PCR (polymerase chain reaction) là một phản ứng sinh hoá phụ thuộc nhiệt độ, sử dụng đặc điểm của quá trình sao chép DNA với sự tham gia của một loại enzyme DNA-polymerase chịu nhiệt, có 2 đoạn ngắn DNA một sợi làm mồi và dùng các đoạn DNA mạch đơn làm khuôn để tổng hợp nên sợi mới bổ sung với nó. Vì vậy để khởi đầu quá trình tổng hợp DNA cần cung cấp đoạn mồi oligonucleotide (có độ dài từ 6 - 30 nucleotid). Đoạn này gắn kết với DNA khuôn tại điểm khởi đầu sao chép, và được enzyme DNA-
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
polymerase điều khiển để tổng hợp nên một sợi DNA đặc thù. Các sợi DNA mạch đơn làm khuôn được tạo ra theo cách đơn giản là nâng nhiệt độ lên trên
900C (92 - 980C) mà thường là 940
C cho chuỗi xoắn kép DNA bung ra (Lê Thanh Hoà và cs, 2001).
Cả 2 sợi DNA đều được dùng làm khuôn cho quá trình tổng hợp nếu các đoạn mồi (gọi là oligonucleotide hay primer) được cung cấp để bám vào vị trí tương ứng cho cả 2 sợi. Trong kỹ thuật PCR, các đoạn mồi được chọn nằm ở 2 đầu đoạn DNA cần nhân lên, sao cho các sợi DNA tổng hợp mới được bắt đầu tại mỗi đoạn mồi và kéo dài về phía đoạn mồi nằm trên sợi kia, cho sản phẩm có độ dài nằm giữa 2 đoạn mồi này. Độ dài của sản phẩm PCR có thể từ vài trăm cho đến hàng ngàn, thậm chí hàng chục ngàn cặp nucleotide. Như vậy, sau mỗi chu kỳ, các điểm bám cho các đoạn mồi lại xuất hiện trên mỗi sợi DNA mới được tổng hợp. Hỗn hợp phản ứng lại được nâng nhiệt độ lên thích hợp sao cho các sợi ban đầu tách khỏi sợi mới tổng hợp, các sợi này sau đó được dùng làm khuôn cho chu kỳ tiếp theo, bao gồm các bước: gắn mồi, tổng hợp DNA và tách rời các đoạn.
Kết quả cuối cùng của PCR là sau n chu kỳ của phản ứng, tính theo lý
thuyết, ta sẽ có 2n bản sao các phân tử DNA mạch kép nằm giữa 2 đoạn mồi
(Hình 2.1). Như vậy, kết quả là một đoạn DNA định trước được “nhân lên” với một lượng rất lớn. Ví dụ sau 30 chu kỳ số lượng bản sao DNA của PCR
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Hình 2.1. Sơ đồ nguyên lý PCR
PCR là một kỹ thuật phòng thí nghiệm đa năng và phổ ứng dụng hết sức rộng rãi. Vật liệu khởi đầu cho PCR là DNA có chứa đoạn cần nhân lên, gọi là khuôn DNA. Không phải lúc nào cũng cần thiết phải tách chiết đoạn cần nhân lên vì việc đó đã được các đoạn mồi dùng trong phản ứng xác định. Tuy nhiên nếu DNA làm khuôn tinh khiết thì phản ứng PCR sẽ rất nhạy và đặc hiệu. Hàm lượng DNA khuôn cần cho PCR rất nhỏ. Trong các thí nghiệm bình thường ở phòng thí nghiệm chỉ cần 1-100ng DNA tổng số của hệ gen là đủ. Tuy nhiên ngày nay trong nhiều trường hợp, PCR có thể nhân các đoạn DNA chỉ từ một phân tử DNA riêng lẻ.
Thành phần chủ yếu của PCR bao gồm - DNA làm khuôn
- Hai đoạn mồi để xác định các điểm bắt đầu tổng hợp DNA (primer) - Enzyme chịu nhiệt DNA - polymerase (hiện nay được dùng phổ biến
nhất là Taq, chiết xuất từ vi khuẩn chịu nhiệt Thermus aquaticus).
