Bài viết tiến hành khảo sát 48 dòng Thông đỏ (Taxus wallichana) mọc tự nhiên ở 4 vùng khác nhau tại Lâm Đồng và 01 dòng Thông đỏ (Taxus chinensis) ở Hòa Bình. Hàm lượng 10-deacetyl baccatin III (10-DAB) biến động lớn từ 0,0055 - 0,1924% (trung bình 0,07%) và taxol từ 0,00098 - 0,02% (trung bình 0,0089%) của T. wallichiana. T. Chinensis ở Hòa Bình có hàm lượng 10-DAB (0,0206%) và taxol (0,00083%) thấp hơn lần lượt là 3,5 lần và 10,7 lần so với T. wallichiana.
Trang 1PHÁT TRIỂN NGUỒN GEN THễNG ĐỎ
(TAXUS WALLICHIANA ZUCC.) TẠI LÂM ĐỒNG
TẠO NGUỒN NGUYấN LIỆU SẢN XUẤT THUỐC UNG THƢ
Vương Chớ Hựng*; Nguyễn Tiến Hựng*
Nguyễn Văn Tụn*; Trần Cụng Luận**
TểM TẮT
Khảo sỏt 48 dũng Thụng đỏ (Taxus wallichana) mọc tự nhiờn ở 4 vựng khỏc nhau tại Lõm Đồng
và 01 dũng Thụng đỏ (Taxus chinensis) ở Hũa Bỡnh Hàm lượng 10-deacetyl baccatin III (10-DAB)
biến động lớn từ 0,0055 - 0,1924% (trung bỡnh 0,07%) và taxol từ 0,00098 - 0,02% (trung bỡnh 0,0089%) của T wallichiana T Chinensis ở Hũa Bỡnh cú hàm lượng 10-DAB (0,0206%) và taxol (0,00083%) thấp hơn lần lượt là 3,5 lần và 10,7 lần so với T wallichiana Tiếp đú, chọn cỏc dũng
T wallichiana cú hàm lượng cao để nhõn giống, khảo nghiệm thế hệ và nghiờn cứu quy trỡnh nuụi trồng, chăm súc và thu hỏi lỏ cho hàm lượng 10-DAB từ 0,1478 - 0,3103% (gấp 3.3 lần so với
T wallichiana t ự nhiờn) và taxol xấp xỉ nhau Taxol phõn lập từ lỏ T wallichiana trồng cú hàm lượng
0,005 - 0,02% so với trong vỏ thõn T brevifolia là 0,01 - 0,04%, tuy thấp hơn gấp 2 lần, nhưng cú thể thu được một khối lượng lớn lỏ Thụng đỏ phục vụ sản xuất taxol ở quy mụ lớn và khụng làm chết cõy như kiểu khai thỏc taxol từ vỏ cõy Đồng thời, thu được một lượng lớn 10-DAB từ 0,1478 -
0,3103%, cao hơn gấp 2 lần so với Taxus brevifolia (0,02 - 0,2%)
* Từ khúa: Thụng đỏ; Gen; Thuốc chống ung thư
DEVELOPMENT OF GENUS TAXUS WALLICHIANA ZUCC IN LAMDONG
PROVINCE IN CREATING A SOURCE OF MATERIALS FOR ANTI-CANCEROUS
DRUG PRODUCTION SUMMARY
48 Taxus Wallichiana growing naturally in 4 different areas of Lamdong province and 1 Taxus
chinensis in Hoabinh were surveyed The content of 10-DAB and taxoid varied dynamically from 0.0055 - 0.1924% (median range: 0.07%) and 0.00098 - 0.02% (median range: 0.0089%), respectively Meanwhile, the content of 10-DAB and taxoid in Hoabinh is 3.5 times and 10.7 times lower than Taxus Wallichiana Afterward, Taxus Wallichiana species were chosen for multiplication; generation experiment and research on culturing procedures so that the content of 10-DAB and taxoid were corresponding to each other Taxoid extracted from the leaves of Taxus Wallichiana had its contents
