Đề tài được tiến hành với mục tiêu nhằm bước đầu đánh giá hiệu quả của kĩ thuật polymerase (PCR) và giải trình tự gene trong chẩn đoán định danh vi khuẩn (VK) gây bệnh ở những mẫu bệnh phẩm lấy ở những bệnh nhân (BN) nghi ngờ viêm mủ nội nhãn nội sinh do VK (VMNNNSVK). Nghiên cứu mô tả không có đối chứng. Dùng kĩ thuật PCR và giải trình tự để phân tích 23 bệnh phẩm dịch kính ở 23 BN có triệu chứng lâm sàng điển hình của VMNNNSVK có so sánh với kết quả của nhuộm soi và nuôi cấy. Các thử nghiệm được tiến hành tại khoa Vi sinh, trường Đại học Gifu, Nhật Bản, tháng 1/2009.
NGHIÊN CỨU KHOA HỌC ỨNG DỤNG KĨ THUẬT PHẢN ỨNG CHUỖI POLYMERASE VÀ GIẢI TRÌNH TỰ GENE TRONG CHẨN ĐỐN ĐỊNH DANH NGUYÊN NHÂN VIÊM MỦ NỘI NHÃN NỘI SINH DO VI KHUẨN Đỗ Tấn*, Đỗ Như Hơn*, Phạm Hồng Nhung** TÓM TẮT Mục tiêu: Nhằm bước đầu đánh giá hiệu kĩ thuật polymerase (PCR) giải trình tự gene chẩn đoán định danh vi khuẩn (VK) gây bệnh mẫu bệnh phẩm lấy bệnh nhân (BN) nghi ngờ viêm mủ nội nhãn nội sinh VK (VMNNNSVK) Phương pháp: Nghiên cứu mô tả khơng có đối chứng Dùng kĩ thuật PCR giải trình tự để phân tích 23 bệnh phẩm dịch kính 23 BN có triệu chứng lâm sàng điển hình VMNNNSVK có so sánh với kết nhuộm soi nuôi cấy Các thử nghiệm tiến hành khoa Vi sinh, trường Đại học Gifu, Nhật Bản, tháng 1/2009 Kết quả: Kết nhuộm soi: 8/23 (34,8%) trường hợp (TH) cho kết âm tính, PCR dương tính tất TH Trên 10/23 (43,5%) nhuộm soi quan sát thấy nhiều loại VK, có TH số khẳng định PCR, TH lại giải trình tự cho kết loại VK Kết ni cấy: ni cấy cho tỉ lệ dương tính thấp (3/23 – 13% ) TH dương tính trùng khớp với kết PCR giải trình tự sau PCR giải trình tự cho thấy gần ½ (11/23) TH phế cầu (Streptococcus pneumoniae) Có TH phát nhiều loại VK khó khăn kĩ thuật, chúng tơi khơng làm tách dòng để xác định loại VK Các TH lại gồm: Enterococcus casseliflanis (1), Streptococcus sp (1), Staphylocuccus sp (1), S.heamolyticus (1), Bacillus sp (1), S sciuri (1), Enterobacter hormaecher (1) Kết luận: PCR giải trình tự cho kết định danh VK xác nhuộm soi ni cấy, giúp ích cho điều trị, đồng thời góp phần xác định ổ nhiễm trùng nguyên phát bệnh VMNNNSVK Từ khóa: Viêm mủ nội nhãn nội sinh, PCR, giải trình tự gene I ĐẶT VẤN ĐỀ VMNNNSVK bệnh lí viêm nhiễm nặng nề mô dịch nội nhãn xâm nhập vi khuẩn từ quan khác qua đường máu đến mắt Đây bệnh lí cấp cứu gây tổn hại lớn chức thị giác, chí phải bỏ nhãn cầu điều trị tích cực Bệnh viện Mắt Trung ương, Khoa Vi sinh, Đại học Y Hà Nội * ** VK đến mắt (cơ quan đích) cần có điều kiện thuận lợi để phát triển Điều kiện thuận lợi suy giảm sức đề kháng thể VMNNNS theo y văn thường gặp BN suy giảm miễn dịch suy kiệt bệnh lí tồn thân Tuy nhiên, thực tế lâm sàng Việt