Nghiên cứu được thực hiện với mục tiêu nhằm nghiên cứu phân lập vi khuẩn streptococcus feacalis từ ruột người, nuôi cấy thu sinh khối và tạo vi nang chứa vi khuẩn sử dụng làm probiotic điều trị tiêu chảy do loạn khuẩn.
Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 Nghiên cứu Y học TẠO VI NANG CHỨA VI KHUẨN STREPTOCOCCUS FEACALIS DÙNG CHO ĐIỀU TRỊ LOẠN KHUẨN ĐƯỜNG RUỘT Huỳnh Thị Ngọc Lan*, Hồ Thị Yến Linh* TÓM TẮT Đặt vấn đề: Streptococcus feacalis thuộc nhóm vi khuẩn có lợi ruột người thường sử dụng chế phẩm probiotic trị tiêu chảy sử dụng kháng sinh Vi khuẩn nhạy cảm với số yếu tố tác động dịch tiêu hóa dịch bao tử, dịch ruột Khi sử dụng loại tá dược tan ruột để bao vi khuẩn dạng vi nang cải thiện đáng kể tác động có hại đến vi khuẩn trình bảo quản sử dụng Mục tiêu: phân lập vi khuẩn Streptococcus feacalis từ ruột người, nuôi cấy thu sinh khối tạo vi nang chứa vi khuẩn sử dụng làm probiotic điều trị tiêu chảy loạn khuẩn Phương pháp: Vi khuẩn bao vi nang với Eudragit L3055 máy bao tầng sôi FDBG-5 công ty chế tạo máy dược phẩm Tiến Tuấn Khảo sát khả chịu đựng acid, muối mật nồng độ khác vi khuẩn dạng vi nang sau khoảng thời gian xác định Khảo sát khả trị tiêu chảy loạn khuẩn chuột Kết quả: Đã tạo dạng vi nang chứa vi khuẩn với máy bao tầng sôi FDBG-5 Vi khuẩn dạng vi nang cho thấy khả chịu đựng acid tốt hẳn dạng vi khuẩn trần Có 14,5 % vi khuẩn sống sót điều kiện pH1 sau vi khuẩn trần có 0,001 % Khả chịu đựng muối mật có cải thiện đáng kể so vớí dạng vi khuẩn trần Trong dịch muối mật 2%, có 5,07 % vi khuẩn trần sống sót vi khuẩn dạng vi nang 165 % Kết điều trị tiêu chảy loạn khuẩn chuột cho thấy kết khả quan với 100 % chuột khỏi tiêu chảy lơ thử 40 % tiêu chảy Kết luận: Đã chế tạo thành công vi nang chứa vi khuẩn Streptococcus feacalis sử dụng cho điều trị tiêu chảy loạn khuẩn ruột Từ khóa: Loạn khuẩn đường ruột, vi nang, probiotic ABSTRACT PREPARING THE MICROCAPSULE CONTAINING STREPTOCOCCUS FEACALIS FOR TREATING INTESTINAL DYSMICROBIA Huynh Thi Ngoc Lan, Ho Thi Yen Linh * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 15 - Supplement of No - 2011: 545 - 550 Background: Streptococcus feacalis is a bacterium inhabiting the gastrointestinal tracts of humans It is among the main constituents of some probiotic products Streptococcus feacalis is very vulnerable to moisture, temperature, gastric juice and bile acid Preparing microencapsulated Streptococcus feacalis with enteric polymer Eudragit to improve those problems Objective: Preparing the microcapsule containing Streptococcus feacalis by Eudragit L3055 To examine the stability and acid and bile salt tolerance of those microcapsules To assess the microcapsule containing Streptococcus feacalis for treating intestinal dysmicrobia Methods: The microcapsulating process was carried out by using a fluidized bed granulator, (FDBG-5, Tientuan Pharmaceutical Machinery co.,Vietnam) Investigating the viability, acid and bile salt tolerance of *Bộ môn Vi sinh- Ký sinh Khoa Dược, ĐH Y Dược TP HCM, TP.HCM Tác giả liên lạc: TS Huỳnh Thị Ngọc Lan ĐT: 0907123548 Email: tshuynhngoclan@yahoo.com Chuyên Đề Dược Khoa 545 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 