Đang tải... (xem toàn văn)
Bài thuyết trình: Ứng dụng kĩ thuật phân tử trong xét nghiệm nông nghiệp trình bày giới thiệu nguyên lý kỹ thuật PCR, nguyên lí hoạt động của PCR, một số ứng dụng của PCR trong nông nghiệp hiện nay. Để nắm vững nội dung chi tiết mời các bạn cùng tham khảo tài liệu. Hi vọng tài liệu sẽ giúp ích cho các bạn trong quá trình học tập cũng như nghiên cứu của mình.
TRƯỜNG ĐẠI HỌC ĐÀ LẠT KHOA SINH HỌC ỨNG DỤNG KĨ THUẬT PHÂN TỬ TRONG XÉT NGHIỆM NƠNG NGHIỆP Chủ nhiệm bộ mơn: LÊ NGỌC TRIỆU Danh sách thành viên Đặt vấn đề Nhờ phát minh kĩ thuật PCR mà ngành sinh học phân tử và nhiều ngành khoa học khác có sử dụng kĩ thuật sinh học phân tử được tiếp cận với một phương pháp mới đem lại kết quả có ý nghĩa to lớn, trong đó có các nghiên cứu về các lĩnh vực y tế, khoa học đời sống. PCR là phương pháp đơn giản, dễ thực hiện, có độ nhậy và tính đặc hiệu rất cao; do đó, PCR rất thích hợp cho xét nghiệm chẩn đốn trong lĩnh vực y học, pháp y, bệnh lí cây trồng NHƯ VẬY: TẠI SAO LẠI LỰA CHỌN PHƯƠNG PHÁP XÉT NGHIỆM BẰNG KĨ THUẬT PCR ? CƠ SỞ NÀO ĐỂ THIẾT KẾ CÁC MỒI ĐẶC HIỆU CHO MỘT PHẢN ỨNG TRONG MỘT CHUẨN ĐỐN ? TRÊN ĐỐI TƯỢNG LÀ VIRUS CẦN CĨ NHỮNG LƯU Ý GÌ TRONG PHẢN ỨNG ? Ý NGHĨA CỦA VIỆC CHUẨN ĐỐN BẰNG XÉT NGHIỆM NÀY TRONG NƠNG NGHIỆP ? I. Giới thiệu ngun lý kỹ thuật PCR II. Ngun lí hoạt động của PCR III. Một số ứng dụng của PCR trong nơng nghiệp hiện nay I.Giới thiệu ngun lý kỹ thuật PCR Dựa vào cơ chế tổng hợp gen đặc hiệu trong tế bào, nhà hóa sinh người Mĩ Karry Mullis đã phát minh ra kĩ thuật tổng hợp gen trong ống nghiệm (PCR) vào năm 1985. PCR là phương pháp in vitro để tổng hợp một đoạn DNA đặc thù nhờ cơng hiệu của 2 mồi oligonucleotide gắn vào 2 sợi đơi của đoạn DNA đích với sự tham gia của DNA polymerase Phản ứng PCR được thực hiện qua 3 giai đoạn trong 1 chu kì: Giai đoạn biến tính (denaturation) Giai đoạn bắt cặp (annealing) Giai đoạn kéo dài (elongaction) Chu kì này được lặp đi lặp lại từ 20 40 lần và cho ra các sản phẩm cuối cùng của PCR là các đoạn DNA hoặc RNA phiên bản. Số lượng các bản sao này được tính theo hàm số mũ Máy PCR II.Ngun lí hoạt động của PCR 1. Các thành phần tham gia vào phản ứng PCR ( PCR mix): DNA khn Taq. DNA polymerase d NTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) Primer ( oligonucleotide) PCR buffer 2. Ba giai đoạn phản ứng PCR thực hiện trên máy luân nhiệt (Thermalcycles) Giai đoạn biến tính (denaturation): 92 – 98 độ C - Giai đoạn bắt cặp (annealing) 45 thoi gian 20s2phut - Giai đoạn kéo dài (elongaction) nhiệt độ 6872 Giới thiêu các bước cơ bản của kỹ thuật PCR trong việc lấy mẫu đem phân tích Các bệnh phẩm y học Ly trích pre nucleic acide Ly trích acide nucleic tinh khiết PCR ( RT PCR) Thực hiện xét nghiệm chẩn Phân tích phát hiện sản phẩm đốn bằng PCR PCR bằng quang phổ hay điện di Sáu khâu chính của quy trình xét nghiệm bằng kỹ thuật PCR 1. Lấy mẫu: ADN có thể tách chiết từ những mẫu khác nhau, như máu tươi, máu khơ, tế bào niêm mạc, nước xúc miệng, tóc, da, phân, v.v Mẫu có thể lấy tại chỗ hoặc gửi từ xa hàng nghìn kilơmet, mất nhiều ngày, trong phong bì bình thường, qua bưu điện, khơng cần bảo quản lạnh Có thể là DNA kép, đơn, hoặc RNA được tách chiết từ các đối tượng nghiên cứu. DNA mẫu có độ ngun vẹn cao tránh lẫn tạp chất Lượng DNA được sử dụng cũng có khuynh hướng giảm (từ 1mg xuống còn 100µg) vì thế người ta sử dụng polymerase cho hiệu quả cao Kí hiệuLấy mẫu đem phân tích Phản ứng ELISA Đặt vấn đề: Ngồi việc xét nghiệm các bệnh lí do sinh vật gây ra, trong nơng nghiệp việc sử dụng các loại hóa chất, thuốc bảo vệ thực vật (BVTV) cũng là một yếu tố hết sức quan trọng. Dư lượng thuốc BVTV trong