Vùng D-loop được chọn nghiên cứu. Cặp mồi dùng cho PCR bao gồm mồi xuôi: định vị trên RNA vận chuyển Proline (RNAvPro) và mồi ngược: định vị trên vùng bảo tồn D-loop, nhân đoạn DNA cho độ dài 440 cặp nucleotide (Hình 14). Chúng tôi dùng trình tự hệ gen ty thể người được công bố tại Ngân hàng gen (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) để thực hiện các bước thiết kế mồi và so sánh trình tự.
Thiết kế mồi
Mồi là những đoạn nucleotide mạch đơn có kích thước từ 6 - 100bp, có trình tự bắt cặp bổ sung với trình tự khuôn ở 2 đầu mạch đơn. Có 2 loại mồi là mồi xuôi (primer forward) và mồi ngược (primer reverse) tham gia vào PCR.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Mồi xuôi bắt cặp và gắn vào đầu 5‟ của mạch khuôn, mồi ngược bắt cặp bổ xung và gắn vào đầu 3‟ của mạch khuôn. Mồi ảnh hưởng rất nhiều đến hiệu quả của PCR, để đảm bảo tốt nhất cho phản ứng PCR, cần trọn mồi xuôi và mồi ngược có trình tự không bổ xung với nhau tránh xảy ra hiện tượng tự bắt cặp giữa các mồi với nhau. Các mồi có Tm (Melting temperature) gần giống nhau thì hiệu quả phản ứng được tăng cường, khoảng cách giữa mồi xuôi và mồi ngược nhỏ hơn 1kb thì là thích hợp nhất.
Để phân lập và tách dòng đoạn gen vùng siêu biến I, chúng tôi đã thiết kết cặp mồi dựa trên trình tự gen ty thể đã được công bố trong Ngân hàng gen quốc tế (Gene Bank), số đăng ký J01415, trình tự này cũng được gọi là trình tự Anderson. Trong công bố của Anderson và cộng sự (1981), trình tự vùng siêu biến I (HVI) trong D-Loop của DNA ty thể nằm từ vị trí 16024 đến 16368.
15841 aataccaact atctccctaa ttgaaaacaa aatactcaaa tgggcctgtc cttgtagtat 15901 aaactaatac accagtcttg taaaccggag atgaaaacct ttttccaagg acaaatcaga 15961 gaaaaagtct ttaactccac cattagcacc caaagctaag attctaattt aaactattct 16021 ctgttctttc atggggaagc agatttgggt accacccaag tattgactca cccatcaaca 16081 accgctatgt atttcgtaca ttactgccag ccaccatgaa tattgtacgg taccataaat 16141 acttgaccac ctgtagtaca taaaaaccca atccacatca aaaccccctc cccatgctta 16201 caagcaagta cagcaatcaa ccctcaacta tcacacatca actgcaactc caaagccacc 16261 cctcacccac taggatacca acaaacctac ccacccttaa cagtacatag tacataaagc 16321 catttaccgt acatagcaca ttacagtcaa atcccttctc gtccccatgg atgacccccc 16381 tcagataggg gtcccttgac caccatcctc cgtgaaatca atatcccgca caagagtgct 16441 actctcctcg ctccgggccc ataacacttg ggggtagcta aagtgaactg tatccgacat 16501 ctggttccta cttcagggtc ataaagccta aatagcccac acgttcccct taaataagac
Hình 3.3. Trình tự đoạn HV1 vùng D-loop và vị trí bắt cặp mồi
Theo tính toán trên, cặp mồi thiết kế sẽ nhân bản được một đoạn DNA đặc hiệu trong vùng siêu biến I với kích thước 440 bp.
Cặp mồi thiết kế có trình tự như sau
Primer forward (LF): 5‟ - atctccctaa ttgaaaacaa - 3‟ Primer reverse (LR): 5‟ - gtcccttgac caccatcctc - 3‟
R16410 L15945
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Phản ứng nhân gen HV1 trong cùng Dloop
Để nhân đoạn DNA đặc hiệu, có số lượng lớn thì ngoài việc thiết kế cặp mồi đặc hiệu còn phải có các thành phần hỗ hợp của PCR và chu trình nhiệt tối ưu. Chúng tôi đã thử các điều kiện khác nhau để tìm ra điều kiện tối ưu cho PCR. Bảng 3.2 và 3.3 dưới đây là thành phần phản ứng và chu trình nhiệt phù hợp để nhân đoạn DNA liên quan.
