Bài viết nghiên cứu đánh giá hình thái cấu trúc của phôi trước đông, sau rã đông bằng kỹ thuật thủy tinh hóa và khả n ng phát triển của phôi rã đông nuôi cấy sau 24 giờ.
TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2018 NGHI N CỨU BIẾN ĐỔI HÌNH THÁI CẤU TRÚC PHƠI NGƢỜI NUÔI CẤY NGÀY TRƢỚC ĐÔNG LẠNH VÀ SAU RÃ ĐƠNG BẰNG KỸ THUẬT THỦY TINH HĨA Đồn Thị Hằng*; Quản Hoàng Lâm*; Nguyễn Thanh Tùng* Trịnh Thế Sơn*; Trịnh Quốc Thành*; Dương Đình Hiếu* TĨM TẮT Mục tiêu: đánh giá hình thái phơi trước đơng sau rã đơng phương pháp thủy tinh hóa, đánh giá khả phát triển phôi rã đông sau nuôi cấy 24 Đối tượng phương pháp: nghiên cứu mô tả tiến cứu 250 phôi ngày đông lạnh rã đơng phương pháp thủy tinh hóa (Vitrification) 79 bệnh nhân Trung tâm Công nghệ Phôi Kết kết luận: so với phác đồ đông lạnh chậm trước đây, đông lạnh phôi phương pháp thủy tinh hóa kỹ thuật tiết kiệm thời gian kinh tế, hiệu cho tỷ lệ phôi sống sau rã đông 95,2%, tỷ lệ phôi phân chia tiếp sau rã đông 68,4%, không thấy biến đổi đáng kể hình thái phơi sau rã đơng * Từ khóa: Phơi người đơng lạnh; Hình thái cấu trúc phơi; ỹ thuật thủy tinh hóa Transformation of Morphological Structure of Day-Three Human Embryos before Freezing and After Thawing by Vitrification Technique Summary Objectives: To assess embryological morphology before freezing and after thawing by vitrification technique and development of embryos after 24 hours cultivation Subject and methods: The prospective descriptive study was performed in 250 cryopreserved embryos in day by vitrification of 79 patients in the Centre of Advanced Technological Embryology Results and conclusion: Vitrification technique is far more efficient than the programmed slow freeze protocols, time saving and economical The survival rates was 95.2%, and the developing rates was 68.4%, without the considerable changes after thawing in morphology * Keywords: Frozen embryo human; Morphological structure; Vitrification technique ĐẶT VẤN ĐỀ Đơng lạnh phơi kỹ thuật thuỷ tinh hố (Vitrification) thử nghiệm thành công phôi động vật từ năm 1985 Trong kỹ thuật thủy tinh hóa, q trình làm lạnh mẫu với thời gian nhanh, * Học viện Quân y Người phản hồi (Corresponding): Đoàn Thị Hằng (hangdt166@gmail.com) Ngày nhận bài: 26/02/2018; Ngày phản biện đánh giá báo: 09/05/2018 Ngày báo đăng: 21/05/2018 43 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2018 khơng xảy hình thành tinh thể nước đá - yếu tố ảnh hưởng đến khả sống phát triển phôi Trong suốt trình hạ nhiệt độ, tồn khối vật chất bên bên tế bào (TB) chuyển thành dạng khối đặc, suốt Đông lạnh phôi kỹ thuật thủy tinh hóa Trung tâm Hỗ trợ Sinh sản lớn khu vực giới thử nghiệm đưa vào ứng dụng lâm sàng ống nghiệm, phơi có TB đồng đều, tỷ lệ mảnh vỡ bào tương (fragment) < 20% (phôi độ 3, độ 4) Tại Việt Nam, phương pháp thực Bệnh viện Phụ sản Từ Dũ từ tháng - 2006, bước đầu thu kết tốt Trung tâm Công nghệ Phôi bắt