Nam, thường gặp VMNNNS BN trẻ, khoẻ mạnh Cho đến nay, chưa có lời giải thích thoả đáng cho tượng lâm sàng Một khó khăn gặp phải trình điều trị Nhãn khoa Việt Nam (Số 20 - 2010) NGHIÊN CỨU KHOA HỌC chẩn đoán nguyên nhân bệnh Việc xác định tác nhân gây bệnh có tầm quan trọng to lớn, định hiệu trình điều trị tiên lượng chức bệnh Cho đến nay, xét nghiệm vi sinh kinh điển thường làm nhuộm soi nuôi cấy VK, tỉ lệ dương tính thấp thay đổi từ 21 – 63% Điều giải thích sau: (1) BN thường nhập viện muộn sau điều trị nhiều kháng sinh trước (tồn thân chỗ); (2) mơi trường ni cấy chưa đạt chuẩn, chưa có mơi trường ni cấy yếm khí Thực tế lâm sàng cho thấy, nhu cầu thiết yếu việc sử dụng loại xét nghiệm khác có độ nhạy độ đặc hiệu cao hơn, trả lời kết nhanh Từ 10 năm trở lại đây, nhiều tác giả giới thông báo sử dụng kĩ thuật PCR (polymerase chain reaction) giải trình tự (sequencing) phân tích dịch nội nhãn lấy từ BN nghi ngờ VMNN Kĩ thuật khắc phục nhược điểm kĩ thuật phân lập nuôi cấy kinh điển: (1) cần lượng bệnh phẩm ít; khơng đòi hỏi bệnh phẩm phải chứa sinh vật sống (nghĩa phân tích bệnh phẩm BN điều trị kháng sinh trước đó); trả kết nhanh (trong vòng khoảng 24 sau lấy bệnh phẩm) II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng 23 bệnh phẩm dịch kính 23 BN (nằm điều trị khoa Glơcơm, Bệnh viện Mắt Trung ương từ tháng 4/2008 đến 11/2008) có triệu chứng lâm sàng điển hình VMNNNSVK Phương pháp Nghiên cứu mơ tả khơng có đối chứng Dùng kĩ thuật PCR giải trình tự để phân tích 23 bệnh phẩm dịch kính 23 BN, có so sánh với kết nhuộm soi nuôi cấy Các thử nghiệm tiến Nhãn khoa Việt Nam (Số 20 - 2010) hành khoa Vi sinh, trường Đại học Gifu, Nhật Bản vào tháng 1/2009 Quy trình lấy bệnh phẩm: - Tất BN lấy bệnh phẩm phòng mổ theo quy trình giống Sát khuẩn thường quy povidone 5% gây tê cạnh nhãn cầu lidocaine 2% - Bệnh phẩm dịch kính lấy máy cắt dịch kính: trước mở đường tryền vào, hút bệnh phẩm qua đầu cắt dịch kính chia vào xi-lanh, xi-lanh lấy 0,2 - 0,3ml, dùng cho xét nghiệm vi sinh kinh điển (nhuộm soi nuôi cấy), dùng cho PCR giải trình tự - Bệnh phẩm dùng cho xét nghiệm vi sinh kinh điển: sau lấy cho soi tươi, trực tiếp có nhuộm gram để xác định sơ loại tác nhân gây bệnh (VK, nấm hay tác nhân khác) nuôi cấy vào mơi trường thích hợp Các tác nhân khơng phải VK loại khỏi nghiên cứu VK cấy chuyển vào môi trường thạch sôcôla 37oC làm giầu thêm dịch thioglycolate Ni cấy kị khí mơi trường canh thang thioglycate thạch máu kị khí làm giầu với hemin vitamin K 37oC Quy trình phân tích PCR giải trình tự: - Bệnh phẩm dùng cho sinh học phân tử lưu giữ điều kiện vô khuẩn nhiệt độ -20oC trước sử dụng - Tách chiết DNA: Quy trình tách chiết DNA PCR thực khoa