Bảng 3.2. Thành phần dùng cho 1 phản ứng PCR Thành phần Thể tích (µl) Dung dịch đệm 10X (Buffer) 2.5 MgCl2 (25nM) 2 dNTPs (10nM) 2 Mồi xuôi 1 Mồi ngược 1 DNA khuôn (50-100ng) 2
Taq DNA polymease (5U/µl) 0.2
Nước khử ion 14.3
Tổng 25
Bảng 3.3. Chƣơng trình thực hiện PCR
Bước Phản ứng Nhiệt độ thời gian Chu kỳ
1 Biến tính 94 3 phút 1
2 Biến tính 94 1 phút
3 Bắt cặp 58 1 phút ×35
4 Kéo dài 72 1 phút
5 Hoàn tất kéo dài 72 8 phút 1
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Sản phẩm PCR được điện di kiểm tra trên gel agarose 1% (Hình 3.4).
Hình 3.4. Sản phẩm PCR kiểm tra trên gel agarose 1%
Giếng 1 -14, mẫu máu bệnh nhân ung thư phổi; Giếng 15 thang DNA chuẩn (1kb plus Fermentas); ĐC: mẫu đối chứng.
Kết quả điện di ở Hình 3.4 cho thấy bản gel sản phẩm PCR có dạng 1 băng DNA duy nhất, đậm và rõ nét, có kích thước là 440bp phù hợp với kích thước của đoạn DNA cần nhân. Điều đó chứng tỏ cặp mồi chúng tôi thiết kế có độ đặc hiệu cao và chương trình cũng như thành phần phản ứng PCR là phù hợp. Với sản phẩm PCR này chúng tôi tiếp tục tiến hành giải trình tự trực tiếp.
Sản phẩm PCR đặc hiệu sau khi đã tinh sạch được đọc trình tự gen trên máy đọc tự động, sử dụng hai mồi đọc trình tự là mồi L15945 xuôi và mồi H16410 ngược . Thành phần phản ứng: BigDye 3 l Đệm 2,5X 3 l Mồi (0,01 g/ l) 1,275 l Sản phẩm PCR (100 ng/ l) 3 l 500 bp
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
H2O 4,375 l
Tổng thể tích 15 l
Chu trình nhiệt: 960C-1 phút; 25 chu kỳ (960C- 10 giây : 500C- 5 giây:
600C- 4 phút) và kết thúc ở 40C.
Sản phẩm PCR được tinh sạch: Tinh sạch sản phẩm PCR
+ Bổ sung 5 l EDTA 12,5 mM, pH=8. Ly tâm 4000v/p trong 45 giây. + Bổ sung 60 l cồn 100%, ủ ở nhiệt độ phòng trong 15 phút.
+ Ly tâm 4500 v/p trong 45 phút để thu cặn.
+ Rửa cặn bằng 60 l cồn 70%. Ly tâm 10.000 v/p để thu cặn. + Làm khô cặn trong 3 phút.
+ Hoà cặn trong 10 l Hidiformamide.
+ Biến tính ở 95oC trong 3 phút.
Trình tự các đoạn gen đặc hiệu được xác định theo phương pháp của Sanger bằng máy giải trình tự gen trên máy ABI Prism 3100 Avant tại Viện Công nghệ Sinh học (tốc độ 2,5 giờ/4 mẫu ~ 4000 nucleotide).
Kết quả được phân tích trên máy tính, sử dụng chương trình phần mềm Genedoc, phần mềm BioEditor. Trình tự nucleotide được so sánh với trình tự nucleotide của các đoạn DNA khác trong ngân hàng gen trên trang Web: http://www.ebi.ac.uk bằng chương trình EMBL FASTA. Hình 3.5 trình bày một số ví dụ điển hình của các mẫu đọc trình tự.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Hình 3.5. Kết quả giải trình tự trên một số mẫu bệnh và mẫu đối chứng
3.3. Kết quả phân tích đột biến
Để tìm điểm đột biến, chúng tôi lần lượt tiến hành so sánh trình tự D- loop của mẫu bệnh với trình tự tham khảo CRS công bố tại Ngân hàng Gen. Để đảm bảo loại trừ hoặc tập hợp các đột biến, chúng tôi sử dụng phương pháp so sánh trình tự hoặc dùng các phần mềm chuyên dụng cho việc xác định đột biến. Kết quả cho thấy, khi so sánh với trình tự CRS, phần lớn các mẫu (bao gồm 80% mẫu bệnh và 93% mẫu đối chứng) đều có sự sai khác ở vị trí 16189 (T→C) (Hình 3.6). Tuy nhiên, ở bệnh nhân ung thư phổi có xuất hiện thêm đột biến điểm 16519 (T→C) nhưng đột biến này hoàn toàn không có ở các cá thể đối chứng.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Hình 3.6. Kết quả phân tích đột biến
Đột biến điểm ở vị trí 16189 (T→C) xuất hiện ở cả bệnh nhân ung thư phổi và cá thể đối chứng. Đột biến ở vị trí 16519 (T→C) có tần xuất cao ở bệnh nhân ung thư phổi nhưng
không xuất hiện ở cá thể khỏe mạnh đối chứng.
3.4. Thảo luận
Gen ty thể dù có kích thước rất bé so với gen nhân và chỉ mã hóa cho một lượng nhỏ các protein và các tRNA và rRNA. Tuy nhiên, đột biến gen ty thể làm ảnh hưởng đến chức năng của ty thể, đặc biệt là chức năng tạo năng lượng của tế bào và liên quan tới một bệnh. Một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng đột biến gen ty thể có liên quan tới một số bệnh ung thư (Lu và cs., 2009). Quan trọng hơn, tần xuất đột biến gen ty thể trong vùng D-loop là cao nhất.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
Thêm vào đó, vùng D-loop là vùng chứa trình tự tham gia vào quá trình khởi đầu sao chép, phiên mã và dịch mã. Do đó, đột biến các gen trong ty thể, đặc biệt là vùng D-loop có ảnh hưởng nghiêm trọng tới các chức năng quan trọng của ty thể, như kênh truyền tín hiệu, tạo năng lượng, sản sinh, loại bỏ các gốc tự do, điều khiển quá trình chết theo chương trình, và nhiều chức năng tiềm ẩn khác. Phần lớn các rối loạn này có liên quan chặt chẽ với quá trình phát
triển ung thư (Barthelemy và cs., 2002). Kết quả của nghiên cứu này cũng
góp phần chỉ ra mối liên quan giữa đột biến gen ty thể và biểu hiện bệnh của bệnh nhân ung thư phổi tại Việt Nam.
Hiện nay, phần lớn các bệnh nhân ung thư phổi chỉ được phát hiện khi bệnh đã bước sang giai đoạn muộn. Xác định được đột biến đặc trưng của bệnh sẽ hỗ trợ cho tiên lượng, chẩn đoán bệnh được chính xác hơn và từ đó có được phác đồ điều trị hiệu quả hơn. Tuy số lượng bệnh nhân ở nghiên cứu này chưa nhiều, nhưng kết quả nghiên cứu đã đưa ra những bằng chứng về mối liên quan giữa đột biến trong vùng D-loop với ung thư phổi. Nghiên cứu này đã mở ra hướng nghiên cứu trong nghiên cứu cơ bản và nghiên cứu lâm sàng đối với đột biến gen và ung thư ở Việt Nam.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận
Đã xác định được đột biến điểm 16189 T>C trong vùng HV1 của các mẫu bệnh nhân ung thư phổi và mẫu người khỏe mạnh so với trình tự CRS đặc trưng cho người Việt Nam.
Đã xác định được đột biến điểm 16519 T>C trong vùng HV1 của các mẫu bệnh phẩm ung thư phổi của người Việt Nam so với trình tự CRS.
Kiến nghị
• Kiểm tra đột biến trên diện rộng các mẫu bệnh ung thư phổi (nhằm
khẳng định chắc chắn sự tồn tại của dột biến này).
• Kiểm tra đột biến tra trên các loại ung thư khác (để kiểm tra xem đột
biến này là đặc điểm riêng của ung thư phổi hay là của chung với các bệnh ung thư khác nhau).
