Nghiên cứu biến đổi siêu cấu trúc phôi người nuôi cấy ngày 5 trước đông lạnh và sau rã đông bằng kỹ thuật thủy tinh hóa

Mục tiêu của bài viết là đánh giá sự thay đổi hình thái siêu cấu trúc phôi người dưới kính hiển vi điện tử truyền qua. Đối tượng và phương pháp: nghiên cứu mô tả trên 20 phôi người nuôi cấy ngày 5 (10 phôi tươi và 10 phôi sau rã đông).

tạp chí y - dợc học quân số 4-2018 NGHIÊN CỨU BIẾN ĐỔI SIÊU CẤU TRÚC PHÔI NGƯỜI NUÔI CẤY NGÀY TRƯỚC ĐÔNG LẠNH VÀ SAU RÃ ĐÔNG BẰNG KỸ THUẬT THỦY TINH HĨA Đồn Thị Hằng*; Quản Hồng Lâm*; Nguyễn Thanh Tùng* CS TĨM TẮT Mục tiêu: đánh giá thay đổi hình thái siêu cấu trúc phơi người kính hiển vi điện tử truyền qua Đối tượng phương pháp: nghiên cứu mô tả 20 phôi người nuôi cấy ngày (10 phôi tươi 10 phôi sau rã đông) Kết quả: kính hiển vi điện tử, màng suốt phơi bị biến đổi độ xốp, không quan sát rõ sợi glycoprotein Những phôi bào sống sau rã đông bị tổn thương, bào tương có số điểm thối hóa hạt xuất khơng bào Những phơi bào thối hóa sau rã đơng thấy màng tế bào bị co rúm, ty thể bị biến dạng, lưới nội bào giãn rộng, màng nhân co rúm Kết luận: phơi sống sau rã đơng bị tổn thương * Từ khóa: Phơi người; Hình thái siêu cấu trúc; Kỹ thuật thủy tinh hóa Transformation of Morphological Ultrastructure of Day-Five Human Embryos before Freezing and after Vitrification Technique Summary Objectives: To assess the transformation of human embryological morphological ultrastructure in post-thawing stage under transmission electron microscope (TEM) Subject and methods: The descriptive study was performed on 20 human embryos in day (10 fresh and 10 thawing embryos) Results: Under electron microscope, the zona pellucida of embryos is transformed and loses its porosity; glycoprotein fibers are not clearly visible Embryos that survived after thawing show little damage; there are some particle degeneration and vacuoles appearance at some points in the cytoplasmic The degenerative post-thawing embryos show deformed cell membrane and mitochondria, expanded endoplasmic reticulum, and shrunk nuclear membrane Conclusions: Embryos that survived after thawing show little damage * Keywords: Human embryo; Morphological ultrastructure; Vitrification technique ĐẶT VẤN ĐỀ Thụ tinh ống nghiệm gồm q trình kích thích buồng trứng, thụ tinh nuôi cấy phôi Tuy nhiên, q trình chuyển phơi tươi đơi khơng thực niêm mạc tử cung chưa phù hợp, hội chứng q kích buồng trứng khơng chuyển phơi vào tử cung, đặc biệt số lượng phôi dư thừa lý phải thực phương pháp đông lạnh phôi Do vậy, đông lạnh phôi kỹ thuật thiếu trung tâm hỗ trợ sinh sản * Học viện Quân y Người phản hồi (Corresponding): Đoàn Thị Hằng (hangdt166@gmail.com) Ngày nhận bài: 10/02/2018; Ngày phản biện đánh giá báo: 14/03/2018 Ngày bỏo c ng: 26/03/2018 13 Tạp chí y - dợc häc qu©n sù sè 4-2018 Hiện nay, đơng lạnh phơi kỹ thuật thuỷ tinh hoá áp dụng rộng rãi nhiều trung tâm giới Việt Nam bảo quản phôi người Tuy nhiên, chưa có nhiều nghiên cứu sâu cấu trúc, siêu cấu trúc phôi trước sau rã đơng kỹ thuật thuỷ tinh hố Các nghiên cứu siêu cấu trúc giúp đánh giá xác tổn thương phôi mức độ tế bào sau q trình rã đơng, đồng thời giúp xác định hiệu phương pháp đông lạnh kỹ thuật thuỷ tinh hố Do đó, chúng tơi tiến hành nghiên cứu đề tài với mục tiêu: Đánh giá siêu cấu trúc phôi người nuôi cấy ngày trước đông lạnh sau rã đơng kính hiển vi điện tử truyền qua ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu + Kỹ thuật làm tiêu cho kính hiển vi điện tử truyền qua: tiến hành làm tiêu cho kính hiển vi điện tử truyền qua theo phương pháp Hayat M.A (1989) Nguyễn Kim Giao (2004) [1, 7] Đọc tiêu kính hiển vị điện tử truyền qua JEOL - 1011 có độ phân giải 2A°, điện áp 100 KV, Labo Kính hiển vi điện tử - Bộ mơn Mơ Phơi, Học viện Qn y - Tiêu chí đánh giá hình thái siêu cấu trúc phơi kính hiển vi điện tử quét kính hiển vi điện tử truyền qua: + Mô tả thay đổi cấu trúc màng suốt phôi trước đông lạnh sau rã đông kính hiển vi điện tử truyền qua + Mơ tả thay đổi cấu trúc màng tế bào, bảo quan bào tương, nhân tế bào phôi trước đơng lạnh sau rã đơng kính hiển vi điện tử truyền qua 20 phôi (được đồng ý bệnh nhân [BN]) 10 phơi tươi BN có phơi tươi dư thừa khơng có nguyện vọng lưu trữ phơi, 10 phơi sau rã đơng BN có phơi lưu trữ, có đủ số con, tự nguyện hiến phôi cho nghiên cứu Tất phôi đánh giá lựa chọn theo thang điểm K.Gardner với tiêu chuẩn sau: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Siêu cấu trúc phôi tươi * Tiêu chuẩn lựa chọn: phơi ngày có điểm đánh giá AA, AB, BA, BB * Tiêu chuẩn loại trừ: phôi ngày có điểm đánh giá C Phương pháp nghiên cứu * Các kỹ thuật nghiên cứu: - Kỹ thuật đơng phơi: + Quy trình đơng lạnh phơi kỹ thuật thủy tinh hóa: sử dụng quy trình đơng lạnh cực nhanh theo phương pháp Cryotop Masashige Kuwayama (2005) [8] 14 Ảnh 1: Màng suốt phôi tươi ngày (TEM - 10.000X) (1: Ranh giới màng ZP; 2: Glycoprotein dạng sợi; 3: Protein dạng hạt) Quan sát độ phóng đại lớn (10.000X) thấy màng suốt phơi tươi ngày 5, nhìn rõ glycoprotein dạng sợi hướng sợi tạp chí y - dợc học quân số 4-2018 Ảnh 2: Tế bào nụ phôi phôi tươi ngày (TEM - 4.000X) (1: Màng nhân; 2: Nhân tế bào; 3: Ty thể; 4: Lưới nội chất; 5: Hạt glycogen) Ảnh 3: Tế bào nuôi phôi tươi ngày (TEM - 4.000X) (1: Nhân tế bào; 2: Hạt nhân; 3: Ty thể; 4: Lưới nội chất có hạt; 5: Hạt glycogen) Quan sát hình ảnh tế bào phôi tế bào nuôi phôi phôi tươi ngày độ phóng đại 4000X thấy tế bào có màng, bào tương, nhân hạt nhân rõ, bào tương thấy bào quan ty thể, lưới ni cht, ht glycogen 15 Tạp chí y - dợc häc qu©n sù sè 4-2018 Siêu cấu trúc phơi sống sau rã đông Ảnh 4: Màng suốt phôi ngày sau rã đông (TEM - 10.000X) (1: Ranh giới màng ZP; 2: Glycoprotein dạng sợi; 3: Protein dạng hạt) Quan sát màng suốt phơi ngày sau rã đơng độ phóng đại 10.000X thấy màng suốt giảm mật độ điện tử so với trước đông lạnh, không quan sát thấy rõ glycoprotein dạng sợi phôi trước đông lạnh Ảnh 5: Tế bào nụ phôi phôi ngày sau rã đông (TEM - 2.000X) (1: Màng nhân; 2: Nhân tế bào; 3: Ty thể; 4: Lưới nội chất; 5: Không bào) 16 tạp chí y - dợc học quân số 4-2018 Ảnh 6: Tế bào nuôi phôi ngày sau rã đông (TEM - 5.000X) (1: Nhân tế bào; 2: Lưới nội chất; 3: Ty thể; 4: Hạt glycogen; 5: Màng suốt) Quan sát tế bào nuôi phôi tế bào nụ phơi ngày sống sau rã đơng độ phóng đại 1500X thấy tế bào có màng, bào tương, nhân, hạt nhân rõ ràng, màng nhân màng tế bào khơng thay đổi, bào