- Hỗn hợp của tất cả 4 tiền chất deoxynucleotide (ở dạng dNTP).
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
- Nước tinh khiết (không có DNAase; RNase v.v...)
Dung tích tổng số cho một phản ứng PCR là 50 l hoặc 25 l.
Có 3 giai đoạn (ba bước điều chỉnh nhiệt độ) cho 1 chu kỳ (Hình 2.2): Bung liên kết của DNA (denaturation): Được thực hiện ở nhiệt độ 90 C - 98 C trong vài giây đến vài phút. Tại nhiệt độ này, các phân tử DNA mạch kép sẽ bị tách ra tạo nên các sợi đơn dùng để làm khuôn cho các đoạn mồi bám vào và enzyme RNA-polymerase xúc tác tổng hợp.
Mồi bám (hay còn gọi là ủ với mồi – annealing) Sau bước 1, ngay lập tức, nhiệt độ được hạ xuống 37-68°C để các đoạn mồi bám vào với các trình tự bổ sung tương ứng trên các phân tử DNA làm khuôn.
Tổng hợp (hay còn gọi là kéo dài –extension): Nhiệt độ ngay lập tức được nâng lên 68°C – 72°C (thông thường 72 C) trong vài chục giây đến vài chục phút để các sợi DNA vừa được tổng hợp xoắn vào nhau tạo nên DNA sợi kép, chính là sản phẩm PCR.
Hình 2.2. Các bước của một chu kỳ PCR
Cứ như vậy, phản ứng xảy ra trong 25-35-40 chu kỳ và tiếp tục cho đến chu kỳ cuối cùng. Sau chu kỳ cuối, nhiệt độ được duy trì ở 72 C trong 5-10 phút sao cho tất cả các sợi đơn DNA có trong phản ứng xoắn lại tạo nên sản phẩm PCR. Cuối cùng, nhiệt độ hạ xuống 4 C để bảo quản sản phẩm.
Sản phẩm PCR là đoạn DNA mà ta cần nhân lên. Sản phẩm được kiểm tra bằng cách chạy điện di trên thạch agarose (nồng độ 0,8% - 2%), và DNA
Bước 1: Tháo xoắn
Bước 2: Gắn mồi
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
của PCR sẽ được nhìn thấy rõ dưới tác dụng của tia cực tím (ultra-violet) sau khi được nhuộm bằng Ethidium Bromid, một loại hoá chất có khả năng bám và làm hiển thị DNA. Độ dài của DNA sản phẩm được tính bằng cách so sánh với chỉ thị DNA (DNA Marker), sử dụng thông dụng nhất là DNA của thực
khuẩn thể Lambda cắt bằng enzyme giới hạn Hind III.
2.4.4. Phƣơng pháp giải trình tự
Sau khi thu sản phẩm PCR, chúng tôi tiến hành xác định trình tự dựa trên phương pháp tổng hợp của F. Sanger và cộng sự. Đặc trưng của phương pháp này là ngoài những nucleotide thông thường còn sử dụng thêm 4 loại dideoxynucleotide (mất nhóm -3‟OH). Điều này khiến các dideoxynucleotide không còn khả năng hình thành các cầu nối photphodieste với các nucleotide tiếp theo dẫn đến làm ngừng quá trình tổng hợp DNA.
Quy trình xác định trình tự gồm 3 bước:
Thực hiện PCR với hỗn hợp thành phần phản ứng (15 l) trong bảng 2.3. Bảng 2.3. Thành phần PCR cho xác định trình tự Thành phần Thể tích Bigdye 3 DNA plasmid x Mồi (3.2pmol) 1.275 Đệm 2.5X 3 H2O Bổ sung đến tổng thể tích 15 l
Chu trình nhiệt được thực hiện trên máy PCR 9700 (Applied
Biosystem). Bước 1: 960
C 1 phút, 1 chu kỳ. Bước 2: (960C 10 giây, 500C 5
giây, 600C 4 phút), 25 chu kỳ.