Vi sinh, Đại học Gifu, Nhật Bản DNA tách chiết kít MORA (AMR, Gifu, Japan) theo hướng dẫn nhà sản xuất - Phản ứng chuỗi polymerase (PCR): làm theo quy trình kĩ thuật chuẩn Kary Mullis - Vùng DNA chọn nhân lên để xác định VK đoạn nằm rRNA Đây vùng bảo tồn loại VK có nhiều phiên tế bào VK Trong nghiên cứu này, đầu tiên, để NGHIÊN CỨU KHOA HỌC nhân đoạn DNA dùng cặp mồi chung cho tất loại VK (universal primer) gắn vào đơn vị 16S rRNA Chúng sử dụng cặp mồi 8UA 1485B, chu trình nhiệt có thay đổi (94oC/5 phút; 40 chu kì gồm 94oC/30giây, 55oC/60 giây, 72oC/60 giây, kết thúc 72oC/6 phút) so với mô tả Brosius cộng để khuếch đại đoạn dài khoảng 1500bp mã hóa cho tiểu phần 16S rRNA [1] Tất lần làm PCR với bệnh phẩm luôn có chứng âm chứng dương chạy để loại, trừ tượng âm tính dương tính giả - Trong nghiên cứu, 5µl bệnh phẩm đưa trực tiếp vào phản ứng PCR Nếu phản ứng PCR âm tính cân nhắc đến khả có chất ức chế phản ứng PCR bệnh phẩm Tuy nhiên, người ta không xác định chất ức chế PCR bệnh phẩm dịch kính [6], [7] Trong TH chúng tơi tiến hành pha lỗng bệnh phẩm nước cất vô khuẩn theo tỉ lệ 50% (1:2), 20% (1:5), 10% (1:10) 5% (1:20) sau làm lại phản ứng đồng thời Với biện pháp loại bỏ ức chế tất mẫu bệnh phẩm (23 mẫu) - Giải trình tự DNA: Các sản phẩm PCR sau khuếch đại, giải trình tự hệ thống máy giải trình tự động PRISM 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems) với sinh phẩm BigDyeTM Terminator v3.1 Cycle Sequencing Ready Reaction Kit theo hướng dẫn nhà sản xuất Trình tự đoạn gen mã hóa cho 16S rRNA dài khoảng 1000bp, phân tích website NCBI để định danh chủng VK có mặt bệnh phẩm mủ nội nhãn - Những chủng VK xác định Streptococus pneumoniae dựa phân tích trình tự gen 16S rRNA tiến hành làm PCR khuếch đại đoạn gen dnaJ mã hóa cho Hsp40 Và giải trình tự để khẳng định chắn tên VK mức độ lồi, phân tích trình tự gen 16S rRNA chưa đủ để xác định xác mức độ lồi cho S pneumoniae - Tách dòng sản phẩm phản ứng PCR (cloning), để xác định có mặt lồi khác bệnh phẩm không tiến hành không đủ thời gian kinh phí Những bệnh phẩm ghi kết “mix” (hỗn hợp) III KẾT QUẢ Kết nghiên cứu tổng hợp bảng 1: Bảng Tổng hợp liệu Stt Họ tên Tuổi Giới Ngày lấy Nhuộm soi Nuôi cấy PCR & Sequencing N Đ.N Nam 17/10/08 CK+, TK+ (-) S pneumoniae L.P.C Nữ 10/9/08 CK+ S pneumoniae S peumoniae L.T.H Nữ 13/9/08 CK+, TK+ (-) S pneumoniae N.V.V 32 Nam 10/7/08 TK+, TK- (-) S pneumoniae L.T.N.Q Nữ 10/7/08 CK+, TK- (-) S pneumoniae V.V.H 40 Nam 10/6/08 CK+, TK+ (-) Mix T V L 51 Nam 10/4/08 (-) (-) Staphylococcus sciuri B.P.T Nữ 10/4/08 CK+, TK- (-) S pneumoniae V.T.B.T Nữ 13/10/08 CK+, TK- Bacillus spp Bacillus spp 10 N T L 29 Nữ 23/11/08 (-) (-) Mix Nhãn khoa Việt Nam (Số 20 - 2010) NGHIÊN CỨU KHOA HỌC Stt Họ tên Tuổi Giới Ngày lấy Nhuộm soi Nuôi cấy PCR & Sequencing 11 N T.T H 1.5 Nữ 16/9/08 TK+ (-) S pneumoniae 12 N B A Nam 22/9/08 CK+ Streptococcus sp Streptococcus sp 13 K.T.T 25 Nam 28/10/08 CK+, TK- (-) Staphylococcus sp 14 N V G Nam 17/5/08 (-) (-) S pneumoniae 15 N.H.T 30 Nam 21/9/08 (-) (-) Mix 16 Đ T C 72 Nữ 27/10/08 (-) (-) S pneumoniae 17 N M.T 65 Nam 25/10/08 CK+ (-) Staphylococcus haemolyticus 18 T.T.H 43 Nam 30/7/08 CK+, TK+ (-) Mix 19 T.K.H 30 Nam 11/4/08 (-) (-) S Pneumoniae 20 N.T.T 68 Nữ 14/10/08 CK+, TK+ (-) Mix 21 T.T.T Nữ 28/10/08 TK- (-) Enterobacter hormaecher 22 N.V.C Nam 21/10/08 (-) (-) S pneumoniae 23 Đ Đ.T 22 Nam 11/9/08 (-) (-) Enterococcus casseliflanis Kết xét nghiệm kinh điển: - Kết nhuộm soi: 8/23 (34,8%) TH cho kết âm tính, PCR dương tính tất TH Trên 10/23 (43,5%) nhuộm soi quan sát thấy nhiều loại VK, có TH số khẳng định PCR, TH lại giải trình tự cho kết loại VK - Kết ni cấy: ni cấy cho tỉ lệ dương tính thấp (3/23 – 13% TH) TH có Streptococcus pneumoniae, TH Bacillus spp., TH lại cho Streptococcus spp TH dương tính trùng khớp với kết PCR giải trình tự sau Kết PCR giải trình tự: Gần ½ (11/23) TH cho kết phế cầu (Streptococcus pneumoniae) Có TH phát nhiều loại VK, khó khăn kĩ thuật chúng tơi khơng làm tách dòng để xác định loại VK Kết PCR giải trình tự tóm tắt vào bảng (Tất TH S pneumoniae định danh phân tích trình tự gen 16S rRNA dnaJ) Bảng Kết PCR giải trình tự Loại vi khuẩn Số lượng (%) S pneumoniae 11 (47,8%) Mix (21,7%) Enterococcus casseliflanis (4,3%) Nhãn khoa Việt Nam (Số 20 - 2010) Đặc điểm quan hay gây bệnh CK+, kị khí dung nạp, hay gây bệnh đường hơ hấp CK+, kị khí tuỳ tiện, hội sinh đường ruột, gây nhiễm trùng tiết niệu, máu, màng não NGHIÊN CỨU KHOA HỌC Loại vi khuẩn Số lượng (%) Đặc điểm quan hay gây bệnh Streptococcus sp (4,3%) CK+, nhiều chủng khác nhau, gây bệnh hệ hô hấp, máu, cơ, màng não Staphylocuccus sp (4,3%) Tụ cầu Gr(+), hay gây bệnh da, niêm mạc S heamolyticus (4,3%) Tụ cầu không tan huyết, hay gây viêm mô mềm BN suy giảm miễn dịch Bacillus sp (4,3%) TK+, có khơng khí môi trường xung quanh S sciuri (4,3%) Họ tụ cầu, hay gây nhiễm trùng tiết niệu Enterobacter hormaecher (4.3%) TK-, kị khí tuỳ tiện, gây bệnh đường tiêu hoá tiết niệu IV BÀN LUẬN thấy có nhiều loại VK, PCR kết luận lại Trong VMNN nói chung VMNNNS nói cho thấy loại) Trong TH vậy, điều trị riêng, nuôi cấy VK (NCVK) coi tiêu hoàn toàn dựa vào kinh nghiệm lâm sàng, mang chuẩn vàng chẩn đốn cơng cụ hỗ tính chất điều trị thử, bao vây trợ đắc lực cho điều trị Bởi NCVK dương PCR giải trình tự khắc phục hầu hết tính, khơng cho phép xác định loại VK gây nhược điểm xét nghiệm