Thẩm định phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao bằng định lượng diclofenac trong dịch tiền phòng mắt thỏ

Mục tiêu nghiên cứu của bài viết nhằm thẩm định phương pháp định lượng diclofenac có trong dịch tiền phòng mắt thỏ bằng phương pháp HPLC - detector DAD được thực hiện theo các số tiêu chí của FDA.

Tạp chí y - dợc học quân số chuyên đề dƯợC-2016 THM NH PHNG PHP SC Kí LNG HIU NĂNG CAO BẰNG ĐỊNH LƯỢNG DICLOFENAC TRONG DỊCH TIỀN PHÒNG MẮT THỎ Đặng Thị Hiền*; Quản Duy Quang*; Nguyễn Hải Trường* Nguyễn Văn Long*; Nguyễn Trần Linh* TÓM TẮT Mục tiêu: thẩm định phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao định lượng dược chất diclofenac có dịch tiền phòng mắt thỏ Đối tượng phương pháp: dược chất diclofenac có dịch tiền phòng mắt thỏ Kết quả: thời gian lưu diclofenac khoảng 7,1 phút, tính chọn lọc, độ xác, độ tỷ lệ thu hồi, đường chuẩn, độ tái lặp độ ổn định thẩm định Khoảng tuyến tính giới hạn định lượng diclofenac 500 - 8.000 ng/ml 500 ng/ml Kết luận: phương pháp xây dựng đạt yêu cầu FDA phân tích dịch sinh học * Từ khóa: Diclofenac; Dịch tiền phòng; Sắc ký lỏng hiệu cao Determination of Diclofenac in Rabit Aqueous Humor by High Performance Liqid Chromatography Summary Objectives: Validation of a HPLC method for the determination of diclofenac in rabbit aqueous humor Subjects and methods: Diclofenac in rabbit aqueous humor Results: The retention time was about 7.1 for diclofenac The selectivity, accuracy, precision, calibration curve, and stability had been validated The linear range and lower limit of quantification for diclofenac were 500 - 8,000 ng/ml and 500 ng/ml, respectively Conclusions: Construction method has achieved requirements of the FDA for analysis in biological fluids * Key words: Diclofenac; Aqueous humor; High performance liquid chromatography ĐẶT VẤN ĐỀ Diclofenac dẫn chất axít phenylacetic thuộc nhóm thuốc chống viêm không steroid, ức chế chọn lọc COX - COX - 1, có tác dụng chống viêm, giảm đau hạ sốt mạnh Diclofenac dùng cho mắt thị trường có dạng dung dịch với nồng độ 0,1%, thuốc tác dụng ngắn Vì vậy, bệnh nhân phải nhỏ thuốc - lần/ngày cho định điều trị [4] Nano nhũ tương hệ cấp thuốc mới, chứng minh thích hợp dùng cho mắt [8] Bộ mơn Bào chế, Đại học Dược Hà Nội có nhiều nghiên cứu xây dựng cơng thức quy trình bào chế dạng nhũ tương nano nhỏ mắt chứa diclofenac [1, 2, 3] Tuy nhiên, để ứng dụng vào thực tế, cần nghiên cứu sinh dược học dược động học chế phẩm * Đại học Dược Hà Nội Người phản hồi (Corresponding): Đặng Thị Hiền (hiendang171084@gmail.com) Ngày nhận bài: 30/07/2016; Ngày phản biện đánh giá báo: 10/09/2016 Ngày báo đăng: 15/09/2016 102 Tạp chí y - dợc học quân số chuyên ®Ị d−ỵC-2016 Các phương pháp định lượng HPLC detector DAD, HPLC - detector FLD [6], HPLC - MS [7] sử dụng để định lượng dược chất dịch tiền phòng mắt thỏ Tuy nhiên, để áp dụng đảm bảo tính tin cậy, phương pháp phân tích cần thẩm định Trong giới hạn cho phép đề tài với trang thiết bị, nguyên vật liệu có, việc thẩm định phương pháp định lượng diclofenac có dịch tiền phòng mắt thỏ phương pháp HPLC - detector DAD thực theo số tiêu chí FDA [5] ĐỐI TƯỢNG, THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu Dược chất (axít diclofenac: AD) có dịch tiền phòng mắt thỏ định lượng phương pháp HPLC với detector mảng diod (DAD) [1, 2, 3] Mẫu chuẩn: cân xác 0,01 g AD vào bình định mức 10 ml, thêm methanol, lắc cho tan Bổ sung methanol vừa đủ đến vạch Pha loãng methanol trộn đồng lượng với dịch tiền phòng trắng để thu nồng độ chuẩn cần phân tích Ly tâm với tốc độ 12.000 vòng/phút 10 phút Lấy dịch Thiết bị Máy sắc ký lỏng hiệu cao Agilent 1260 Infinite (Mỹ), máy ly tâm lạnh Universal 320R (Anh), máy lắc xoáy Vortex, cân phân tích, cân kỹ thuật, dụng cụ khác… Phương pháp nghiên cứu * Phương pháp định lượng: - Điều kiện: + Pha tĩnh: cột C8 kích thước 150 mm × 4,6 mm (Octyl silica gel µm) + Pha động: hỗn hợp methanol dung dịch đệm phosphat pH 2,5 với tỷ lệ 75/25, lọc qua màng cellulose acetat 0,45 µm, siêu âm 15 phút + Tốc độ dòng pha động: ml/phút + Thể tích tiêm mẫu: 50 µl + Detector UV bước sóng: 276 nm * Động vật thí nghiệm: Thỏ đực giống, cân nặng khoảng 2,5 3,0 kg, đảm bảo tiêu chuẩn động vật thí nghiệm, Trung tâm CIMADE cung cấp chăm sóc Tại thời điểm tiến hành thí nghiệm, khơng có dấu hiệu bất thường mắt * Thẩm định phương pháp định lượng diclofenac dịch tiền phòng mắt thỏ: Quy trình thẩm định phương pháp định lượng tiến hành theo hướng dẫn FDA [5] - Tính chọn lọc: chuẩn bị mẫu dịch tiền phòng trắng từ thỏ khác Chuẩn bị mẫu dịch tiền phòng chứa AD nồng độ giới hạn định lượng (LLOQ) dự kiến khoảng 500 ng/ml Phân tích mẫu phương pháp HPLC - Đường chuẩn khoảng tuyến tính: + Chuẩn bị mẫu dịch tiền phòng chứa AD với nồng độ xác (500, 1.000, 1.500, 2.000, 3.000, 4.000, 6.000 8.000 ng/ml), nồng độ mẫu độc lập (có điều chỉnh khối lượng AD cân) Phân tích mẫu phương pháp HPLC + Xây dựng đường chuẩn theo mơ hình hồi quy tuyến tính - Giới hạn định lượng dưới: + Chuẩn bị mẫu dịch tiền phòng chứa AD nồng độ xác (500 ng/ml) (có điều chỉnh khối lượng AD cân) Chuẩn bị đường chuẩn điều kiện 103 Tạp chí y - dợc học quân số chuyên đề dƯợC-2016 + Phõn tớch cỏc mu bng phng pháp HPLC mẫu kiểm tra so với nồng độ thực pha + Xác định độ cách so sánh nồng độ tính từ đường chuẩn với nồng độ thực pha Xác định độ xác cách tính độ lệch chuẩn tương đối RSD + Xác định độ lặp lại ngày cách tính độ lệch chuẩn tương đối RSD giá trị phân tích nồng độ Xác định độ lặp khác ngày cách lặp lại bước ngày Tính độ lệch chuẩn tương đối RSD giá trị phân tích nồng độ ngày đánh giá - Độ đúng, độ xác (độ lặp lại ngày khác ngày): + Chuẩn bị lơ mẫu dịch tiền phòng chứa AD, lô gồm mẫu độc lập: mẫu kiểm tra nồng độ thấp (LQC): khoảng 1.000 ng/ml Mẫu kiểm tra nồng độ trung bình (MQC) khoảng 3.500 ng/ml Mẫu kiểm tra nồng độ cao (HQC) khoảng 6.500 ng/ml + Chuẩn bị đường chuẩn điều kiện + Phân tích mẫu phương pháp HPLC + Xác định độ phương pháp cách so sánh nồng độ phân tích - Độ ổn định: + Chuẩn bị lơ mẫu dịch tiền phòng chứa AD, lô gồm mẫu độc lập: mẫu kiểm tra LQC khoảng 1.000 ng/ml Mẫu kiểm tra HQC khoảng 6.500 ng/ml + Phân tích mẫu phương pháp HPLC, xác định hàm lượng dược