nơng sản hiện nay là vấn đề của xã hội. ELISA một phương pháp xét nghiệm đã được ứng dụng từ lâu trong xét nghiệm các bệnh lí, gần đây phát triển theo hướng kiểm tra, đánh giá mức độ ơ nhiểm dư lượng các hợp chất BVTV trong nơng sản và trong mơi trường sinh thái nơng nghiệp Định nghĩa: ELISA ( EnzymeLinked ImmunoSorbent Assay_ Xét nghiệm hấp thu miễn dịch liên kết với enzyme) dựa trên sự kết hợp giữa kháng ngun và kháng thể đặc hiệu, phản ứng tạo sản phẩm có màu hay phát sáng. Trong đó tính chất họat hóa của enzyme và độ đặc hiệu của kháng thể là khơng đổi Ngun tắc: Sử dụng KT đơn dòng(Mabs) phủ bề mặt những đĩa giếng. Nếu có sự hiện diện của KN trong mẫu,KN sẽ tạo phức hợp với KT cố định trên giếng và KT tự do có gắn enzyme tạo thành một phức hợp kép(sandwich).Khi bổ sung cơ chất đặc hiệu của enzyme vào giếng,enzyme xúc tác phản ứng thủy phân cơ chất để tạo ra các sản phẩm có màu hay phát sáng Ðĩa plastic sử dụng để tiến hành xét nghiệm ELISA Có hai phương pháp xét nghiệm ELISA: Phương pháp ELISA gián tiếp(indirect ELISA): dùng để phát hiện kháng thể chuyên biệt trong huyết thanh Phương pháp ELISA trực tiếp( direct ELISA): dùng để phát hiện kháng nguyên trong mẫu xét nghiệm Các loại enzyme thường dùng: Alkaline phosphatase Peroxydase Glucoxydase βgalactosidase bộ KIT Elisa. Thí nghiệm kiểm tra sốt dengue bằng bộ KIT Elisa. Ưu điểm: Ưu điểm quan trọng nhất của phương pháp ELISA là độ nhạy cao, có thể phát hiện được phức hợp nhỏ KN_KT, cho phép phát hiện sớm tác nhân gây bệnh ở giai đoạn sớm khi mầm bệnh mới xâm nhiễm Nhanh,thao tác đơn giản Rẻ tiền, ít tốn sinh phẩm,hóa chất,số lượng mẫu lớn, rất thích hợp với việc phân tích đối với ngun liệu thơ Nhược điểm: độ chính xác khơng cao Phương pháp ELISA cạnh tranh dùng cho phân tích các thuốc trừ sâu (1) Cạnh tranh trực tiếp: Cố định kháng thể (2) Cạnh tranh gián tiếp: Cố định cộng hợp kháng ngun Trong kiểu (1), kháng thế là thuốc trừ sâu được phủ lên một giếng nhựa nhỏ. Một hapten(kháng ngun khơng hồn tồn) mơ phỏng thuốc trừ sâu được gắn với một Enzyme đánh dấu tạo nên cộng hợp enzyme có khả năng liên kết với kháng thể. Khi cho dịch chiết mẫu và cộng hợp enzyme vào trong các giếng, thuốc trừ sâu trong dịch chiết và cộng hợp enzyme sẽ cùng cạnh tranh nhau để liên kết với kháng thể. Sau khi rữa trơi những chất dư thừa sau pư cơ chất tương ứng với enzyme sẽ được cho vào dưới sự xúc tác của các enzyme pư tạo màu hay phát huỳnh quang sẽ xuất hiện trong giếng. Thuốc trừ sâu nhiều thì cộng hợp enzyme do kém cạnh tranh nên kháng thể giử lại ít màu sẽ nhạt và ngược lại Trong kiểu (2) cộng hợp giữa KN Protein sẽ được cố định trên bề mặt rắn. Thuốc trừ sâu và một lượng kháng thể cố định được cho vào, thuốc trừ sâu là một KN tự do sẽ cạnh tranh với KN cố định bám vào KT. Lượng KN tự do càng nhiều thì KT bị KN giữ cố định càng ít. Sau khi rữa trơi chất thừa sau pư người ta dùng một KT ... Nhờ phát minh kĩ thuật PCR mà ngành sinh học phân tử và nhiều ngành khoa học khác có sử dụng kĩ thuật sinh học phân tử được tiếp cận với một phương pháp mới đem lại kết quả có ý nghĩa to lớn, trong ... lượng thuốc BVTV trong nơng sản hiện nay là vấn đề của xã hội. ELISA một phương pháp xét nghiệm đã được ứng dụng từ lâu trong xét nghiệm các bệnh lí, gần đây phát triển theo hướng kiểm tra, đánh giá mức độ ơ nhiểm dư lượng các hợp chất BVTV trong nơng sản và trong mơi trường sinh thái nơng nghiệp. .. CƠ SỞ NÀO ĐỂ THIẾT KẾ CÁC MỒI ĐẶC HIỆU CHO MỘT PHẢN ỨNG TRONG MỘT CHUẨN ĐỐN ? TRÊN ĐỐI TƯỢNG LÀ VIRUS CẦN CĨ NHỮNG LƯU Ý GÌ TRONG PHẢN ỨNG ? Ý NGHĨA CỦA VIỆC CHUẨN ĐỐN BẰNG XÉT NGHIỆM NÀY TRONG NƠNG NGHIỆP ? I. Giới thiệu ngun lý kỹ thuật PCR