vi sinh kinh bệnh mà cho phép làm kháng sinh đồ giúp điển: (1) lượng bệnh phẩm cần hơn, (2) độ nhạy cho việc hiệu chỉnh điều trị theo kháng sinh đồ Tuy cao (100% nghiên cứu này, 90 - 100% nhiên, kết NCVK điều kiện theo y văn); độ đặc hiệu cao (có thể đạt 100% theo Việt Nam đạt kết thấp (13% - 22,2%) [4] Tỉ y văn), (3) tác dụng tốt dùng kháng lệ dương tính thấp nhiều nguyên nhân: sinh kĩ thuật xác định DNA VK không bệnh phẩm ít, loãng, sử dụng kháng sinh cần VK sống ni cấy, (4) trả lời kết trước đó, VK kẹt bề mặt cứng thể nhanh vòng 24 [8], [9], [10] Trong thủy tinh nhân tạo thân VK phát triển nghiên cứu này, đạt tỉ lệ dương tính chậm (ví dụ Propionibacterium acnes cần 100%, gần ½ TH cho kết phế 10 - 12 ngày để phát triển thành khuẩn lạc môi cầu (S pneumoniae) loại VK cư trú thường trường nuôi cấy) [2], [3], [5], [6], [7] Khi đó, điều xuyên gây bệnh vùng hầu họng Người Việt trị chủ yếu dựa vào kinh nghiệm, dựa phần Nam có tỉ lệ viêm mũi họng cao, phần lớn kết nhuộm soi sử dụng kháng sinh virus điều trị không cách, phổ rộng, kháng thuốc Trên lâm sàng chúng sử dụng kháng sinh bừa bãi thường dẫn đến tình tơi thường sử dụng vancomycine 500mg, soi trạng bệnh kéo dài, bội nhiễm VK VK tươi cho kết cầu khuẩn Gr(+), ceftazidime có nhiều nguy kháng thuốc (Fortum 1g) cho trực khuẩn Gr (-) quinolone Độ đặc hiệu PCR giải trình tự phụ hệ (Peflacine 400mg x lọ/ngày) cho tạp khuẩn thuộc nhiều vào độ “tinh khiết bệnh phẩm”: Tuy nhiên, qua nghiên cứu nhuộm soi có nghĩa bệnh phẩm bị nhiễm chủng tạp cho kết âm tính giả (8/23 – 34,8%) khuẩn từ mơi trường bên ngồi dẫn đến làm sai “dương tính giả” (7/10 TH nhuộm soi cho lạc toàn kết [3], [6], [7], [8] Quy trình lấy Nhãn khoa Việt Nam (Số 20 - 2010) NGHIÊN CỨU KHOA HỌC bệnh phẩm nghiêm ngặt, điều kiện vơ khuẩn tuyệt đối phòng mổ, bệnh phẩm bảo quản thiết bị vô khuẩn điều kiện vô trùng -200 tạo nên độ tin cậy kết Hơn tất q trình chạy PCR có chứng âm dương để kiểm sốt nghiêm ngặt độ xác phản ứng Nhược điểm PCR giải trình tự so với NCVK không cho kết kháng sinh đồ, đòi hỏi trang thiết bị, máy móc giá thành cao Tuy nhiên, với kết định danh xác giúp định hướng rõ ràng cho điều trị lâm sàng Hơn nữa, kết xác định ngun gây bệnh có vai trò lớn nghiên cứu khía cạnh dịch tễ học lâm sàng bệnh lí VMNNNS VK Như nói trên, bệnh VMNNNSVK Việt Nam có đặc thù riêng so với y văn: báo cáo nước phát triển cho thấy bệnh thường xuất BN suy giảm miễn dịch, sức đề kháng (do nhiều nguyên nhân, mắc phải bẩm sinh) [8], Việt Nam bệnh lại thường xuyên gặp BN hồn tồn khỏe mạnh, khơng có tiền sử bệnh toàn thân rõ ràng Khi tiến hành nghiên cứu, cố gắng xác định ổ nhiễm trùng nguyên phát khám nghiệm toàn thân hàng loạt như: cấy máu, cấy