of 0.005 - 0.02% compared to the outer of T Brevifolia (0.01 - 0.04%) Although this content is twice lower, we can collect a great number of Taxus Wallichiana in order to produce taxoid in a large scale What’s more, we can also harvest a huge amount of 10-DAB (0.1478 - 0.3103%), which is twice higher than Taxus brevifolia (0.02 - 0.2%)
* Key words: Taxus Wallichiana; Gene; Anti-cancerous drug
* Đại học Y-Dược TP HCM
** Cụng ty Dược Vimedimec
Ng-ời phản hồi: (Corresponding): Vương Chớ Hựng (vuongbaonhichau@yahoo.com.vn)
Ngày nhận bài: 25/12/2013; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 14/1/2014
Ngày bài báo đ-ợc đăng: 17/1/2014
Trang 2ĐẶT VẤN ĐỀ
Trong nguồn tài nguyên thực vật rừng
Việt Nam, nhóm Thông chỉ chiếm một số
lượng loài hết sức khiêm tốn, song chúng
lại có giá trị khoa học, nguồn gen và kinh tế
đáng lưu ý Theo kết quả nghiên cứu trong
và ngoài nước, trong tổng số 33 loài Thông
được xác định bản địa ở Việt Nam, có tới
14 loài nằm trong danh sách bị đe doạ cấp
toàn cầu và 29 loài đang bị đe dọa ở cấp
quốc gia [4] Trong đó, có nhóm Thông đỏ
thuộc chi Thông đỏ (Taxus) họ Taxaceae
Ở Việt Nam, có 2 loài Đó là: Thông đỏ lá
ngắn hay còn gọi là Thông đỏ bắc (Taxus
chinensis Pilg.), phân bố rải rác ở một số
tỉnh miền núi phía Bắc và Thông đỏ lá dài
hay còn gọi là Thông đỏ nam (Taxus
wallichiana Zucc.) [1, 2, 4]
Đối với quần thể Thông đỏ lá dài (sau
đây gọi là Thông đỏ) ở tỉnh Lâm Đồng, hiện
chỉ còn khoảng 250 cá thể Trong khi đó,
môi trường sống của chúng bị thu hẹp nghiêm
trọng Vì vậy, loài này đang bị nguy cấp ở
mức cao tại nước ta (EN: Endangered) [1,
2, 4] Năm 2002, Thomas và Nguyễn Đức
Tố Lưu còn cho rằng: quần thể Thông đỏ ở
Việt Nam là điểm phân bố cuối cùng về
phía Nam của chi Taxus L trong lục địa
châu Á Chúng phân bố biệt lập, cách xa
các điểm phân bố của loài ở phía Đông
Nam Trung Quốc và vùng cận Himalaya,
nên có thể đây là một xuất xứ riêng Như
vậy, về giá trị nguồn gen, Thông đỏ đang là
nhóm đối tượng được quan tâm ở Việt
Nam Về giá trị kinh tế, Thông đỏ là loài cho
gỗ tốt, cũng là cây có hoạt chất tự nhiên
dùng làm thuốc chữa ung thư [1, 2, 4]
Thuốc chống ung thư xuất xứ từ các loài
Thông đỏ trên thị trường hiện nay có tên
thương mại là paclitaxel (taxol) do Hãng
Dược phẩm Bristol Myers Squibb (Mỹ) sản
Taxol có ở trong một số bộ phËn của loài
Thông đỏ (Taxus spp), nhưng chủ yếu tập
hiện hợp chất 10-deacetyl baccatin III (10-DAB) có ở trong lá của các loài này và hàm lượng hoạt chất cao hơn trong vỏ 10-DAB