microcapsulated Streptococcus feacalis Results: Results show that Eudragit L3055 microcapsules can be prepared for bacterial cell encapsulation and are stable in conditions FDBG-5, Tientuan Pharmaceutical Machinery co.,Vietnam Eudragit coated microcasule containing Streptococcus feacalis enhanced acid tolerance of 14.5 %, but naked Streptococcus feacalis show low acid tolerance of 0.001 % In bile salt of 2%, Streptococcus feacalis in enteric coated microcapsules, the survival rate was 165 % whereas naked only 5.07 % Resuls of microcapsule containing Streptococcus feacalis treating intestinal dysmycrobia show that the survival rate was 100 % compaire with 40 % in the control group Conclusion: This study successfully prepared microencapsulated Streptococcus feacalis for treating intestial dysmicrobia Key words: intestinal dysmicrobia, microcapsule, probiotic MỞ ĐẦU Hiện giới việc nghiên cứu sử dụng vi sinh vật sống dạng dược phẩm (probiotic) phát triển mạnh đặc biệt vi khuẩn lactic ưu điểm vượt trội chúng có lợi cho sức khỏe người Streptococcus feacalis vi khuẩn thường phối hợp với vi khuẩn lactic khác sử dụng làm probiotic rộng rãi điều trị loạn khuẩn tiêu hóa nhiều nguyên nhân khác nhau(2) Hiệu điều trị chế phẩm probiotic phụ thuộc nhiều vào số lượng vi khuẩn sống đưa vào nơi cần có tác dụng điều trị Streptococcus feacalis vi khuẩn bị số tác động yếu tố môi trường như: oxi, độ ẩm, dịch tiêu hóa… dẫn đến số lượng tế bào sống bị giảm trình sản xuất, bảo quản sử dụng Do hướng bào chế sản phẩm probiotic nghiên cứu bào chế vi nang (microencapsulated) để bảo vệ vi khuẩn trước tác dụng yếu tố bất lợi bên tăng tác dụng điều trị chế phẩm Máy tạo bao tầng sôi FDBG-5.của Công ty chế tạo máy dược phẩm Tiến Tuấn Kính hiển vi điện tử SEM JOEL-JSM 5500 Nhật Môi trường phân lập nuôi cấy vi khuẩn: Môi trường SF (viết tắt từ Streptococcus faecalis), môi trường NB (Nutrient Broth) bổ sung yeast extract ngoại nhập (môi trường số 1), môi trường chứa dịch chiết nấm men tự chế bổ sung sữa (môi trường số 2) Thú thử nghiệm: chuột nhắt trắng chủng Swiss, khoẻ mạnh, không dị tật, phái tính ngẫu nhiên Trọng lượng từ 18- 20 gam Các lô nuôi điều kiện Số lượng thú thử nghiệm: thử nghiệm 40 chuột, chia làm lô: lô thử lô chứng, lô 20 để thử nghiệm khả điều trị tiêu chảy vi nang chứa Streptococcus faecalis Chế phẩm Lactomin® Han quốc sử dụng đối chứng Phương pháp Mẫu phân người: 100 mẫu phân trẻ em độ tuổi sơ sinh, 100 mẫu phân người trưởng thành, khơng phân biệt nam, nữ, tình trạng sức khỏe bình thường, khơng mắc bệnh đường tiêu hóa, khơng sử dụng kháng sinh Phân lập tinh khiết hóa chủng Streptococcus faecalis từ ruột người Các chủng vi khuẩn từ phân phân lập nhiều lần môi trường chọn lọc SF Trên mơi trường SF, có cầu khuẩn Gram dương lựa chọn để định danh Tiếp tục phân lập nhiều lần để có vi khuẩn tinh khiết, định danh phản ứng sinh hóa để chọn lọc chủng Streptococcus faecalis Các loại tá dược bao vi nang: protein, Eudragit® L3055 Đức Ni cấy thu sinh khối vi khuẩn: sử dụng chủng vi khuẩn Streptococcus faecalis VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Vật liệu 546 Chuyên Đề Dược Khoa Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 