nước tiểu, chụp XQ phổi, siêu âm ổ bụng tổng quát,… Nhưng nay, chưa xác định mối liên quan rõ rệt Kết nhóm nghiên cứu cho thấy gần ½ TH tác nhân gây bệnh phế cầu, mở hướng cho nghiên cứu: tìm kiếm ổ nhiễm trùng nguyên phát đường hô hấp trên, nơi cư trú thường xuyên phế cầu Các BN nghiên cứu cần ngoáy họng hàng loạt để chẩn đoán, khẳng định mối liên hệ phế cầu họng, hầu với VMNNNSVK Khi lật lại hồ sơ lưu trữ BN, sau xác định tác nhân gây bệnh phế cầu, thật bất ngờ thấy bệnh cảnh lâm sàng có nhiều điểm tương đồng: bệnh xảy cấp tính, ban đầu thường biểu nặng bán phần trước với tổn hại nặng giác mạc (phù giác mạc dội, áp xe vòng, xuất tiết dầy tiền phòng) thường để lại di chứng nặng nề (loạn dưỡng giác mạc) nhiễm trùng điều trị thành cơng V KẾT LUẬN PCR giải trình tự có độ nhạy độ đặc hiệu cao, trả kết nhanh giúp ích nhiều cho cơng tác chẩn đốn điều trị bệnh VNNNSVK Hơn nữa, hoàn cảnh Việt Nam, xét nghiệm hứa hẹn giúp ích nhiều cho việc xác định chế bệnh sinh bệnh, vấn đề mà tồn đọng nhức nhối ngành Nhãn khoa TÀI LIỆU THAM KHẢO BROSIUS, J, M L PALMER, P J KENNEDY and H F NOLLER, 1978: “Complete nucleotide sequence of a 16S ribosomal RNA gene from Escherichia coli”, Proc Natl Acad Sci USA, 754801-4805 N M CAROLL, E E M JAEGER, S CHOUDHURY, A A S DUNLOP, M M MATHESON, P ADAMSON, N OKHRAVI, S LIGHTMAN: “Detection of and Discrimination between Gram Positive and Gram - Negative Bacteria in Intraocular 10 Nhãn khoa Việt Nam (Số 20 - 2010) Samples by Using Nested PCR”, J Clin Microbio, May 2000, p 1753–1757 P GOLDSCHMIDT, S DEGORGE, D BENALLAOUA, et al: “New test for the diagnosis of bacterial endophthalmitis”, Br J Ophthalmol, 2009, 93:1089-1095 originally published online February 10, 2009 HOÀNG THỊ HIỀN (2005), “Nghiên cứu đặc điểm lâm sàng số tác nhân gây viêm mủ nội nhãn nội sinh”, Luận văn thạc sĩ, Đại học Y Hà Nội NGHIÊN CỨU KHOA HỌC F T KERKHOFF, A VAN DER ZEE, A M C BERGMANS, A ROTHOVA: “Polymerase Chain D SEAL, U PLEYER Ocular infection, 2nd ed Informa Healthcare USA, Inc, 2007: 61-79 Reaction Detection of Neisseria meningitidis in D SEAL, U REISCHL,ABEHR, C FERRER, the Intraocular Fluid of a Patient with Endogenous J ALIO´, R J KOERNER, P BARRY: “The ESCRS Endophthalmitis but without Associated Meningitis” Endophthalmitis Study Group Laboratory diagnosis Ophthalmology, 2003; 110:2134-2136 of endophthalmitis: Comparison of microbiology N OKHRAVI, PADAMSON, S LIGHTMAN: and molecular methods in the European Society of “Use of PCR in endophthalmitis”, Ocular Immunology Cataract & Refractive Surgeons multicenter study and Inflammation, 2000, Vol 8, No 3, pp 189-200 and susceptibility testing” J Cataract Refract Surg N