là tiền chất được dùng để bán tổng hợp taxol Đây cũng là con đường sản xuất taxol hay taxotere chủ yếu hiện nay Như vậy, với phát minh của công nghệ bán tổng hợp taxol từ 10-DAB chiết từ lá đã tránh tổn hại nặng nề đến các loài Thông đỏ tự nhiên Chúng tôi đã triển khai việc nhân giống và nghiên cứu nuôi trồng cây Thông đỏ ở Lâm Đồng, để tạo nguồn nguyên liệu phục vụ sản xuất thuốc ung thư và xuất khẩu
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
1 Đối tượng và vật liệu nghiên cứu
Cây Thông đỏ (Taxus wallchiana Zucc),
được nhân giống bằng kỹ thuật hom cành
và nuôi trồng trên đồng ruộng
2 Phương pháp nghiên cứu
ô tiêu chuẩn (theo Thái Văn Trừng, 1970)
để thu thập các dòng Thông đỏ và đặc điểm sinh học
- Phương pháp bố trí thí nghiệm trên đồng ruộng để xây dựng quy trình nhân giống và nuôi trồng Thông đỏ
- Phương pháp định tính bằng sắc ký lớp mỏng và định lượng bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN
1 So sánh hàm lượng 10-DAB và taxol giữa vùng phân bố và các dòng
Trang 3Bảng 1: Hàm lượng (%) hoạt chất của
Thông đỏ theo các vùng phân bố tự nhiên
Pà Cò (Mai Châu
- Hoà Bình) 0,0207 ± 0,0007 0,00083 ± 0,00012
Xuân Thọ
(TP Đà Lạt) 0,0464 ± 0,0015 0,01425 ± 0,00076
Hồ Tiên (huyện
Đơn Dương) 0,0641 ± 0,00058 0,01063 ± 0,00049
Bidoup (huyện
Lạc Dương) 0,0942 ± 0,0015 0,00802 ± 0,0001
Núi Voi (huyện
Đức Trọng) 0,0704 ± 0,00094 0,00856 ± 0,0001
Bảng 2: Hàm lượng (%) của taxol và
10-DAB
NV16 0,15153 ± 0,00283 0,01929 ± 0,00159
HT4 0,15567 ± 0,00728 0,01915 ± 0,00032
Dòng T Chinensis có hàm lượng taxol
thấp (10 - 17,17 lần) so với các dòng T
wallichiana (p < 1%) ở các vùng, chọn 02
dòng là giống nghiên cứu và sản xuất
2 Nhân giống bằng kỹ thuật hom cành
Bảng 3: Tỷ lệ ra rễ theo biện pháp xử lý
kích thích sinh trưởng và mức nồng độ
(ngµy)
1
1,5
62
56
55
690,1/778 718,7/778 726,7/778
88,7 92,3 93,4
1
1,5
65
60
57
673/778 701,7/778 722/778
86,5 90,2 92,8
Số lượng hom ra rễ và thời gian ra rễ khi
xử lý NAA và IBA khác biệt không có ý
nghĩa Vì vậy, có thể sử dụng 2 loại NAA
và IBA trong nhân giống Thông đỏ ở liều lượng 1 và 1,5% đều cho tỷ lệ ra rễ cao
từ 90,2 - 93,4% và thời gian ra rễ từ 55 -
65 ngày
3 Mật độ trồng
Khảo sát trồng ở 3 mật độ: 0,7 x 0,7 m;
1 x 1 m; và 1,2 x 1,2 m; lựa chọn mật độ trồng là 1 m x 1 m, trên cơ sở sinh trưởng
về chiều cao 18 tháng tuổi và đường kính
45 tháng tuổi, năng suất của Thông đỏ sau
36 tháng trồng
Ảnh hưởng của mật độ đến đường kính (cm)
0 10 20 30 40 50 60
Tháng tuổi
NT.I NT.II NT.III
Ảnh hưởng của mật độ đến chiều cao (cm)
0 20 40 60 80 100 120
Tháng tuổi
NT.I NT.II NT.III
Hình 1: Ảnh hưởng của mật độ đến đường
kính (a) và chiều cao (b) Thông đỏ
Trang 4Ảnh hưởng của mật độ đến năng suất (kg/ha/năm)
0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500 5000