Tinh sạch sản phẩm PCR:
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
+ Bổ sung 60 l cồn 100%, ủ ở nhiệt độ phòng trong 15 phút. + Ly tâm 4500 v/p trong 45 phút để thu cặn.
+ Rửa cặn bằng 60 l cồn 70%. Ly tâm 10.000 v/p để thu cặn. + Làm khô cặn trong 3 phút.
+ Hoà cặn trong 10 l Hidiformamide.
+ Biến tính ở 95oC trong 3 phút.
Xác định trình tự trên máy:
Sản phẩm PCR sau khi đã tinh sạch được đưa vào máy xác định trình tự ABI 3100 Avant (của Applied Biosystems) để đọc trình tự tự động.
2.4.5. Phƣơng pháp phân tích chất lƣợng dữ liệu trình tự
Các thông số và dữ liệu thu nhận sau khi đọc trình tự (Hình 2.3) được kiểm tra bằng phần mềm BioEdit. Phần mềm này cho phép xem xét độ phân tách các đỉnh tín hiệu và các phần nhiễu tín hiệu (background noise).
Hình 2.3. Kiểm tra chất lương tín hiệu dựa trên dữ liệu trình tự
Mặc dù là một phương pháp tiên tiến xong việc đọc trình tự bằng máy vẫn có những lỗi mà các phần mềm không thể tự động sửa, vì vậy dựa trên các biểu đồ hiển thị tín hiệu, chúng tôi thực hiện kiểm tra thủ công độ phân
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
định của tín hiệu một lần nữa bằng mắt thường và thay thế các nucleotide mà máy đọc không thể xác định hoặc gọi nhầm (Hình 2.4).
Hình 2.4. Kiểm tra chất lượng giải mã trình tự bằng phương pháp phổ thông
2.4.6. Phƣơng pháp tìm đột biến gen
Các trình tự được đưa so sánh với trình tự chuẩn Cambridge Reference Sequence (CRS) (NC_012920.1) trên chương trình BLAST và một vài chương trình tìm kiếm đột biến điểm khác nhau như GeneMarker và MutationSurveyor. Dựa trên kết quả tổng hợp phân tích từ tất các các phần mềm, đột biến đặc trưng được xác định dựa trên phần trăm người bệnh mang đột biến và dựa trên những đột biến chung từ các kết quả thu được trên các phần mềm khác nhau.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả tách chiết DNA
Tách DNA tổng số là bước đầu tiên trong công việc tách dòng. DNA tổng số là nguyên liệu cơ bản của PCR, vì vậy chất lượng của nó quyết định đến chất lượng của phản ứng PCR và các kết quả thí nghiệm sau này. DNA tổng số có độ tinh sạch cao, trạng thái không bị đứt gãy và có nồng độ hợp lý cần thiết cho quá trình thực hiện PCR hiệu quả và tạo cơ sở tốt cho các công việc tiếp theo.
Hình 3.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số
Giếng 1 -21 mẫu máu bệnh nhân ung thư phổi; Giếng 22 mẫu DNA chuẩn
Có nhiều mẫu vật có thể sử dụng để tách được DNA tổng số từ người như máu, da, tóc, xương, mô... Để đảm bảo tính chính xác cao trong thí nghiệm này, chúng tôi sử dụng đối tượng tác DNA tổng số là các mẫu máu từ nhưng bệnh nhân đã được chẩn đoán ung thư phổi. Và tách DNA tổng số từ các mẫu máu của người bình thường. Mẫu máu được bảo quản trong ống chống đông (EDTA). Quy trình tách DNA tổng số được trình bày cụ thể trong mục 2.1.1. Chất lượng DNA tổng số được kiểm tra bằng phương pháp điện di trên Gel agarose 1% cùng với mẫu DNA tổng số đối chứng (Hình 3.1).