phân lập định danh phản ứng sinh hóa Khảo sát mơi trường thích hợp điều kiện nuôi cấy vi khuẩn Streptococcus faecalis thu sinh khối để làm nguyên liệu tạo vi nang chứa vi khuẩn Tạo vi nang(1,3): Sơ đồ cấu tạo vi nang chứa vi khuẩn: Hình Sơ đồ cấu tạo vi nang chứa vi khuẩn Tạo vi nang máy bao tầng sôi FDBG-5 Chúng sử dụng dịch bao protein, Eudragit L3055 Xây dựng qui trình bao với thơng số như: cơng thức lượng dịch bao, tốc độ phun dịch bao, nhiệt độ cốm làm việc, tốc độ quạt hút, độ ẩm Phương pháp đếm vi khuẩn sống: sử dụng phương pháp đếm sống môi trường NB (Nutrient Broth) để xác định số lượng vi khuẩn gam chế phẩm Khảo sát khả kháng acid vi khuẩn vi nang hóa(4): khảo sát khả chịu đựng vi khuẩn dạng vi nang hóa mơi trường pH1 sau khoảng thời gian từ 1h-3h, sau ly tâm tách vi khuẩn khỏi dịch acid, cho vào 100ml dung dịch đệm pH 8, lắc kỹ 30 phút Đếm vi khuẩn sống sót sau khoảng thời gian Khảo sát khả chịu đựng muối mật vi khuẩn vi nang hóa(4): khảo sát khả sống sót vi khuẩn dạng vi nang nồng độ muối mật 2% Sau khoảng thời gian 2h, 4h, 8h, 12h, 24h ly tâm bỏ dịch mật cho cắn vi khuẩn vào100 ml đệm pH8 Lắc kỹ 30 phút để giải phóng vi khuẩn khỏi vi nang Xác định tỷ lệ vi khuẩn sống sót phương pháp đếm sống Các kết so sánh với vi khuẩn trần chế phẩm thương mại Lactomin® Chuyên Đề Dược Khoa Nghiên cứu Y học Thử nghiệm tác dụng trị tiêu chảy in vivo vi khuẩn S faecalis dạng vi nang Xây dựng mơ hình gây tiêu chảy chuột nhắt trắng: xây dựng mô hình để đánh giá khả điều trị tiêu chảy chế phẩm thử nghiệm loạn khuẩn ruột chuột nhắt Gây tiêu chảy chuột nhắt hỗn hợp hai kháng sinh với liều sử dụng 20 mg Streptomycin + 30 mg Lincomycin / 10 g chuột, lần / ngày Sau toàn chuột bị tiêu chảy chuyển qua uống kháng sinh liều trì 1/10 liều kháng sinh để hạn chế khả tự phục hồi Gây tiêu chảy chuột thử nghiệm mơ hình trên, sau chia chuột làm 02 lô, lô 20 KẾT QUẢ Kết phân lập định danh vi khuẩn Streptococcus faecalis Từ 100 mẫu phân su trẻ em 100 mẫu phân người lớn, phân lập môi trường chuyên biệt thu 140 chủng cầu khuẩn có đặc tính như: khóm nhỏ 1mm, cầu khuẩn Gram dương, xếp dạng chuỗi, catalase (-).Tiếp tục định danh mức độ loài cho kết lên men đường tính chất khác như: nhạy cảm vi khuẩn Bacitracin Bactrim môi trường thạch máu, phản ứng với Bile esculine, khả tăng trưởng dung dịch NaCl 6,5%, khả tồn 10 oC, 45 oC, chúng tơi nhận thấy có 34 chủng có đặc điểm giống mơ tả Streptococcus faecalis sách phân loại vi khuẩn Bergey Vì chủng tiếp tục nuôi cấy để chọn lọc chủng có khả tăng trưởng tốt môi trường nuôi cấy chế tạo, từ ni cấy thu sinh khối để sử dụng làm probiotic Nuôi cấy thu sinh khối thử nghiệm thực chủng S faecalis chọn lọc từ chủng có khả tăng trưởng tốt mơi trường tiêu chuẩn Kết quả: sử dụng môi trường từ dịch chiết nấm men sổ sung sữa để nuôi cấy S faecalis cho 547 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 kết tốt, hiệu suất nuôi cấy cao gần tương đương với môi trường sử dụng yeast extract ngoại nhập pepton Ngoài bổ sung Yeast extract pepton ngoại nhập nên giá thành thấp nhiều Đây môi trường có triển vọng thích hợp cho việc ni cấy S faecalis để thu sinh khối dùng làm nguyên liệu cho