đầu thực đơng phơi kỹ thuật thuỷ tinh hố từ tháng 2006 Tất phôi đông lạnh ngày rã đông để chuyển cho BN Đông lạnh phơi định cho trường hợp: có phơi dư thừa sau chuyển phơi tươi; có tượng q kích buồng trứng mức độ vừa, nặng; không chuyển phôi không qua cổ tử cung; niêm mạc tử cung chưa tốt cho việc chuyển phôi tươi; trường hợp cho - nhận noãn mà chuẩn bị niêm mạc tử cung chưa tốt Để ứng dụng kỹ thuật đạt hiệu cao, an tồn góp phần hồn thiện phác đồ đông lạnh phôi, đặc biệt phác đồ đơng lạnh phơi kỹ thuật thủy tinh hóa, tiến hành nghiên cứu với mục tiêu: Đánh giá hình thái cấu trúc phơi trước đơng, sau rã đơng kỹ thuật thủy tinh hóa khả n ng phát triển phôi rã đông nuôi cấy sau 24 ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHI N CỨU Đối tƣợng nghiên cứu 250 phôi 79 bệnh nhân (BN) có phơi đơng lạnh ngày kỹ thuật thủy tinh hóa rã đơng Trung tâm Đào tạo Nghiên cứu Công nghệ Phôi, Học viện Quân y * Tiêu chuẩn lựa chọn phôi để trữ lạnh: Phôi nuôi cấy đến ngày thứ môi trường nuôi cấy thụ tinh 44 * Tiêu chuẩn loại trừ: phôi giai đoạn sớm độ 1, độ 2: TB không đồng đều, tỷ lệ mảnh vỡ bào tương ≥ 20% Phƣơng pháp nghiên cứu * Thiết kế nghiên cứu: mô tả cắt ngang, tiến cứu * Chọn mẫu nghiên cứu: * Chuẩn bị niêm mạc t cung: - Thuốc sử dụng: estrogen (provames mg, progynova mg), progesteron (utrogestan 100 mg) - Cho BN uống provames mg/ngày từ ngày thứ chu kỳ kinh - Siêu âm đo niêm mạc tử cung vào ngày thứ 10 chu kỳ kinh, chỉnh liều provames - Ngày 12 - 14: siêu âm đo niêm mạc tử cung: niêm mạc tử cung ≥ mm, bổ sung utrogestan 400 mg/ngày (đặt âm đạo) - Ngày 16 - 18 chuyển phơi * Đánh giá hình thái phơi ngày 3: Quan sát hình thái cấu trúc phơi kính hiển vi đảo ngược Olympus IX 70, độ phóng đại 200 lần: TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2018 Theo cách phân loại hình thái phôi Andres Salumet dựa theo số phôi bào, bào tương phôi bào, tỷ lệ mảnh vỡ bào tương phơi: có loại: dựa vào phần trăm thối hố TB theo tiêu chuẩn hình thái học Brian Dale Kay Elder(1997) [11]: + Thối hóa độ 1: thối hố < 25% - Phơi độ 4: phơi có - TB đồng đều, khơng có mảnh vỡ bào tương + Thối hóa độ 2: thối hố 25 - 50% - Phơi độ 3: phơi có - TB đồng đều, mảnh vỡ bào tương chiếm < 20% thể tích phơi + Thối hóa độ 4: thối hố hồn tồn - Phơi độ 2: phơi có tỷ lệ mảnh vỡ bào tương chiếm 20 - 50% thể tích phơi - Phơi độ 1: phơi có tỷ lệ mảnh vỡ bào tương chiếm > 50% thể tích phơi * Đánh giá hình thái phơi sau rã đơng: - Phôi ngày sau rã đông: phôi ngày đánh giá phơi sống có > 50% phơi bào sống sau rã đơng Nếu phơi ngun vẹn, chia thành độ phôi trước đông, đánh giá phơi thối hố + Thối hóa độ 3: thoái hoá > 50% - Đánh giá hiệu trữ phôi theo Ashwood-Smith MJ (1986) [10]: + sống phôi sau rã đông: phôi đánh giá hình dạng sau rã đơng Chỉ số sống (survival index) tính tỷ lệ TB sống/tổng số TB + phát triển phôi môi trường nuôi cấy: đánh giá phôi sau 24 giờ, biểu tỷ lệ sống (survival