NT1 NT2 NT3
Hình 2: Ảnh hưởng của mật độ đến năng suất lá khô
4 Chế độ phân bón
Khảo sát 5 chế độ phân bón (có đối chứng) Các chế độ phân NPK tăng dần theo tỷ lệ
từ 1,1,1; 2,1,1; 3,1,1 đến 4,1,1
Bảng 4: Ảnh hưởng của phân bón đến sinh trưởng và năng suất lá tươi
NghiÖm thøc I NghiÖm thøc II NghiÖm thøc III NghiÖm thøc IV NghiÖm thøc V Chiều cao (cm) 89,3 ± 3,51 101,6 ± 1,41 107,7 ± 2,28 99,4 ± 1,56 122,2 ± 4,89 Đường kính (mm) 29,1 ± 0,78 34,0 ± 0,49 35,5 ± 0,71 34,4 ± 0,36 35,4 ± 0,46 Năng suất lá tươi (kg/ha) 8603 ± 284 13564 ± 337 15010 ± 135 15250 ± 194 14830 ± 295 Khi có bón phân, năng suất lá tươi của Thông đỏ cao hơn từ 1,57 - 1,77 lần so với không bón phân (p < 1%) Giữa các chế độ phân bón còn lại không có sự khác biệt
Từ kết quả về chiều cao, đường kính và năng suất lá tươi theo chế độ phân bón ở trên,
có thể lựa chọn chế độ phân bón theo nghiệm thức III (318 kg N + 106 kg P + 106 kg K) để
sử dụng trong quy trình chăm sóc
5 Thời vụ thu hoạch
Khảo sát thu hoạch 6 lần/năm vào các tháng 2, 4, 6, 8, 10 và tháng 12
Bảng 5: Ảnh hưởng của thời vụ thu hoạch đến n¨ng suÊt l¸ t-¬i
(th¸ng)
10-DAB
(%)
0,244 ± 0,022
0,203 ± 0,016
0,213 ± 0,013
0,189 ± 0,013
0,272 ± 0,016
0,139 ± 0,022
Trang 5Thu hoạch vào tháng 10 cho 10-DAB
cao nhất, kế đó tháng 2 và lần lượt giảm
dần vào tháng 6, tháng 4, tháng 8 và thấp
nhất là tháng 12 Hàm lượng 10-DAB trung
bình khi thu hoạch 6 lần/năm là 0,21018%
(p < 1%)
Thu hoạch vào tháng 12 cho taxol cao
nhất, tiếp theo là tháng 2 và tháng 4, thu
hoạch vào tháng 8 cho hàm lượng thấp
nhất, sau đó là tháng 6 và tháng 10 Hàm
lượng taxol trung bình khi thu hoạch 6
lần/năm là 0,00672% (p < 1%)
Thu hoạch vào tháng 10 cho năng suất
lá tươi cao nhất, tiếp đó là tháng 8, tháng
12, tháng 6, tháng 4 và thấp nhất là thu hoạch vào tháng 2 Năng suất thu hoạch 6 lần/năm là 16.593 kg lá tươi/ha (p < 1%)
6 Hàm lƣợng 10-DAB và taxol ở các
bộ phận (lá, thân, rễ) theo tuổi cây
Khảo sát ở mỗi cấp tuổi 15 cá thể ở các
bộ phận lá, thân cành và rễ của Thông đỏ
từ lúc bắt đầu trồng cho đến thu mẫu
Bảng 6: Hàm lượng (%) 10-DAB và taxol trong các bộ phận Thông đỏ theo tuổi cây
giảm Ngược lại, hàm lượng taxol tăng tỷ lệ thuận theo tuổi cây, cây càng lớn hàm lượng càng tăng (p < 1%)
- Ở thân cành: hàm lượng 10-DAB tỷ lệ nghịch theo tuổi cây, cây càng lớn hàm lượng càng giảm Hàm lượng taxol biến động không theo quy luật (p < 1%)
Trang 6- Ở rễ: hàm lượng 10-DAB biến động
không theo quy luật, hàm lượng taxol có
chiều hướng tăng theo tuổi cây (p < 1%)
- Hàm lượng 10-DAB trong lá trung bình
ở các cấp tuổi cao hơn thân cành 23,74
lần và cao hơn ở rễ 13,65 lần Hàm lượng