chất mẫu ban đầu + Sau 24 giờ, phân tích lại mẫu phương pháp HPLC, xác định lại hàm lượng dược chất mẫu KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN Kết thẩm định tính chọn lọc mAU mAU Diclofenac Hình 1: Sắc ký đồ dịch tiền phòng trắng Diclofenac Hình 2: Sắc ký đồ dịch tiền phòng có chứa diclofenac 500 ng/ml Kết sắc ký đồ (n = 6) cho thấy, thời điểm khoảng 7,1 phút, mẫu trắng không xuất píc, mẫu thử xuất píc tách riêng, píc diclofenac Như vậy, phương pháp định lượng có tính chọn lọc cao 104 Tạp chí y - dợc học quân số chuyên ®Ị d−ỵC-2016 Diện tích peak (m AU.s) Kết thẩm định tính tuyến tính 1200 y = 0.116x + 15.758 R = 0.9956 1000 800 600 400 200 0 2000 4000 6000 Nồng độ dung dịch (ng/ml) 8000 10000 Hình 3: Đồ thị biểu diễn mối tương quan nồng độ diclofenac dịch tiền phòng diện tích píc Bảng 1: Tương quan nồng độ diclofenac dịch tiền phòng diện tích píc STT Nồng độ AD (ng/ml) Diện tích píc (mAU.s) 516,3 77,1 1032,5 119,8 1425,0 195,9 2065,0 236,6 2850,0 372,8 4100,0 469,2 5700,0 704,4 8200,0 954,5 Kết thống kê Phương trình hồi quy: y = 0,116x + 15,75 R = 0,995 Tính lại nồng độ hoạt chất có mẫu chuẩn theo phương trình hồi quy xây dựng Kết cho thấy khoảng nồng độ khảo sát, 100% số điểm đạt độ so với giá trị thực nằm giới hạn cho phép (85 - 115%), giá trị R2 hai lần khảo sát 0,995 0,993 Như vậy, khoảng nồng độ khảo sát, có tương quan tuyến tính nồng độ diclofenac dịch tiền phòng diện tích píc thu Khoảng tuyến tính phù hợp để định lượng diclofenac dịch tiền phòng Bảng 2: Nồng độ diclofenac mẫu chuẩn tính theo phương trình hồi quy STT Nồng độ thực (ng/ml) Nồng độ tìm thấy (ng/ml) Độ (%) 516,3 528,9 102,45 508,1 549,1 108,06 1032,5 997,0 96,56 1016,3 1130,4 111,23 1425,0 1553,0 108,98 1512,5 1481,8 97,97 105 Tạp chí y - dợc học quân số chuyên đề dƯợC-2016 2065,0 1903,9 92,20 2032,5 1925,7 94,75 2850,0 3078,0 108,00 3025,0 3322,0 109,82 4100,0 3909,0 95,34 4065,0 3929,4 96,67 5700,0 5936,6 104,15 6050,0 5754,7 95,12 8200,0 8092,7 98,69 8130,0 8455,6 104,00 Chuẩn bị mẫu chuẩn có nồng độ diclofenac 516,3 ng/ml Tiến hành định lượng phương pháp HPLC Tính kết dựa theo đường chuẩn pha dịch tiền phòng với điều kiện Kết cho thấy nồng độ tìm thấy so với giá trị thực (102,45%; 104,45%; 101, 61%; 108,12%; 100,28%; 104,28%) nằm khoảng 80 - 120% có RSD (2,66%) < 20% Do đó, nồng độ 516,3 ng/ml đạt yêu cầu giới hạn định lượng Kết thẩm định độ đúng, độ xác Bảng 3: Kết thẩm định độ đúng, độ lặp lại ngày (n = 3) LQC (1.121 ng/ml) Mẫu Diện tích Nồng độ píc AD AD (mAu.s) (ng/ml) MQC (3.483 ng/ml) Độ (%) Diện tích píc AD (mAu.s) HQC (6.530 ng/ml) Nồng độ Độ AD (ng/ml) (%) Diện tích píc AD Nồng độ AD (mAu.s) (ng/ml) Độ (%) 144,3 1108,2 98,86 428,7 3559,9 102,21 777,1 6563,4 100,51 152,4 1178,0 105,09 407,6 3378,0 96,99 759,8 6414,2 98,23 139,4 1066,0 95,09 419,2 3478,0 99,86 752,7 6353,0 97,29 143,3 1099,6 98,09 437,3 3634,1 104,33 764,9 6458,2 98,9 140,6 1076,3 96,01 408,4 3384,9 97,18 769,2 6495,3 99,47 156,6 1214,2 108,32 402,1 3330,6 95,62 796,5 6730,6 103,07 TB 100,24 99,37 99,58 RSD % 5,27 3,41 2,04 Kết phân tích có độ nằm khoảng 85 - 