rate) tính tỷ lệ phôi sống/tổng số phôi rã đông KẾT QUẢ NGHI N CỨU Th y đổi độ dày màng suốt, đƣờng kính phơi số ƣợng phôi bào trƣớc đông ạnh s u rã đơng 2 A B Hình 1: Phơi ngày (A: Phôi tươi ngày thứ 3; B: Phôi ngày sống nguyên vẹn sau rã đông) (Quan sát kính hiển vi đảo ngược Olympus IX 70 với độ phóng đại 200 lần thấy có phơi bào; : Màng suốt; 2: Phơi bào) 45 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2018 Các phôi nuôi cấy đến ngày phôi giai đoạn phơi phân chia, phơi có khoảng - phơi bào quan sát kính hiển vi đảo ngược (hình 1A) Hình 2: Phơi ngày sống nuôi cấy ngày sau rã đông (Quan sát kính hiển vi đảo ngược Olympus IX 70 với độ phóng đại 200 lần thấy có phơi bào; : Màng suốt; 2: Phôi bào) Sau rã đơng, phơi bào sống có bào tương sáng màu, tròn (hình 1B), phơi sống tiếp tục nuôi cấy qua đêm, đếm số TB thấy tăng lên rõ rệt (hình 2), phơi bào thối hóa có bào tương co dúm, sẫm màu (hình 3) Hình 3: Phơi ngày thối hóa sau rã đơng (Quan sát kính hiển vi đảo ngược Olympus IX 70 với độ phóng đại 200 lần thấy có phơi bào, phơi bào bị thối hóa; : Màng suốt; 2: Phôi bào sống; 3: Phôi bào thối hóa) Sau rã đơng 250 phơi ni cấy ngày thứ 3, chúng tơi chụp ảnh phơi, sau đo độ dày màng suốt đường kính phơi, đếm số lượng TB ảnh để đảm bảo không để phơi bị phơi nhiễm lâu ngồi tủ cấy Thực kỹ thuật đo phần mềm Axio 4.8 (Hãng Carl Zeiss) 46 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2018 Bảng : Độ dày màng suốt phôi ngày trước đông lạnh, sau rã đông sau nuôi cấy thêm ngày Thời điểm Độ dày màng suốt trung bình (µm) (tối thiểu - tối đ ) p 14,70 ± 1,13 (10,70 - 21,30) p1-2 = 0,306 Phôi trước đông lạnh (1) Phôi sau rã đông (2) 14,80 ± 1,20 (11,3 - 20,7) Phôi rã đông sau nuôi cấy (3) p2-3 = 0,308 14,90 ± 1,08 (10,50 - 20,30) Độ dày màng suốt phôi ngày thứ thời điểm trước đông lạnh, sau rã đông sau nuôi cấy khơng khác biệt có ý nghĩa thống kê Bảng 2: Đường kính phơi phơi ngày trước đơng lạnh, sau rã đơng, sau ni cấy Đƣờng kính phơi trung bình (tối thiểu - tối đ , µm) p Trước đông lạnh (1) 147,20 ± 7,82 (132,40 - 165,30) p1-2 = 0,246 Sau rã đông (2) 147,50 ± 8,14 (135,50 - 158,70) Sau nuôi cấy (3) 149,50 ± 6,30 (135,40 - 167,90) Thời điểm p2-3 = 0,001 Độ dày màng suốt trung bình phơi ngày trước đơng lạnh sau rã đơng khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê Tuy nhiên, sau nuôi cấy thêm ngày, đường kính trung bình phơi lớn so với phôi sau rã đông, khác biệt có ý nghĩa thống kê với p = 0,001 Bảng 3: Số phôi bào phôi ngày trước đông lạnh, sau rã đông Chỉ tiêu Số phôi bào trung bình Trƣớc đơng S u rã đơng p 6,75 ± 1,04 (5 - 10) 6,62 ± 1,66 (0 - 10) 0,065 1.711 1.624 - Số phôi bào sống Sau rã đơng, số phơi bào trung bình khơng khác biệt có ý nghĩa thống kê so với trước đông lạnh (p = 0,065), số phôi bào sống sau rã đông 1.624 Hình thái phơi ngày trƣớc đơng ạnh, s u rã đông s u nuôi cấy 24 qu n sát dƣới kính hiển vi soi Bảng 4: Thay đổi hình thái