taxol trong lá trung bình ở các cấp tuổi cao
hơn thân cành 2,23 lần và thấp hơn ở rễ
2,31 lần
- Ở cây 1 tuổi, hàm lượng 10-DAB trong
lá trung bình cao hơn thân cành 20,12 lần
và cao hơn rễ 12,98 lần Hàm lượng taxol
trong lá trung bình cao hơn thân cành 1,87
lần và thấp hơn so với rễ là 2,72 lần
- Ở cây 5 tuổi, hàm lượng 10-DAB trong
lá trung bình cao hơn thân cành 56,24 lần
và cao hơn rễ 8,83 lần Hàm lượng taxol trong lá trung bình cao hơn thân cành 4,7 lần và thấp hơn so với rễ là 2,35 lần
Như vậy, có thể nuôi trồng Thông đỏ thu hoạch lá để vừa tách chiết 10-DAB
và taxol cho đến khi cây lớn hơn 5 tuổi,
có triệu chứng già cỗi, năng suất kém thì thu luôn cả cây để tách chiết taxol là hiệu quả nhất
7 Mối quan hệ của nhiệt độ, độ ẩm và
số giờ nắng đến hàm lƣợng taxol và năng suất lá
Khảo sát mối quan hệ giữa nhiệt độ, độ
ẩm, số giờ nắng với hàm lượng taxol và năng suất lá tươi:
Bảng 7: Mối liên hệ giữa taxol và năng suất với các yếu tố khí hậu tại Đà Lạt
= 40,9%, p = 0,025
= 38,57%, p = 0,0311
(3) Y1 = 1/(617,6 - 378,3X3) Với r = -0,487, R2
= 23,69%, p = 0,108
Đối với hàm lƣợng taxol trong lá Thông đỏ:
Giữa hàm lượng taxol (Y1) với nhiệt độ không khí (X1), độ ẩm không khí (X2), số giờ
Y1 = -1,138 + 1,1644 X1 + 1,1967 X2 + 0,001796 X3 + 0,00179 X1X2 (4)
Trang 7Giữa năng suất lỏ tươi (Y2) với nhiệt độ
theo phương trỡnh (5, 6 và 7)
Với R2
= 0,8393, R2 (hiệu chỉnh dành
cho độ tự do) = 0,7475 và p= 0,0065
Quan hệ giữa năng suất lỏ tươi trung
bỡnh của Thụng đỏ (Y2) với nhiệt độ trung
(X2) và số giờ nắng trung bỡnh (X3) tồn tại
theo dạng phương trỡnh (8)
mưa 46,7 mm.thỏng, độ ẩm 74,83% và số
giờ nắng 219,5 giờ/thỏng), tớch luỹ hàm
lượng taxol diễn ra cao hơn so với mựa
mm/thỏng), độ ẩm 85,3% và số giờ nắng
151,83 giờ/thỏng) Điều đú cho thấy, hàm
lượng taxol tớch luỹ cao khi nhiệt độ, lượng
mưa và độ ẩm thấp, số giờ nắng cao
Ngược lại, tớch lũy hàm lượng taxol diễn ra
thấp khi nhiệt độ, lượng mưa và độ ẩm cao,
số giờ nắng thấp
- Năng suất lỏ cao diễn ra khi nhiệt độ,
lượng mưa và độ ẩm cao, số giờ nắng
thấp, nhưng khi lượng mưa thấp và số giờ
nắng cao làm cõy thiếu nước và năng suất
thấp Vỡ thế, để nõng cao năng suất, cú thể
phải tưới bổ sung vào mựa khụ một lượng
nước tương đương 150 - 200 mm/thỏng để
độ ẩm luụn đạt > 80%
+ Với kết quả trờn, cú thể lựa chọn thu
hoạch lỏ trong cả năm để thu nhận 10-DAB
Nếu muốn thu được taxol cao phải thu vào
mựa khụ và cần phải tưới nước bổ sung
trong mựa khụ để cú năng suất lỏ cao
KẾT LUẬN
Từ các kết quả nghiên cứu đề tài rút ra
một số kết luận sau:
- Chọn lọc dũng Thụng đỏ NV16 và HT4
để làm giống nghiờn cứu và sản xuất Trong
nhõn giống Thụng đỏ, sử dụng NAA và IBA