Kết quả thể hiện trên điện di đồ chỉ ra tất cả các đường chạy từ 1 - 21 có kích thước xấp xỉ với kích thước mẫu DNA chuẩn. Điều này chứng tỏ tất
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
cả các mẫu chúng tôi đã tách đều thu được DNA tổng số với độ sạch cao và hàm lượng tốt. Và để định lượng chính xác hàm lượng DNA chúng tôi kiểm tra nồng độ DNA trong mẫu bằng phương pháp đo quang phổ ở bước sóng 260nm và 280nm với độ pha loãng là 25 lần.
Trong số 20 mẫu chúng tôi đã tách chiết DNA tổng số để phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo chúng tôi đã tiến hành đo OD của tất cả các mẫu trên. Bảng 3.1 là kết quả đo kiểm tra giá trị hấp thụ ánh sáng tử ngoại của 20 mẫu
tại 2 bước sóng 260nm và 280nm với độ pha loãng 25 lần.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Hình 3.2. Đồ thị kiểm tra độ tinh sạch bằng phương pháp đo OD
Như vậy những kết quả được thể hiện ở Bảng 3.1 cho thấy với độ sạch và nồng độ của DNA tổng số thu được như trên sẽ tạo điều kiện hết sức thuận lợi cho chúng tôi tiến hành các công việc tiếp theo.
3.2. Kết quả nhân gen PCR
Vùng D-loop được chọn nghiên cứu. Cặp mồi dùng cho PCR bao gồm mồi xuôi: định vị trên RNA vận chuyển Proline (RNAvPro) và mồi ngược: định vị trên vùng bảo tồn D-loop, nhân đoạn DNA cho độ dài 440 cặp nucleotide (Hình 14). Chúng tôi dùng trình tự hệ gen ty thể người được công bố tại Ngân hàng gen (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) để thực hiện các bước thiết kế mồi và so sánh trình tự.
Thiết kế mồi
Mồi là những đoạn nucleotide mạch đơn có kích thước từ 6 - 100bp, có trình tự bắt cặp bổ sung với trình tự khuôn ở 2 đầu mạch đơn. Có 2 loại mồi là mồi xuôi (primer forward) và mồi ngược (primer reverse) tham gia vào PCR.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Mồi xuôi bắt cặp và gắn vào đầu 5‟ của mạch khuôn, mồi ngược bắt cặp bổ xung và gắn vào đầu 3‟ của mạch khuôn. Mồi ảnh hưởng rất nhiều đến hiệu quả của PCR, để đảm bảo tốt nhất cho phản ứng PCR, cần trọn mồi xuôi và mồi ngược có trình tự không bổ xung với nhau tránh xảy ra hiện tượng tự bắt cặp giữa các mồi với nhau. Các mồi có Tm (Melting temperature) gần giống nhau thì hiệu quả phản ứng được tăng cường, khoảng cách giữa mồi xuôi và mồi ngược nhỏ hơn 1kb thì là thích hợp nhất.
Để phân lập và tách dòng đoạn gen vùng siêu biến I, chúng tôi đã thiết kết cặp mồi dựa trên trình tự gen ty thể đã được công bố trong Ngân hàng gen quốc tế (Gene Bank), số đăng ký J01415, trình tự này cũng được gọi là trình tự Anderson. Trong công bố của Anderson và cộng sự (1981), trình tự vùng siêu biến I (HVI) trong D-Loop của DNA ty thể nằm từ vị trí 16024 đến 16368.