phơi ngày trước đông lạnh sau rã đông Phân độ phôi Trƣớc đông ạnh S u rã đông Tỷ lệ phôi nguyên vẹn (%) n Tỷ lệ (%) n Tỷ lệ (%) Độ 99 39,6 99 39,6 100 Độ 151 60,4 122 48,8 80,8 Độ - - - - - Độ - - - - - 47 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QN SỰ SỐ 5-2018 Thối hóa - - 10 - Thối hóa - - 2,8 - Thối hóa - - 2,8 - Thối hóa - - - 250 100 250 100 - Tổng ết bảng cho thấy phôi lựa chọn để đông lạnh phôi độ 3, độ Trước đông lạnh phôi, số phôi độ 99 phôi (39,6%), số phôi độ 151 (64,2%) Sau rã đơng, hình thái phơi phân độ phôi giống phôi trước đông, kết cho thấy số phơi độ ngun vẹn 99 phơi, số phơi độ 122 phơi, lại phơi thối hóa độ (10 phơi), thối hóa độ có phơi, thối hóa độ 3: phơi thối hóa độ (thối hóa hồn tồn) phôi Như vậy, sau rã đông, số phôi độ ngun vẹn 100%, số phơi độ nguyên vẹn 80,8% Bảng 5: Thay đổi hình thái phôi sau rã đông sau nuôi cấy 24 Phân độ phôi S u rã đông Sau nuôi cấy 24 n Tỷ lệ (%) n Tỷ lệ (%) Độ 99 39,6 113 45,2 Độ 122 48,8 58 23,2 Độ - - 62 24,8 Độ - - 17 6,8 Thoái hóa 10 - - Thối hóa 2,8 - - Thối hóa 2,8 - - Thối hóa - - Tổng 250 100 250 100 Phôi sau rã đông tiếp tục nuôi cấy 24 giờ, đánh giá hình thái sau ni cấy phôi chia thành độ dựa vào phân chia tiếp phôi Số phôi độ sau nuôi cấy thêm ngày 113 phôi, tăng lên so với phôi trước đông 24 phôi, số phôi độ sau ni cấy có TB phân chia đánh giá phôi độ Số phôi độ giảm số phát triển thành phôi độ 4, số không phân chia trở thành phơi độ 2, số phơi thối hóa < 50% sau ni cấy tiếp tục 48 phân chia tạo thành phôi độ Số phôi độ phôi độ 3, độ không tiếp tục phát triển sau ni cấy tạo thành Có 17 phơi độ 1, phơi thối hóa độ 3, độ phơi có mảnh vỡ bào tương > 50% Như vậy, sau nuôi cấy qua đêm, phôi độ 4, độ 3, độ độ có tỷ lệ tương ứng 45,2%; 23,2%; 24,8% 6,8% Trong đó, phơi độ 2, 3, sử dụng để chuyển phôi, phôi độ phôi xấu khơng sử dụng để chuyển phơi TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2018 Bảng 6: Tỷ lệ phôi rã đông phân chia tiếp sau nuôi cấy 24 Chỉ tiêu n Tỷ lệ (%) Phôi rã đông 250 - Phôi sống 238 95,2 (238/250) Phôi tiếp tục phân chia 171 68,4 (171/250) Phôi độ rã đông phân chia tiếp 83 83,8 (83/99) Phôi độ rã đông phân chia tiếp 70 57,4 (70/122) Số phôi sống sau rã đông 238 phôi (95,2%), số phôi tiếp tục phân chia 171 phơi (68,4%), phơi độ phân chia tiếp sau rã đông 83 phôi (83,8%), tỷ lệ phôi tiếp tục phát triển phôi độ 57,4%, thấp so với phôi độ có ý nghĩa thống kê (p < 0,05) BÀN LUẬN - ết nghiên cứu cho thấy hình thái phơi độ dày màng suốt đường kính phơi trung bình trước đơng lạnh sau rã đơng khơng có khác biệt Nghiên cứu Yi-Fan Gu (2015), Sifer C (2013) cho kết tương tự Tỷ lệ phôi sống sau rã đông đạt 95,2%, kết phù hợp với báo cáo Bệnh viện Phụ sản Từ Dũ số tác giả nước H Tomari CS , Tetsunori ukaida CS (2012) Tỷ lệ phôi sống cao sau rã đông có ý nghĩa BN bị q kích buồng trứng nặng, niêm mạc tử cung không tốt để chuyển phơi tươi BN hồn tồn n tâm cộng