• Bổ sung kiểm tra mẫu bệnh ở các giai đoạn khác nhau của ung thư
(điều này giúp khẳng định thêm về vai trò của đột biến trong tiên lượng hoặc chẩn đoán ung thư, hoặc theo dõi điều trị).
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG ANH
1. Attardi, G., and Schatz, G., 1988, Biogenesis of mitochondria, Annu Rev
Cell Biol4:289-333.
2. Barthelemy, C., de Baulny, H. O., and Lombes, A., 2002, D-loop
mutations in mitochondrial DNA: link with mitochondrial DNA
depletion?, Hum Genet110(5):479-87.
3. Berger, K. H., and Yaffe, M. P., 1996, Mitochondrial distribution and
inheritance, Experientia52(12):1111-6.
4. Bowmaker, M., Yang, M. Y., Yasukawa, T., Reyes, A., Jacobs, H. T.,
Huberman, J. A., and Holt, I. J., 2003, Mammalian mitochondrial DNA
replicates bidirectionally from an initiation zone, J Biol Chem
278(51):50961-9.
5. Brown, T. A., Cecconi, C., Tkachuk, A. N., Bustamante, C., and Clayton,
D. A., 2005, Replication of mitochondrial DNA occurs by strand displacement with alternative light-strand origins, not via a strand-coupled
mechanism, Genes Dev19(20):2466-76.
6. Chen, X. J., and Butow, R. A., 2005, The organization and inheritance of
the mitochondrial genome, Nat Rev Genet6(11):815-25.
7. Cheng, Y. L., Chang, W. L., Lee, S. C., Liu, Y. G., Chen, C. J., Lin, S. Z.,
Tsai, N. M., Yu, D. S., Yen, C. Y., and Harn, H. J., 2004, Acetone extract of Angelica sinensis inhibits proliferation of human cancer cells via
inducing cell cycle arrest and apoptosis, Life Sci 75(13):1579-94.
8. Clayton, D. A., 2003, Mitochondrial DNA replication: what we know,
IUBMB Life55(4-5):213-7.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
10.Dahout-Gonzalez, C., Nury, H., Trezeguet, V., Lauquin, G. J., Pebay-
Peyroula, E., and Brandolin, G., 2006, Molecular, functional, and
pathological aspects of the mitochondrial ADP/ATP carrier, Physiology
(Bethesda)21:242-9.
11.Ernster, L., and Schatz, G., 1981, Mitochondria: a historical review, J Cell
Biol91(3 Pt 2):227s-255s.
12.Evan, G. I., and Vousden, K. H., 2001, Proliferation, cell cycle and
apoptosis in cancer, Nature411(6835):342-8.
13.Fliss, M. S., Usadel, H., Caballero, O. L., Wu, L., Buta, M. R., Eleff, S.
M., Jen, J., and Sidransky, D., 2000, Facile detection of mitochondrial
DNA mutations in tumors and bodily fluids, Science287(5460):2017-9.
14.Ginther, C., Issel-Tarver, L., and King, M. C., 1992, Identifying
individuals by sequencing mitochondrial DNA from teeth, Nat Genet
2(2):135-8.
15.Goldstein, S., and Shmookler Reis, R. J., 1984, Genetic modifications
during cellular aging, Mol Cell Biochem64(1):15-30.
16.Greenberg, B. D., Newbold, J. E., and Sugino, A., 1983, Intraspecific
nucleotide sequence variability surrounding the origin of replication in
human mitochondrial DNA, Gene21(1-2):33-49.
17.Hanahan, D., and Weinberg, R. A., 2000, The hallmarks of cancer, Cell
100(1):57-70.
18.Herbst, R., 2008, Molecylar origind of cancer: Lung Cancer, N Engl J
Med (359):1367-80.
19.Hernandez-Resendiz, S., Buelna-Chontal, M., Correa, F., and Zazueta, C.,
2013, Targeting mitochondria for cardiac protection, Curr Drug Targets
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
20.IARC, 2013, IARC releases the latest global cancer trends in five
continents, in: WHO Press Release.
21.Lu, J., Sharma, L. K., and Bai, Y., 2009, Implications of mitochondrial
DNA mutations and mitochondrial dysfunction in tumorigenesis, Cell Res
19(7):802-15.