15841 aataccaact atctccctaa ttgaaaacaa aatactcaaa tgggcctgtc cttgtagtat 15901 aaactaatac accagtcttg taaaccggag atgaaaacct ttttccaagg acaaatcaga 15961 gaaaaagtct ttaactccac cattagcacc caaagctaag attctaattt aaactattct 16021 ctgttctttc atggggaagc agatttgggt accacccaag tattgactca cccatcaaca 16081 accgctatgt atttcgtaca ttactgccag ccaccatgaa tattgtacgg taccataaat 16141 acttgaccac ctgtagtaca taaaaaccca atccacatca aaaccccctc cccatgctta 16201 caagcaagta cagcaatcaa ccctcaacta tcacacatca actgcaactc caaagccacc 16261 cctcacccac taggatacca acaaacctac ccacccttaa cagtacatag tacataaagc 16321 catttaccgt acatagcaca ttacagtcaa atcccttctc gtccccatgg atgacccccc 16381 tcagataggg gtcccttgac caccatcctc cgtgaaatca atatcccgca caagagtgct 16441 actctcctcg ctccgggccc ataacacttg ggggtagcta aagtgaactg tatccgacat 16501 ctggttccta cttcagggtc ataaagccta aatagcccac acgttcccct taaataagac
Hình 3.3. Trình tự đoạn HV1 vùng D-loop và vị trí bắt cặp mồi
Theo tính toán trên, cặp mồi thiết kế sẽ nhân bản được một đoạn DNA đặc hiệu trong vùng siêu biến I với kích thước 440 bp.
Cặp mồi thiết kế có trình tự như sau
Primer forward (LF): 5‟ - atctccctaa ttgaaaacaa - 3‟ Primer reverse (LR): 5‟ - gtcccttgac caccatcctc - 3‟
R16410 L15945
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Phản ứng nhân gen HV1 trong cùng Dloop
Để nhân đoạn DNA đặc hiệu, có số lượng lớn thì ngoài việc thiết kế cặp mồi đặc hiệu còn phải có các thành phần hỗ hợp của PCR và chu trình nhiệt tối ưu. Chúng tôi đã thử các điều kiện khác nhau để tìm ra điều kiện tối ưu cho PCR. Bảng 3.2 và 3.3 dưới đây là thành phần phản ứng và chu trình nhiệt phù hợp để nhân đoạn DNA liên quan.
Bảng 3.2. Thành phần dùng cho 1 phản ứng PCR Thành phần Thể tích (µl) Dung dịch đệm 10X (Buffer) 2.5 MgCl2 (25nM) 2 dNTPs (10nM) 2 Mồi xuôi 1 Mồi ngược 1 DNA khuôn (50-100ng) 2
Taq DNA polymease (5U/µl) 0.2
Nước khử ion 14.3
Tổng 25
Bảng 3.3. Chƣơng trình thực hiện PCR
Bước Phản ứng Nhiệt độ thời gian Chu kỳ
1 Biến tính 94 3 phút 1
2 Biến tính 94 1 phút
3 Bắt cặp 58 1 phút ×35
4 Kéo dài 72 1 phút
5 Hoàn tất kéo dài 72 8 phút 1
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Sản phẩm PCR được điện di kiểm tra trên gel agarose 1% (Hình 3.4).
Hình 3.4. Sản phẩm PCR kiểm tra trên gel agarose 1%
Giếng 1 -14, mẫu máu bệnh nhân ung thư phổi; Giếng 15 thang DNA chuẩn (1kb plus Fermentas); ĐC: mẫu đối chứng.
Kết quả điện di ở Hình 3.4 cho thấy bản gel sản phẩm PCR có dạng 1 băng DNA duy nhất, đậm và rõ nét, có kích thước là 440bp phù hợp với kích thước của đoạn DNA cần nhân. Điều đó chứng tỏ cặp mồi chúng tôi thiết kế có độ đặc hiệu cao và chương trình cũng như thành phần phản ứng PCR là phù hợp. Với sản phẩm PCR này chúng tôi tiếp tục tiến hành giải trình tự trực tiếp.
Sản phẩm PCR đặc hiệu sau khi đã tinh sạch được đọc trình tự gen trên máy đọc tự động, sử dụng hai mồi đọc trình tự là mồi L15945 xuôi và mồi H16410 ngược . Thành phần phản ứng: BigDye 3 l Đệm 2,5X 3 l Mồi (0,01 g/ l) 1,275 l Sản phẩm PCR (100 ng/ l) 3 l 500 bp
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
H2O 4,375 l
Tổng thể tích 15 l
Chu trình nhiệt: 960C-1 phút; 25 chu kỳ (960C- 10 giây : 500C- 5 giây: