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ ung thư phổi. Trong khuôn khổ luận văn này, chúng tôi tiến hành “Nghiên cứu mối liên quan giữa đột biến trong vùng điều khiển hệ gen ty thể và bệnh ung thƣ phổi” 2. Mục tiêu Giải trình tự vùng D-loop tách chiết từ mẫu bệnh phẩm (máu) của bệnh nhân ung thư phổi tại bệnh viện Bạch Mai – Hà Nội – Việt Nam và người khỏe mạnh. So sánh trình tự đoạn gen HV1 vùng D-loop với các trình tự tham khảo công bố trên ngân hàng gen và tìm điểm đột biến đặc trưng cho bệnh nhân ung thư phổi ở Việt Nam. Đề xuất chức năng đột biến gen ty thể liên quan tới bệnh ung thư phổi. 3. Nội dung Tách chiết DNA tổng số từ máu của bệnh nhân mắc bệnh ung thư phổi và người bình thường. Nhân đoạn gen HV1 thuộc vùng D-loop. Xác định và phân tích trình tự gen vùng HV1 của các mẫu bệnh phẩm và mẫu đối chứng. So sánh các trình tự với trình tự chuẩn Cambridge Reference Sequence (CRS) để tìm ra điểm đột biến sai khác. [...]... trung đề cập tới đột biến gen ty thể Các bệnh liên quan đến đột biến gen nhân tham gia điều khiển hoạt động của ty thể có thể tham khảo tại tài liệu khác (Shoubridge, 2001) Dù hệ gen ty thể có kích thư c vô cùng nhỏ so với hệ gen nhân, đột biến gen ty thể là một trong nhưng nguyên nhân quan trọng trong các bệnh di truyền Trong những năm gần đây, các nghiên cứu về ty thể và di Số hóa bởi Trung tâm Học liệu... Hình 1.9 Sự phát triển của ung thư phổi 1.3.3 Mối liên quan của chức năng của ty thể và sự phát triển ung thƣ Tầm ảnh hưởng của ty thể tới sự phát triển bệnh ung thư ngày càng được giới nghiên cứu công nhận Các đột biến của mtDNA đã được phát hiện ở các bệnh ung thư như ung thư bàng quang, ung thư phổi, ung thư đại tràng, ung thư cổ và đầu, ung thư thận, gan, phổi, dạ dày và ung thư máu ác tính (Luciakova,... http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 13 truyền ty thể đã đưa ra khá nhiều dẫn chứng về mối quan hệ giữa di tuyền đột biến ty thể và biểu hiện bệnh, và đã xác định được nhiều đột biến mtDNA liên quan quá trình lão hóa và ung thư Cũng giống như gen nhân, đột biến gen ty thể có thể ở dạng đột biến đứt đoạn, đột biến thay thế và đột biến thêm đoạn Các đột biến đứt đoạn có nhiều khả năng bị loại bỏ khỏi quần thể do hiệu ứng gây độc... các bệnh ung thư như ung thư bàng quang, ung thư phổi, ung thư đại tràng, ung thư cổ và đầu, ung thư thận, gan, phổi, dạ dày và ung thư máu ác tính (Luciakova, Kuzela 1992; Bianchi và cs., 1995; Horton và cs., 1996; Polyak và cs., 1998; Tamura và cs., 1999; Fliss và cs., 2000) Đối tượng nghiên cứu của đề tài này là ung thư phổi, vì vậy chúng tôi sẽ trình bày chi tiết hơn về căn bệnh này và mối quan hệ. .. (1) cấu trúc ty thể, (2) hệ gen ty thể và di truyền gen ty thể, (3) Rối loạn cấu trúc/chức năng ty thể và các bệnh liên quan Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 4 1.1.1 Cấu trúc ty thể Hình 1.1 Cấu trúc ty thể Ty thể là bào quan phổ biến ở các tế bào nhân chuẩn (Hình 1.1) Tùy thuộc vào tế bào, ty thể có cấu trúc tổng thể khác nhau Nhìn chung ty thể có hình hạng phổ biến là hình... ty thể truyền thống, các nguy cơ phát triển hội chứng lâm sàng liên quan tới đột biến của gen ty thể, các bệnh liên quan lão hóa sớm do tác động của sự bất thư ng gen ty thể Bệnh ty thể có thể do đột biến trực tiếp gen ty thể nhưng cũng có thể gián tiếp do rối loạn chức năng của gen nhân tham gia điều khiển quá trình trao đổi chất các gen ty thể Trong khuôn khổ luận văn này, chúng tôi chỉ tập trung... các gen liên quan đến phát triển ung thư bị đột biến, tế bào được hoạt hóa để tránh được sự chết theo chương trình 1.3.2 Ung thƣ phổi 1.3.2.1 Giới thiệu về ung thƣ phổi và tình hình dịch tễ Có hai loại ung thư phổi chính là loại ung thư phổi tế bào nhỏ, và loại ung thư không tế bào nhỏ Loại ung thư phổi tế bào nhỏ là loại ung thư ác tính cao, chiếm khoảng 15% trường hợp ung thư phổi 85% trường hợp ung. .. loài, và nhiều đột biến diễn tiến của nhiều bệnh và hội chứng, trong đó có ung thư [Wallace, 1999; Hochhauser, 2000] Các phản ứng oxy hoá khử đã làm tăng khả năng đột biến trong mtDNA, khởi đầu và kích thích sự phát triển của bệnh ung thư, làm giảm chức năng sinh tổng hợp ATP của ty thể (Zhang và cs., 1990; Shigenaga và cs., 1992) Mặc dù đột biến gen ty thể rất phổ biến trong phát triển ung thư, các đột. .. biến mtDNA và rối loạn chức năng ty thể có tham gia vào quá trình lão hóa và các bệnh lão hóa (ví dụ, tiểu đường) và ung thư và cs, 2003; Taylor and Turnbull, 2005) Tới nay, mức độ công nhận mối liên quan đột biến ty thể và bệnh học ngày càng cao do chúng ta đã có thể giải được trình tự genome ty thể (McFarland và cs., 2004) Riêng về khía cạnh nghiên cứu ung thư, từ năm 1998 Vogelstein và cộng sự đã... công bố rằng 7 trong số 10 dòng tế bào ung thư đại trực tràng có mang đột biến ty thể, và những đột biến này có xuất hiện ở các mô ung thư (Polyak và cs., 1998) Kể từ phát hiện này, rất nhiều các nghiên cứu khác đã tập trung khảo sát ở cả các u cứng và ở các bệnh nhân ung thư máu và nhận thấy gen ty thể có tần xuất đột biến cao hơn hẳn so với mẫu đối chứng (Fliss và cs., 2000) Các đột biến của mtDNA . gen ty thể 9 1.2. Di truyền gen ty thể và đột biến gen ty thể liên quan đến bệnh học 11 1.2.1. Di truyền gen ty thể 11 1.2.2. Đột biến gen ty thể liên quan đến bệnh học 12 1.3. Mối liên quan. Nghiên cứu mối liên quan giữa đột biến trong vùng điều khiển hệ gen ty thể và bệnh ung thƣ phổi 2. Mục tiêu Giải trình tự vùng D-loop tách chiết từ mẫu bệnh phẩm (máu) của bệnh nhân ung. HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT **************** TRẦN MẠNH HÀ NGHIÊN CỨU MỐI LIÊN QUAN GIỮA ĐỘT BIẾN TRONG VÙNG ĐIỀU KHIỂN HỆ GEN TY THỂ VÀ BỆNH UNG