Mục tiêu nghiên cứu của bài viết nhằm đánh giá sự biến đổi hình thái vi thể mô buồng trứng (MBT) chuột sau bảo quản lạnh sâu và bước đầu so sánh hiệu quả bảo quản MBT chuột giữa môi trường bảo quản có EDS (etylen glycol; dimethyl sulphoxide; sucrose) và PDS (1,2 propanediol; dimethyl sulphoxide; sucrose).
TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017 BIẾN ĐỔI CẤU TRÚC VI THỂ CỦA MÔ BUỒNG TRỨNG CHUỘT CỐNG TRẮNG SAU BẢO QUẢN LẠNH BẰNG KỸ THUẬT THỦY TINH HÓA Nguyễn Thị Hương*; Đỗ Thùy Hương* TÓM TẮT Mục tiêu: đánh giá biến đổi hình thái vi thể mơ buồng trứng (MBT) chuột sau bảo quản lạnh sâu bước đầu so sánh hiệu bảo quản MBT chuột môi trường bảo quản có EDS (etylen glycol; dimethyl sulphoxide; sucrose) PDS (1,2 propanediol; dimethyl sulphoxide; sucrose) Đối tượng phương pháp: chia MBT 10 chuột thành nhóm: nhóm tươi, nhóm EDS (thủy tinh hóa [TTH] có sử dụng EDS) nhóm PDS (TTH có sử dụng PDS) Sử dụng kỹ thuật hiển vi quang học để đánh giá biến đổi cấu trúc mô học nang trứng sau r đơng Kết quả: tỷ lệ nang trứng có hình thái bình thường sau bảo quản lạnh nhóm EDS cao có ý nghĩa thống kê so với nhóm PDS, tương ứng 35,6% 26,6% Tuy nhiên, khơng có khác biệt tỷ lệ nang trứng ngun thủy có hình thái bình thường sau bảo quản lạnh ba nhóm (61,8%, 53,8% 55,9%, p > 0,05) Kết luận: TTH MBT chuột cống trắng bảo tồn phần lớn nang trứng nguyên thủy * Từ khóa: Mơ buồng trứng chuột; Thủy tinh hóa; Biến đổi cấu trúc vi thể Microstructural Changes of Rat Ovarian Tissue after Vitrification Summary Objectives: To assess the microstructural changes of rat ovarian tissue after vitrification and compare efficient protection of rat ovary tissue between EDS (ethylene glycol, dimethyl sulphoxide, sucrose) and PDS (1.2 propanediol, dimethyl sulphoxide, sucrose) Subjects and methods: Ovarian tissues of 10 rats were divided into groups: fresh group, EDS group (vitrification using EDS) and PDS group (vitrification using EDS) Evaluation of the microstructural changes of follicles in three groups after thawing under optical microscopy Results: The percentages of the morphologically normal follicles in the EDS group was significanty higher than that in the PDS group (35.6% vs 26.6%, p < 0.05) However, there was no difference in the percentage of morphologically normal primordial follicleamong three groups (61.8%, 53.8% and 55.9%, p > 0.05) Conclusion: Vitrification of rat ovarian tissue could preserve majority of primordial follicle * Keywords: Rat ovary tissue; Vitrification; Microstructural changes ĐẶT VẤN ĐỀ Trữ lạnh MBT phương pháp để bảo tồn chức sinh sản cho phụ nữ Chỉ định đặc biệt phù hợp cho bé gái phụ nữ có nguy bị suy buồng trứng sớm tác dụng phụ hóa trị xạ trị điều trị ung thư * Trường Đại học Y Hà Nội Người phản hồi (Corresponding): Đỗ Thuỳ Hương (dohuong2112@gmail.com) Ngày nhận bài: 25/07/2017; Ngày phản biện đánh giá báo: 26/08/2017 Ngày báo đăng: 30/08/2017 205 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017 Phẫu thuật cấy ghép lại MBT sau bảo quản lạnh phục hồi chức sinh sản nội tiết [1] Ngày nay, tồn giới đ có tới > 70 em bé sinh sau cấy ghép MBT [2] Có hai kỹ thuật bảo quản MBT sử dụng nay: trữ lạnh theo chương trình TTH Trữ lạnh theo chương trình kỹ thuật kinh điển, áp dụng từ sớm đến ghi nhận hiệu bảo tồn MBT TTH kỹ thuật mới, phát triển để trữ lạnh MBT khoảng thập kỷ trở lại đây, với ưu điểm tiết kiệm thời gian, dễ thực Nhiều nghiên cứu gần đánh giá cao hiệu bảo tồn MBT kỹ thuật Năm 2015, đ thử nghiệm TTH MBT thỏ Để chuẩn hóa quy trình tìm hiểu biến đổi nang trứng sau bảo quản lạnh, tiếp tục thử nghiệm buồng trứng chuột cống trắng với mục tiêu: Đánh giá biến đổi hình thái vi thể MBT chuột sau bảo quản lạnh sâu bước đầu so sánh hiệu bảo quản MBT chuột môi trường bảo quản có EDS PDS ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tƣợng nghiên cứu MBT 10 chuột cống trắng chủng khỏe mạnh, - tuần tuổi, trọng lượng 100 - 130 gram Phƣơng pháp nghiên cứu - Cắt MBT chuột thành miếng nhỏ, chia ngẫu nhiên vào nhóm: nhóm chứng, nhóm EDS (nhóm bảo quản lạnh sâu kỹ thuật TTH, môi trường bảo quản gồm chất etylen glycol (EG), 206 dimethyl sulphoxide (DMSO), sucrose), nhóm PDS (nhóm bảo quản lạnh sâu kỹ thuật TTH, môi trường bảo quản gồm chất 1,2 propanediol (PrOH), DMSO, sucrose) với kích thước mảnh mơ - x x - mm - Cố định mảnh mô lô chứng dung dịch bouin để làm tiêu nhuộm H.E (hematoxylin eosin) đánh giá mô học - Thả mảnh mơ hai nhóm lại vào dung dịch PBS có 10% FBS chuẩn bị cho quy trình bảo quản Bảo quản mơ nitơ lỏng thời gian tuần, sau r đơng để làm tiêu nhuộm H.E đánh giá mô học * Quy trình TTH: - Nhóm EDS: theo phương pháp Hye Won Youm (2013) [3]: + Ủ mảnh mô môi trường E1 E2 với nồng độ thời gian sau: E1: PBS + 20% FBS + 7,5% EG + 7,5% DMSO: 10 phút E2: PBS + 20% FBS + 20% EG + 20% DMSO + 0,5 mol/l S: phút + Đặt mảnh mô vào cryotop (cọng đơng phơi), thả vào nitơ lỏng - Nhóm PDS: theo phương pháp Li Yu-bin (2007) [4]: + Ủ mảnh mô môi trường P1 P2 với nồng độ thời gian sau: P1: DMEM + 10% FBS + 0,1 mol/l S + 2,0 mol/l DMSO: phút P2: DMEM + 10% FBS + 0,2 mol/l S + 2,0 mol/l DMSO + 2,0 mol/l PrOH: phút + Đặt mảnh mô vào cryotop (cọng đông phơi), thả vào nitơ lỏng TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017 * Quy trình rã đơng: nhóm nghiên cứu theo tiêu chuẩn xếp loại nang trứng sau: - Nhóm EDS: Lấy cryotop chứa mẫu khỏi bình chứa nitơ lỏng, thả vào PBS 370C tan đá hoàn tồn Rửa mảnh mơ PBS, 20% FBS với nồng độ sucrose giảm dần mol/l, 0,5 mol/l; 0,25 mol/l; mol/l Đặt vào tủ ấm 370C, 5% CO2 30 phút - Nhóm PDS: Lấy cryotop khỏi bình chứa nitơ lỏng, thả vào PBS 370C tan đá hồn tồn Rửa mảnh mơ DMEM, 10% FBS với nồng độ sucrose giảm dần 0,5 mol/l; 0,25 mol/l; 0,125 mol/l; mol/l Đặt vào tủ ấm 370C, 5% CO2 30 phút * Chỉ tiêu nghiên cứu: So sánh biến đổi mặt hình thái loại nang trứng có MBT - Nang trứng bình thường: nỗn có hình dạng tròn đều, cân đối Màng suốt có cấu trúc nguyên vẹn Tế bào nang, tế bào hạt phân bố đặn, khoảng cách tế bào nhỏ - Nang trứng bất thường: nỗn méo mó, biến dạng thối hóa, ly giải Màng suốt khơng ngun vẹn bị ly giải Tế bào nang, tế bào hạt xếp lộn xộn, khơng liên tục thối hóa, nhân đơng vón, tách rời khỏi bờ nang trứng Để tránh việc khảo sát nang trứng bị trùng lặp, mảnh mô đúc block nến cắt lát dày µm, 16 lát lấy lát mô để khảo sát * Xử lý số liệu: SPSS 16.0 Sử dụng thuật tốn bình phương để so sánh hai tỷ lệ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Tổng số có 738 nang trứng khảo sát nhóm nghiên cứu Trong loại nang trứng có mặt MBT (nang trứng nguyên thủy, nang nguyên phát, nang trứng đặc, nang trứng có hốc), nang trứng nguyên thủy chiếm tỷ lệ 27,2%; 42,5%; 30,7% tương ứng nhóm chứng, nhóm EDS, nhóm PDS Nang trứng nguyên phát chiếm tỷ lệ cao nhóm chứng, nhóm EDS, nhóm PDS tương ứng 51,7%; 42,5%; 37,5% Số ƣợng tỷ lệ nang trứng c h nh thái nh thƣờng Bảng 1: Loại nang Nhóm Tổng cộng Bình thường Bất thường Số lượng % Số lượng % Chứng 125 38,2 202 61,8 327 EDS 78 35,6 a 141 64,4 219 bc 141 73,4 192 PDS 51 26,6 Ghi chú: a: so sánh với nhóm chứng (p > 0,05); b: so sánh với nhóm chứng (p < 0,05); c: so sánh với nhóm EDS (p < 0,05) 207 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017 Ở MBT tươi chuột, 38,2% nang trứng dạng, dẫn tới tỷ lệ bị giảm có hình thái bình thường Quá trình TTH làm 53,8% 55,9% tương ứng nhóm EDS nang trứng bị biến đổi cấu trúc dẫn tới tỷ PDS Tuy nhiên, khác biệt nhóm lệ bị giảm Cụ thể: nhóm EDS giảm khơng có ý nghĩa thống kê 35,6%, nhiên khác biệt so với mô tươi Về chất lượng nang trứng tiến triển ý nghĩa thống kê Nhóm PDS có tỷ lệ sau bảo quản: trình TTH làm thay đổi nang trứng bình thường thấp cấu trúc nang trứng tiến triển cách nặng nhóm (26,6%) Sự khác biệt có ý nghĩa thống nề, đặc biệt nang trứng đặc nang trứng kê so sánh nhóm PDS nhóm có hốc Khơng có khác biệt có ý nghĩa chứng EDS thống kê nhóm EDS nhóm chứng Số lượng tỷ lệ nang trứng bình tỷ lệ bình thường nang trứng tiến thường theo giai đoạn tiến triển triển, nhiên khác biệt thấy rõ Ở MBT tươi chuột, 61,8% nang trứng so sánh nhóm chứng nhóm PDS nguyên thủy có hình thái bình thường Quá trình bảo quản lạnh rã đông làm cho số nang trứng nguyên thủy bị thối hóa biến Bảng 2: Loại nang Nang ngun thủy Nang đặc Nang nguyên phát Nang có hốc Nhóm Số nang Số bình % bình Số nang Số bình % bình Số nang Số bình % bình Số nang Số bình % bình khảo sát thường thường khảo sát thường thường khảo sát thường thường khảo sát thường thường Chứng 89 55 61,8 169 51 30,2 64 19 29,7 0 EDS 93 50 53,8a 93 24 25,8a 26 15,4a 0 PDS 59 33 55,9ac 72 12 16,7bc 50 10bc 11 0 Ghi chú: a: so sánh với nhóm chứng (p > 0,05); b: so sánh với nhóm chứng (p < 0,05); c: so sánh với nhóm EDS (p > 0,05) Biến đổi thành phần cấu tạo nang trứng nguyên thủy sau bảo quản 208 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017 Chất lượng noãn tế bào nang nang trứng nguyên thủy bị giảm khơng đáng kể sau q trình TTT Khơng thấy khác biệt có ý nghĩa thống kê so sánh chất lượng noãn tế bào nang nhóm nghiên cứu Bảng 3: Thành phần cấu tạo Nhóm Nỗn Tế bào nang Bình thường (%) Bất thường (%) Bình thường (%) Bất thường (%) Chứng 56 (62,9) 33 (37,1) 59 (66,3) 30 (33,7) EDS 54 (58,1 ) a 39 (41,9 ) a 56 (60,2) 37 (39,8 ) PDS 36 (61 ) ab 20 (33,9 ) ab ab 23 (39 ) a ab 39 (66,1 ) Ghi chú: a: so sánh với nhóm chứng (p > 0,05); b: so sánh với nhóm EDS (p > 0,05) Biến đổỉ thành phần cấu tạo nang trứng tiến triển sau bảo quản Bảng 4: Nhóm Thành phần cấu tạo Noãn Màng suốt Tế bào hạt/vỏ Bình thường (%) Bất thường (%) Bình thường (%) Bất thường (%) Bình thường (%) Bất thường (%) Chứng 76 (31,9) 162 (68,1) 76 (31,9) 162 (68,1) 