tác điều trị chuyển phôi đông lạnh So với nghiên cứu đông lạnh phôi theo phương pháp đông lạnh chậm, tỷ lệ phôi sống sau rã đông đạt khoảng 60 - 80% 2, , phương pháp thủy tinh hóa cho tỷ lệ phơi sống cao, trình làm lạnh, phương pháp thủy tinh hóa khơng gây hình thành tinh thể nước đá, khơng làm ảnh hưởng đến phơi Phương pháp thủy tinh hóa thời gian hơn, đồng thời tiết kiệm lượng lớn ni tơ, đem lại hiệu kinh tế so với phương pháp đông lạnh chậm - Về khả phát triển phôi sau nuôi cấy: kết nghiên cứu cho thấy phôi sau rã đông nuôi cấy thêm phát triển tốt, tỷ lệ phôi phân chia tiếp đạt 68,4% ết tương tự H Tomari CS (Nhật) Nuôi cấy phôi qua đêm cho phép lựa chọn phơi có khả phát triển làm tổ, cho phép giảm số lượng phôi chuyển, giảm tỷ lệ đa thai, đồng thời giúp tiết kiệm phôi cho chu kỳ rã đông KẾT LUẬN Sau rã đơng 250 phơi phương pháp thủy tinh hóa cho thấy: - hơng thấy khác biệt có ý nghĩa thống kê hình thái cấu trúc phơi trước sau rã đông, tỷ lệ phôi sống sau rã đông 95,2% - Nuôi cấy phôi sau 24 giờ, tỷ lệ phơi tiếp tục phát triển 68,4% 49 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 5-2018 TÀI LIỆU THAM KHẢO Bệnh viện Phụ sản Từ Dũ Đông lạnh phôi trứng kỹ thuật thủy tinh hóa 2006 Đỗ Quang Minh Nguyên tắc kỹ thuật trữ lạnh phôi người Y học TP HCM 2002, tr.120-125 Đặng Quang inh CS Trữ lạnh phôi trứng người hỗ trợ sinh sản Sức khỏe Sinh sản 2005 Andres Salmets, Christel Hyden Granskog, Anne - Maria Suikkaro, Aila Tiitinen, Timo Tauro Human Reproduction 2001, 16 (10), pp.2177-2181 H Tomari, Y Nagata, K Hongo, K Takhara, K Kunitaka Optiming a vitrification protocol for human embryo cryopreservation on day 2; assessing the quality of embryo confirmed with early cleavage and morphological 50 grading Fertility and Sterility 2010, September Vol 86, Suppl Mukaida T, Takahashi K Vitrification of blastocysts using the cryoloop technique Vitrification in Assisted Reproduction 2012, pp.219-238 Medicult Vitrification 2006 Rall W.F, Fahy G.M Ice-free cryopreservation o of mouse embryos at -196 C by vitrification Nature 1985, 313, pp.573-575 Trounson A, Mohr L Human pregnancy following cryopreservation, thawing and transfer of an eight-cell embryo Nature 1983, 305, pp.707-709 10 Ashwood-Smith M.J The cryopreservation of human embryos Hum Reprod 1986, 5, pp.319-332 ... đồ đông lạnh phôi, đặc biệt phác đồ đông lạnh phơi kỹ thuật thủy tinh hóa, chúng tơi tiến hành nghiên cứu với mục tiêu: Đánh giá hình thái cấu trúc phôi trước đông, sau rã đông kỹ thuật thủy tinh. .. 14,70 ± 1, 13 (10,70 - 21 ,30 ) p1-2 = 0 ,30 6 Phôi trước đông lạnh (1) Phôi sau rã đông (2) 14,80 ± 1,20 (11 ,3 - 20,7) Phôi rã đông sau nuôi cấy (3) p2 -3 = 0 ,30 8 14,90 ± 1,08 (10,50 - 20 ,30 ) Độ dày... màng suốt phôi ngày thứ thời điểm trước đông lạnh, sau rã đông sau nuôi cấy không khác biệt có ý nghĩa thống kê Bảng 2: Đường kính phơi phôi ngày trước đông lạnh, sau rã đông, sau ni cấy Đƣờng