tương có đầy đủ bào quan ty thể, lưới nội chất… giống phôi trước đông Tuy nhiên, số phôi bào xuất không bào bào tương Siêu cấu trúc phơi thối hóa sau rã đơng Ảnh 7: Phơi ngày thối hóa sau rã đông (TEM - 8.000X) (1: Màng nhân đứt gãy; 2: Hạt nhân; 3: Ty thể; 4: Lưới nội chất) Phôi ngày thối hóa sau rã đơng quan sát kính hiển vi điện tử truyền qua thấy màng nhân tế bào bị nhăn nhúm, có chỗ đứt gãy, nhiều nếp gấp, ty thể biến dạng, chất sáng, không quan sát thấy mào ty thể, lưới nội chất cú ht gión rng 17 Tạp chí y - dợc häc qu©n sù sè 4-2018 BÀN LUẬN - Thay đổi màng suốt trước đông lạnh sau rã đông: phơi tươi độ phóng đại 10.000 lần, quan sát màng suốt liên tục, bên có nhiều sợi xếp theo hướng khác Ở phơi sau rã đơng, quan sát độ phóng đại, màng suốt giữ nguyên tính liên tục, cấu trúc màng mịn hơn, tăng mật độ điện tử, khó thấy rõ sợi trước đơng lạnh Điều gợi ý cấu trúc màng suốt bị ảnh hưởng q trình đơng lạnh rã đơng Trên thực tế, nhiều nghiên cứu Việt Nam giới phôi sau rã đông hỗ trợ màng có tỷ lệ làm tổ có thai cao nhóm khơng có hỗ trợ màng Với nhóm chuyển phơi tươi, tỷ lệ tăng không đáng kể [4, 9] Nghiên cứu Đồn Thị Hằng CS (2011) 257 phơi sau rã đơng cho thấy phơi hỗ trợ màng tăng có ý nghĩa thống kê tỷ lệ sống làm tổ so với phôi không hỗ trợ thoát màng [2] Wellington P Martins CS (2011) tổng hợp 28 nghiên cứu 5.507 BN chuyển phôi hỗ trợ thoát màng Kết cho thấy tỷ lệ thành cơng tăng lên có ý nghĩa hai nhóm: BN chuyển phôi thất bại nhiều lần BN chuyển phơi sau rã đơng, khác biệt khơng có ý nghĩa nhóm BN chuyển phơi tươi [10] Điều gợi ý, màng suốt phôi sau rã đơng bị biến đổi so với phơi tươi, trở nên “cứng” protein đơng vón q trình đơng lạnh, gây cản trở q trình phơi thoát màng Thực tế phù hợp với kết nghiên cứu chúng tơi kính hiển vi điện tử truyền qua 18 - Thay đổi cấu trúc thành phần bào tương tế bào phôi: Quan sát phôi bào, tế bào nuôi tế bào ICM phôi sống sau rã đông cho thấy màng tế bào nguyên vẹn, thành phần hữu hình bào tương như: ty thể, lưới nội chất, máy Golgi, hạt glycogen; màng nhân, chất nhân, hạt nhân không khác so với phôi trước đông lạnh Trong bào tương tế bào xuất số khơng bào Trên phơi bị thối hóa sau rã đơng thấy màng tế bào nhăn nheo, liên kết tế bào lỏng lẻo, màng nhân bị đứt đoạn, ty thể lưới nội chất bị trương phồng lên Kết tương tự nghiên cứu Bettencourt E.M.V (2008) đặc điểm siêu cấu trúc phôi cừu tươi sau rã đông phương pháp đơng lạnh chậm kính hiển vi điện tử truyền qua: phơi có chất lượng tốt sau rã đơng, bị tổn thương, phơi có chất lượng đông lạnh phôi bị tổn thương nhiều, tổn thương chủ yếu thấy ty thể bị tổn thương, màng nhân bị đứt đoạn, tế bào khơng có mối liên kết chặt chẽ, bào tương thấy xuất khoảng trống, mật độ điện tử giảm, đặc biệt xuất nhiều không bào [5] Kết tương tự số tác giả nghiên cứu phơi bò đơng lạnh kỹ thuật đơng lạnh chậm [3] Như vậy, nói q trình đông lạnh làm tổn thương tế bào ngưỡng định, phơi có chất lượng tốt, sống sau rã đơng, cấu trúc tế bào bị biến đổi, đặc biệt thành phần quan trọng ty thể, lưới nội chất, t¹p chÝ y - dợc học quân số 4-2018 mng nhõn v ht nhân Điều chứng minh trẻ sinh từ phơi đơng lạnh hồn tồn khỏe mạnh trẻ sinh từ phôi tươi [6, 11] KẾT LUẬN