OKHRAVI, P ADAMSON, M M 2008; 34:1439–1450 MATHESON, H M A TOWLER, S LIGHTMAN 10 K L THERESE, A R ANAND AND H PCR-RFLP: “Mediated Detection and Speciation N MADHAVAN: “Polymerase chain reaction in of Bacterial Species Causing Endophthalmitis”, In- the diagnosis of bacterial endophthalmitis”, Br J vest Ophthalmol Vis Sc, 2000, 41:1438-1447 Ophthalmol, 1998 82: 1078-1082 SUMMARY USING PCR AND SEQUENCING IN CAUSATIVE DIAGNOSIS OF BATERIAL ENDOGENOUS ENDOPHTHALMITIS Objectives: Report the preliminary result of PCR and sequencing in bacterial investigations of vitreous samples from suspected bacterial endogenous endophthalmitis patients Methods: Non-control descriptive study Using PCR and sequencing to analyze 23 vitreous samples from 23 clinically diagnosed bacterial endophthalmitis cases (treated in VNIO from 4/2008 to 11/2008) in comparing with conventional microbiological techniques (Gram stain and culture) The tests were done in Biology Department, Gifu university, Japan in January 2009 Results: Gram stain showed: 8/23 (34.8%) cases were negative while PCR and sequencing were positive in all cases In 10/23 (43.5%) cases more than bacteria were seen on Gram stain but only of them were confirmed on PCR and sequencing In the remaining 7, only bacteria was detected Culture showed: low positive rate (3/23 – 13%) but matched with the result of PCR and sequencing PCR and sequencing showed: nearly ½ (11/23) cases were Streptococcus pneumoniae The other were mix (e.g more than bacteria) without cloning done due to shortage of time and budget The remaining included: Enterococcus casseliflanis (1), Streptococcus sp (1), Staphylocuccus sp (1), S heamolyticus (1), Bacillus sp (1), S sciuri (1), Enterobacter hormaecher (1) Conclusion: PCR and sequencing gave much better result than Gram stain and culture did, which would play a vital role in the disease management and also in the identification of the primary infection of the bacterial endogenous endophthalmitis Key words: Endogenous endophthalmitis, PCR, Sequencing Nhãn khoa Việt Nam (Số 20 - 2010) 11 ... để xác định loại VK Kết PCR giải trình tự tóm tắt vào bảng (Tất TH S pneumoniae định danh phân tích trình tự gen 16S rRNA dnaJ) Bảng Kết PCR giải trình tự Loại vi khuẩn Số lượng (%) S pneumoniae... lại phản ứng đồng thời Với biện pháp loại bỏ ức chế tất mẫu bệnh phẩm (23 mẫu) - Giải trình tự DNA: Các sản phẩm PCR sau khuếch đại, giải trình tự hệ thống máy giải trình tự động PRISM 3100 Genetic...NGHIÊN CỨU KHOA HỌC chẩn đoán nguyên nhân bệnh Vi c xác định tác nhân gây bệnh có tầm quan trọng to lớn, định hiệu trình điều trị tiên lượng chức bệnh Cho đến nay, xét nghiệm vi sinh kinh điển thường