22.Majamaa, K., Moilanen, J. S., Uimonen, S., Remes, A. M., Salmela, P. I.,
Karppa, M., Majamaa-Voltti, K. A., Rusanen, H., Sorri, M., Peuhkurinen, K. J., and Hassinen, I. E., 1998, Epidemiology of A3243G, the mutation for mitochondrial encephalomyopathy, lactic acidosis, and strokelike
episodes: prevalence of the mutation in an adult population, Am J Hum
Genet63(2):447-54.
23.McFarland, R., Elson, J. L., Taylor, R. W., Howell, N., and Turnbull, D.
M., 2004, Assigning pathogenicity to mitochondrial tRNA mutations:
when "definitely maybe" is not good enough, Trends Genet20(12):591-6.
24.McKinney, E. A., and Oliveira, M. T., 2013, Replicating animal
mitochondrial DNA, Genet Mol Biol36(3):308-315.
25.Miyazono, F., Schneider, P. M., Metzger, R., Warnecke-Eberz, U.,
Baldus, S. E., Dienes, H. P., Aikou, T., and Hoelscher, A. H., 2002, Mutations in the mitochondrial DNA D-Loop region occur frequently in
adenocarcinoma in Barrett's esophagus, Oncogene21(23):3780-3.
26.Mootha, V. K., Lindgren, C. M., Eriksson, K. F., Subramanian, A., Sihag,
S., Lehar, J., Puigserver, P., Carlsson, E., Ridderstrale, M., Laurila, E., Houstis, N., Daly, M. J., Patterson, N., Mesirov, J. P., Golub, T. R., Tamayo, P., Spiegelman, B., Lander, E. S., Hirschhorn, J. N., Altshuler, D., and Groop, L. C., 2003, PGC-1alpha-responsive genes involved in oxidative phosphorylation are coordinately downregulated in human
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
27.Moraes, C. T., Srivastava, S., Kirkinezos, I., Oca-Cossio, J., van Waveren,
C., Woischnick, M., and Diaz, F., 2002, Mitochondrial DNA structure and
function, Int Rev Neurobiol53:3-23.
28.Muller-Hocker, J., 1990, Cytochrome c oxidase deficient fibres in the
limb muscle and diaphragm of man without muscular disease: an age-
related alteration, J Neurol Sci100(1-2):14-21.
29.Nass, M. M., and Nass, S., 1963, Intramitochondrial Fibers with DNA
Characteristics. I. Fixation and Electron Staining Reactions, J Cell Biol
19:593-611.
30.Parkin, D. M., Pisani, P., and Ferlay, J., 1993, Estimates of the worldwide
incidence of eighteen major cancers in 1985, Int J Cancer54(4):594-606.
31.Petersen, K. F., Befroy, D., Dufour, S., Dziura, J., Ariyan, C., Rothman,
D. L., DiPietro, L., Cline, G. W., and Shulman, G. I., 2003, Mitochondrial
dysfunction in the elderly: possible role in insulin resistance, Science
300(5622):1140-2.
32.Polyak, K., Li, Y., Zhu, H., Lengauer, C., Willson, J. K., Markowitz, S.
D., Trush, M. A., Kinzler, K. W., and Vogelstein, B., 1998, Somatic
mutations of the mitochondrial genome in human colorectal tumours, Nat
Genet20(3):291-3.
33.Ralph, S. J., Rodriguez-Enriquez, S., Neuzil, J., Saavedra, E., and
Moreno-Sanchez, R., 2010, The causes of cancer revisited: "mitochondrial malignancy" and ROS-induced oncogenic transformation
- why mitochondria are targets for cancer therapy, Mol Aspects Med
31(2):145-70.
34.Reed, J. C., and Green, D. R., 2002, Remodeling for demolition: changes
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/
35.Schatz, G., and Klima, J., 1964, Triphosphopyridine Nucleotide:
Cytochrome C Reductase of Saccharomyces Cerevisiae: a "Microsomal"
Enzyme, Biochim Biophys Acta81:448-61.
36.Shoubridge, E. A., 2001, Nuclear genetic defects of oxidative
phosphorylation, Hum Mol Genet10(20):2277-84.
37.Slonimski, P., and Ephrussi, B., 1949, Action de l'acriflavine sur les