Nghiên cứu 20 phôi người nuôi cấy ngày trước đơng lạnh sau rã đơng kính hiển vi điển tử truyền qua, rút kết luận: - Các phôi sống sau rã đông không thay đổi cấu trúc so với phôi trước đông lạnh: phôi bào liên kết chặt chẽ, đặc biệt thành phần cấu trúc quan trọng phôi bào nhân, màng nhân, lưới nội chất, ty thể màng tế bào nguyên vẹn, tổn thương xuất số không bào - Màng suốt giảm mật độ điện tử so với trước đông lạnh, không quan sát rõ glycoprotein dạng sợi phơi tươi - Phơi thối hóa sau rã đông bị biến dạng, bề mặt lồi lõm không Các tế bào phơi có màng tế bào nhăn nhúm, ty thể biến dạng, chất sáng, không quan sát thấy mào ty thể, lưới nội chất giãn rộng, màng nhân bị đứt đoạn, ro rúm TÀI LIỆU THAM KHẢO Nguyễn Kim Giao Hiển vi điện tử khoa học sống Nhà xuất Đại học quốc gia Hà Nội 2004, tr.55-169 Đoàn Thị Hằng, Nguyễn Thanh Tùng, Quản Hồng Lâm, Nguyễn Đình Tảo CS Hiệu kỹ thuật hỗ trợ phơi màng axít tyrode cho phơi đơng lạnh Tạp chí Y Dược lâm sàng 108 2011, 6(6), tr.145-150 Đặng Quang Vinh, Vương Thị Ngọc Lan Hồ Mạnh Tường CS Mối tương quan chất lượng phôi sau rã đông tỷ thai lâm sàng chuyển phôi trữ lạnh, Y học Sinh sản Nhà xuất Y học 2005, tr.15-18 Balaban B, Urman B, Alatas C, Mercan R, Mumcu A,d Isiklar A A comparison of four different techniques of assisted hatching Human Reproduction 2002, 17 (5), pp.1239-1243 Bettencourt E.M.V, Bettencourt C.M, Silva J.N.C.E Ultrastructural characterization of fresh and cryoprotected in vivo produced ovine embryos Theriogenology 2008, 10 (1016), pp.947-958 Gvakharia M et al Comparison of post-thawed survival and implantation of frozen-thawed embryos derived from ICSI vs conventional IVF Fertility and Sterility 2004, pp.7-17 Hayat M.A Principle anh techniques of Electron microscopy Macmillian Press Hong Kong 1989, pp.79-137 Kuwayama M, Vajta G, Ieda S Comparison of open and closed methods for vitrification of human embryos and the climination of potential contamination Reprod Biomed Online 2005, 11 (5), pp.608-614 Valojerdi M.R, Eftekhari-Yazdi P, Karimian L Effect of laser zona pellucida opening on clinical outcome of assisted reproduction technology in patients with advanced female age, recurrent impantation failure, or frozen - thawed embryos Fertil Steri 2008, 90 (1), pp.84-91 10 Wellington P.M Assisted hatching of human embryos: a systematic review and meta-analysis of randomized controlled trials Human Reproduction Update 2011, pp.1-6 11 WHO Infecundity, infertiliti and childlessness in developing countries http://www.who.int/reproductivehealth/topics/i nfertiiti/DHS-CR9.pdf 2010 19 ... nay, đông lạnh phôi kỹ thuật thuỷ tinh hoá áp dụng rộng rãi nhiều trung tâm giới Việt Nam bảo quản phơi người Tuy nhiên, chưa có nhiều nghiên cứu sâu cấu trúc, siêu cấu trúc phôi trước sau rã đông. .. hành nghiên cứu đề tài với mục tiêu: Đánh giá siêu cấu trúc phôi người nuôi cấy ngày trước đông lạnh sau rã đông kính hiển vi điện tử truyền qua ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên. .. từ phôi tươi [6, 11] KẾT LUẬN Nghiên cứu 20 phôi người nuôi cấy ngày trước đông lạnh sau rã đơng kính hiển vi điển tử truyền qua, rút kết luận: - Các phôi sống sau rã đông không thay đổi cấu trúc