ở nồng độ 1 và 1,5% cho tỷ lệ ra rễ > 90%
- Chọn mật độ trồng Thụng đỏ với khoảng cỏch 1 m x 1 m (10.000 cõy/ha) Chế độ phõn bún 20 tấn phõn hữu cơ + 318
kg N + 106 kg P + 106 kg K hiệu quả nhất
để bún cho Thụng đỏ
- Thời vụ thu hoạch 10-DAB vào mựa mưa cho hàm lượng cao hơn mựa khụ và ngược lại, thu hoạch mựa khụ cho hàm lượng taxol cao hơn mựa mưa
- Hàm lượng 10-DAB trong lỏ giảm dần khi tuổi cõy càng lớn và taxol tăng dần khi cõy càng lớn, nhưng cao hơn so với ở rễ và thõn cành Hàm lượng 10-DAB và taxol trong thõn cành thấp hơn ở lỏ và rễ Hàm lượng taxol trong rễ càng tăng khi tuổi cõy càng lớn Vỡ thế, nờn trồng Thụng đỏ để thu lỏ cho đến khi cõy cú dấu hiệu cằn cỗi, sau đú, thu cả cõy cho hiệu quả tốt hơn
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Nguyễn Tiến Bõn và CS Sỏch Đỏ Việt Nam
Phần II - Thực vật NXB Khoa học Tự nhiờn và Cụng nghệ 2007
2 Vừ Văn Chi Từ điển thực vật thụng dụng
NXB Khoa học và Kỹ thuật 1999, tập 2,
tr.2412-2413
3 Phan Hiếu Hiền Phương phỏp bố trớ thớ
nghiệm và xử lý số liệu thực nghiệm Giỏo trỡnh Trường Đại học Nụng lõm 1996
4 Nguyễn Tiến Hiệp, Phan Kế Lộc, Nguyễn Đức Tố Lưu, Philip Ian Thomas, Aljos Farjon, Leonid Averyanov và Jacinto Regalata Jr
Thụng Việt Nam: Nghiờn cứu hiện trạng bảo tồn; Quỹ Darwin và Chương trỡnh nhiệt đới cộng đồng chõu Âu xuất bản 2005, tr.110-113
5 Nguyễn Hoàng Quỳnh Hương, Nguyễn Ngọc Song Trõm, Bựi Thế Vinh, Trần Cụng Luận
Xõy dựng quy trỡnh định lượng 10-DAB và taxol
trong lỏ Thụng đỏ (Taxus wallichiana Zucc.)
Tạp chớ Y học TP.HCM 2008, tập12, phụ bản của số 4, tr.105-111
6 Vương Chớ Hựng Nghiờn cứu đặc điểm
sinh thỏi và kỹ thuật trồng cõy thụng đỏ (Taxus
wallichiana Zucc.) là nguyờn liệu thuốc chống
ung thư Tạp chớ KHKT Nụng Lõm nghiệp 2006,
số 3, tr.50-58
Trang 87 Vương Chí Hùng, Nguyễn Tập, Nguyễn
Hoàng Nghĩa Kết quả điều tra Thông đỏ lá dài ở
tỉnh Lâm Đồng Tạp chí Dược liệu 2010, số 6,
tập 15, tr.333-338
8 Bùi Thế Vinh, Trần Công Luận, Vương Chí
Hùng, Nguyễn Tiến Hùng Studies on the
dynamic variation of 10-DAB and taxol contents
of Taxus wallichiana needles cultivated in Lâm
Đồng province PHARMA INDOCHINA VI
The Development of Indochina Pharmacy in
the Context of Global Economic Recession
15 - 18/12/2009, tr.621-624
9 Vương Chí Hùng, Nguyễn Hoàng Nghĩa
Nghiên cứu một số đặc điểm lâm học của cây
Thông đỏ lá dài (Taxus wallichiana Zucc.)
tại Lâm Đồng Tạp chí Khoa học Lâm nghiệp
số 1/2011, tr.1710-1715
10 Vương Chí Hùng Nghiên cứu đặc điểm
sinh thái và kỹ thuật trồng cây thông đỏ (Taxus
wallichiana Zucc.) là nguyên liệu thuốc chống
ung thư Tạp chí KHKT Nông Lâm nghiệp 2006,
số 3, tr.50-58