99 (41,6) 139 (58,4) EDS 33 (26,2 ) a 93 (73,8 ) 34 (27 ) PDS 18 (13,5 ) bc 115 (86,5) 22 (16,5 ) a a bc 92 (73 ) a 45 (35,7 ) a 81 (64,3 ) a 111 (83,5) 32 (24,1 ) bc 101 (75,9) Ghi chú: a: so sánh với nhóm chứng (p > 0,05); b: so sánh với nhóm chứng (p < 0,05); c: so sánh với nhóm EDS (p < 0,05) Trong thành phần có mặt nang trứng tiến triển khảo sát, noãn thành phần bị biến đổi cấu trúc nhiều Mức độ tổn thương sau bảo quản màng suốt có xu hướng nhẹ so với nỗn Nhóm EDS có tỷ lệ nỗn màng suốt có hình thái bình thường tương ứng 26,2% 27%, thấp so với nhóm chứng (31,9% 31,9%) Tuy nhiên, khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê Sự khác biệt thấy rõ so sánh nhóm PDS với nhóm chứng nhóm EDS, tỷ lệ nỗn màng suốt bình thường 13,5% 16,5% 209 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017 Tế bào hạt tế bào vỏ thành phần bị ảnh hưởng tác động TTH Tỷ lệ tế bào hạt/vỏ bình thường nhóm EDS 35,7% so với 41,6% tỷ lệ loại MBT tươi, khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê Riêng nhóm PDS tỷ lệ giảm 24,1% Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê nhóm PDS với nhóm chứng EDS Nh m tƣơi Nhóm EDS Nhóm PDS x400 x400 x400 x400 x400 x400 210 x400 x400 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017 x100 x400 x400 (Ảnh 1, 2, 3: nang trứng nguyên thủy; Ảnh 4, 5, 6: nang trứng đặc; Ảnh 7, 9: nang trứng có hốc; Ảnh 8: nang trứng nguyên phát) Hình 1: Hình ảnh cấu trúc vi thể MBT chuột trước sau bảo quản lạnh BÀN LUẬN tiến triển nguyên vẹn nguyên Biến đổi cấu trúc nang trứng cứu thấp Chỉ số nang trứng nguyên phát nang trứng đặc giữ sau bảo quản lạnh hình thái tương đối bình thường Nang trứng nguyên thủy nang trứng sau bảo quản đơng nhanh Tồn nang chưa tiến triển, lượng nang trứng dự trữ trứng có hốc đ bị biến dạng buồng trứng Mục tiêu bảo quản thành phần cấu tạo Nhóm PDS gây lạnh MBT bảo tồn nhiều loại ảnh hưởng nặng nề lên cấu trúc nang tốt Kết nghiên cứu cho nang trứng tiến triến, toàn thấy tỷ lệ nang trứng ngun thủy có hình nang trứng tiến triển đ bị biến đổi thái bình thường MBT tươi (61,8%) hoàn toàn Điều cấu tạo nang Sau TTH, số nang trứng nguyên thủy trứng tiến triển có nỗn tế bào có kích bị biến dạng, thối hóa làm tỷ lệ giảm thước lớn, bào tương có thành 53,8% 55,9% tương ứng nhóm phần nhạy cảm với nhiệt độ thoi vô EDS PDS Tuy nhiên, khơng thấy sắc đ hình thành dễ bị đứt gãy khác biệt có ý nghĩa thống kê nhóm trình đơng lạnh r đơng Vì vậy, gặp nghiên cứu Với kết khẳng nhiều khó khăn việc bảo quản nang định khả chịu nhiệt tốt nang trứng tiến triển trứng nguyên thủy so với loại nang trứng tiến triển khác trình bảo quản lạnh Đặc tính nang trứng ngun thủy có cấu tạo khác biệt: nỗn có kích thước nhỏ, bào tương, màng bào tương có thành phần nhạy cảm với nhiệt, khơng có màng suốt, tế bào hạt nang trạng thái ngủ nên tốc độ chuyển hóa chậm Khi phân tích chất lượng nang trứng tiến triển (nang trứng nguyên phát, nang trứng đặc, nang trứng có hốc), sau bảo quản thấy: so với công bố khác giới có sử dụng phương pháp bảo quản tương tự, tỷ lệ nang trứng Ảnh hƣởng nhóm TTH EDS PDS lên biến đổi hình thái nang trứng thành phần cấu tạo MBT Trong nghiên cứu chúng tôi, so sánh tổng chất lượng nang trứng bình