sản xuất probiotic Kết cho thấy số chủng thử nghiệm, chủng E92 có khả tăng trưởng tốt sử dụng nuôi cấy thu sinh khối với khả tăng trưởng 1500 lần Bảng Kết nuôi cấy S faecalis môi trường khác MT số Số VK ban đầu CFU/ ml Số lần gia tăng E02 1,2.107 1,48.1010 1233 E05 1,2.107 1,57.1010 1308 E06 1,2.107 1,71.1010 1425 Mẫu Hình Vi nang MT số Số lần gia CFU/ ml tăng 1,39.1010 1158 1,49 1010 1241 1,61.1010 1341 Hình Hạt vi nang Mẫu E28 E47 E71 E92 E109 MT số Số VK ban đầu CFU/ ml Số lần gia tăng 1,2.107 1,54.1010 1283 1,2.107 1,6.1010 1333 1,2.107 1,64.1010 1366 1,2.107 1,82.1010 1516 1,2.107 1,58.1010 1316 MT số Số lần gia CFU/ ml tăng 1,44.1010 1200 1,53.1010 1275 1,62.1010 1350 10 1,8.10 1508 1,52.1010 1266 Tạo vi nang chứa vi khuẩn Sinh khối vi khuẩn thu sau q trình ni cấy đơng khơ thu bột vi khuẩn với hàm lượng khoảng 10 CFU/ g Chúng tơi xây dựng qui trình bao vi nang bột vi khuẩn với tá dược bao protein Eudragit L3055 Thử nghiệm với dịch bao chứa protein Eudragit L3055 khác nhau.(Bảng 2, 3) Các vi nang tạo thành khảo sát kính hiển vi quang học kính hiển vi điện tử (Hình 2, hình 3, hình 4) Hình Bề mặt t vi nang KHV (x 400) KHV điện tử quét (x100) KHV điện tử quét (x1500) Bảng Ảnh hưởng lượng dịch bao protein đến trình tạo vi nang Tỷ lệ protein/ Tỷ lệ vi khối lượng Hình thức cảm quan bột khuẩn bột sống sót Quan sát kính hiển vi thấy 0,5% có nhiều hạt rải rác thị 90 % trường Thể tích khối bột tăng lên, 1% kính hiển vi thấy hạt riêng lẻ 83 % thị trường Dưới kính hiển vi thấy có hạt 1,5 % bám thị trường, hạt 80 % xốp, không vón cục Nhận xét: với tỷ lệ chất bao bột vi khuẩn từ 0,5% đến % cho tỷ lệ vi khuẩn sống sót cao 548 tỷ lệ 1,5 % nhiên quan sát kính hiển vi cho thấy nhiều tiểu phân chưa bao Tuy nhiên tăng nồng độ cao dẫn đến tình trạng vón cục tăng tỷ lệ vi khuẩn chết nồng độ 1,5% lựa chọn cho trình bao lớp Bảng Tỷ lệ sống sót vi khuẩn nhiệt độ cốm làm việc công thức lớp thứ dịch bảo vệ khác Các thông số Nhiệt độ cốm làm việc Tốc độ phun dịch bao bảo vệ Tỷ lệ Eudragit® / bột(kl/kl) Lơ G 33 Lơ H 33 Lô I 34 17 17 17 1,5 % 2% 2,5 % Chuyên Đề Dược Khoa Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ Số * 2011 Các thông số Lô G Lô H Lơ I hạt hạt Dễ bị dính, Tình trạng vi nang tạo xốp, khơng xốp, khơng vón cục thành vón cục vón cục Số lượng vi khuẩn ban 8,5.1010 9,2.109 8,2.109 đầu (CFU/g) Số lượng vi khuẩn sau 1,6.109 3,2.109 2,5.109 trình tạo vi nang Tỷ lệ sống sót vi 39% 38% 35% khuẩn Nhận xét: nhiệt độ cốm làm việc khoảng 33 C -35 oC không ảnh hưởng nhiều đến tỷ lệ vi khuẩn sống sót sau q trình tạo vi nang Các cơng thức dịch bao lớp thứ có ảnh hưởng đến tỷ lệ vi khuẩn sống sót nồng độ chất tan dịch bao có ảnh hưởng đến thời gian bốc dịch bao trình phun Ở tỷ lệ chất bao/ khối lượng vi khuẩn 1,5 %, khả sống sau trình bao cao so với tỷ lệ cao (2,5 %) thời gian bao Tuy nhiên dựa vào kết khảo sát khả chịu đựng tác động môi trường vi nang để đánh giá hiệu lớp bao để chọn tỷ lệ thích hợp, chúng tơi chọn tỷ lệ 2% tỷ lệ cho cấu trúc vi nang có khả bảo vệ vi khuẩn tác động acid muối mật mơi trường o Khảo sát kích thước hạt vi nang Bảng Kích thước vi nang chứa vi khuẩn Kích thước vi 710-1400 355-710 180-355 125-180