thường hai nhóm EDS PDS thấy: nhóm EDS cho kết bảo quản tốt so với nhóm PDS, đặc biệt nang trứng tiến triển Tỷ lệ noãn bị thối hóa, ly giải nhóm PDS cao so với nhóm EDS Chúng tơi cho nhóm EDS bảo quản MBT chuột cống trắng tốt nhóm PDS EG sử dụng phổ biến cho trình TTH gây độc tính khả khuếch tán cao tế bào Thêm vào EG (62,07 kDa) có trọng 211 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ CHUYÊN ĐỀ HÌNH THÁI HỌC-2017 lượng phân tử khối nhẹ DMSO (78,13 kDa) PrOH (76,09 kDa), dễ dàng thấm vào MBT Tuy nhiên, đặc tính sử dụng riêng rẽ EG với nồng độ cao thời gian dài kết không tốt so với DMSO PrOH Để tận dụng tính thấm qua màng EG, nghiên cứu gần có xu hướng kết hợp EG với chất bảo vệ lạnh khác: EG + GLY chứng minh có hiệu bảo quản phơi, EG + GLY + polymer cho kết tốt MBT khỉ [5], EG + DMSO + sucrose môi trường tối ưu cho MBT chuột [3], EG + DMSO + PrOH + polymer cho kết tốt MBT người [6] Chất bảo vệ lạnh có vai trò định thành cơng q trình TTH MBT lồi động vật khác phù hợp với chất bảo vệ lạnh khác Trong nghiên cứu này, thực bảo quản lạnh kết hợp hai nhóm chất bảo vệ lạnh khác với phương pháp hai nhóm tác giả để khảo sát tác động chất bảo vệ lạnh kết hợp với tìm môi trường tối ưu cho bảo quản MBT chuột KẾT LUẬN Từ kết nghiên cứu, đưa số kết luận sau: - Thủy tinh hóa bảo tồn phần lớn nang trứng nguyên thủy 212 - Hỗn hợp chất bảo vệ lạnh: ethylen glycol, dimethyl sulfoxide sucrose có xu hướng bảo tồn nang buồng trứng chuột cống trắng tốt so với kết hợp 1,2 propanediol, dimethyl sulfoxide sucrose TÀI LIỆU THAM KHẢO Amorim C.A et al Cryopreservation of oocytes from pre-antral follicles Hum Reprod Update 2003, (2), pp.119-129 Silber S et al Ovarian tissue cryopreservation and transplantation: scientific implications Journal of Assisted Reproduction and Genetics 2016, 33 (12), pp.1595-1603 Youm H.W et al Optimal vitrification protocol for mouse ovarian tissue cryopreservation: effect of cryoprotective agents and in vitro culture on vitrified-warmed ovarian tissue survival Hum Reprod 2014, 29 (4), pp.720-730 Li Y.B et al Modified vitrification method for cryopreservation of human ovarian tissues Chin Med J (Engl) 2007, 120 (2), pp.110-114 Li Q et al Ovarian function reconstruction by orthotopic transplantation of novel vitrification cryopreserved ovaries in chemotherapyinduced ovary damage rat model Zhongguo Xiu Fu Chong Jian Wai Ke Za Zhi 2013, 27 (9), pp.1116-1121 Ting A.Y et al Morphological and functional preservation of pre-antral follicles after vitrification of macaque ovarian tissue in a closed system Hum Reprod 2013, 28 (5), pp.1267-1279 ... nguyên Biến đổi cấu trúc nang trứng cứu thấp Chỉ số nang trứng nguyên phát nang trứng đặc giữ sau bảo quản lạnh hình thái tương đối bình thường Nang trứng nguyên thủy nang trứng sau bảo quản đơng... giá cao hiệu bảo tồn MBT kỹ thuật Năm 2015, đ thử nghiệm TTH MBT thỏ Để chuẩn hóa quy trình tìm hiểu biến đổi nang trứng sau bảo quản lạnh, tiếp tục thử nghiệm buồng trứng chuột cống trắng với mục... bảo quản lạnh sâu kỹ thuật TTH, môi trường bảo quản gồm chất etylen glycol (EG), 206 dimethyl sulphoxide (DMSO), sucrose), nhóm PDS (nhóm bảo quản lạnh sâu kỹ thuật TTH, môi trường bảo quản gồm