115%, độ lệch chuẩn tương đối RSD tương ứng 5,27%; 3,41%; 2,04%; < 15% Như vậy, phương pháp phân tích đạt yêu cầu FDA tiêu chuẩn độ đúng, độ lp li ngy 106 Tạp chí y - dợc học quân số chuyên đề dợC-2016 Bng 4: Kt thẩm định độ đúng, độ lặp lại khác ngày Ngày thứ LQC (1.121 ng/ml) Mẫu MQC (3.483 ng/ml) Diện tích Nồng độ Diện tích píc Nồng độ Độ píc ADC ADC ADC ADC (%) (mAu.s) (ng/ml) (mAu.s) (ng/ml) HQC (6.530 ng/ml) Độ (%) Diện tích píc Nồng độ Độ ADC ADC (%) (mAu.s) (ng/ml) 144,3 1108,2 98,86 428,7 3559,9 102,21 777,1 6563,4 100,51 152,4 1178,0 105,09 407,6 3378,0 96,99 759,8 6414,2 98,23 139,4 1066,0 95,09 419,2 3478,0 99,86 752,7 6353,0 97,29 143,3 1099,6 98,09 437,3 3634,1 104,33 764,9 6458,2 98,90 140,6 1076,3 96,01 408,4 3384,9 97,18 769,2 6495,3 99,47 156,6 1214,2 108,32 402,1 3330,6 95,62 796,5 6730,6 103,07 TB 100,24 99,37 99,58 RSD % 5,27 3,41 2,04 Ngày thứ hai LQC (1.076 ng/ml) Mẫu Diện tích Nồng độ Độ píc ADC ADC (%) (mAu.s) (ng/ml) MQC (3.513 ng/ml) HQC (6.492 ng/ml) Diện tích píc ADC (mAu.s) Nồng độ ADC (ng/ml) Độ (%) Diện tích píc ADC (mAu.s) Nồng độ Độ ADC (%) (ng/ml) 152,3 1177,2 109,40 415,1 3442,7 98,00 779,5 6584,1 101,42 143,2 1098,7 102,10 425,5 3532,3 100,55 764,0 6450,4 99,36 134,2 1021,1 94,90 438,2 3641,8 103,67 728,9 6147,9 94,70 149,8 1155,6 107,40 418,1 3468,5 98,73 775,7 6551,3 100,91 151,2 1167,7 108,52 435,6 3619,4 103,03 767,0 6476,3 99,76 147,3 1134,1 105,40 417,3 3461,6 98,54 783,1 6615,1 101,89 TB 104,62 100,42 99,67 RSD % 5,19 2,42 2,63 107 T¹p chÝ y - dợc học quân số chuyên đề dƯợC-2016 Ngy thứ ba LQC (1.038 ng/ml) Mẫu Diện tích Nồng độ Độ píc ADC ADC (%) (mAu.s) (ng/ml) MQC (3.452 ng/ml) HQC (6.497 ng/ml) Diện tích píc ADC (mAu.s) Nồng độ ADC (ng/ml) Độ (%) Diện tích píc ADC (mAu.s) Nồng độ Độ ADC (%) (ng/ml) 141,5 1084,1 104,44 424,1 3520,3 101,98 784,3 6625,4 101,98 145,9 1122,0 108,09 411,1 3408,2 98,73 770,5 6506,5 100,15 147,7 1137,5 109,59 409,4 3393,5 98,31 785,1 6632,3 102,08 154,7 1191,4 114,78 419,7 3482,3 100,88 761,4 6428,0 98,94 151,7 1172,0 112,91 426,6 3541,8 102,60 739,4 6238,4 96,02 138,3 1056,5 101,78 437,6 3636,6 105,35 773,8 6534,9 100,58 TB 108,59 101,31 99,96 RSD % 4,93 2,58 2,26 104,48 100,36 99,74 5,13 2,78 2,19 Trung bình ngày RSD% ngày Kết phân tích có độ nằm khoảng 85 - 115%, độ lệch chuẩn tương đối RSD ngày tương ứng 6,07%; 2,78%; 2,19%; < 15% Như vậy, phương pháp phân tích đạt yêu cầu FDA tiêu chuẩn độ đúng, độ lặp lại khác ngày Kết thẩm định độ ổn định Bảng 5: Độ ổn định mẫu sau xử lý bảo quản nhiệt độ phòng 24 (n = 6) Mẫu Nồng độ mẫu HQC (ng/ml) Tiêm Sau 24 Tiêm Sau 24 1108,2 1130,6 6563,4 6455,6 1178,0 1236,6 6414,2 6659,1 1066,0 1095,3 6353,0 6371,1 1099,6 1044,4 6458,2 6297,9 1076,3 1124,6 6495,3 6413,4 1214,2 1159,1 6730,6 6542,7 TB 1123,7 1131,8 6502,4 6456,6 RSD % 5,27 5,69 2,04 1,99 Độ lệch 108 Nồng độ mẫu LQC (ng/ml) 0,72% 0,70% Tạp chí y - dợc học quân số chuyên ®Ị d−ỵC-2016 Độ lệch kết mẫu phân tích sau 24 tương ứng 0,72% 0,70%, đạt u cầu khơng vượt q 15% FDA Có thể kết luận diclofenac đạt độ ổn định cao dịch tiền phòng bảo quản nhiệt độ phòng 24 Mặc dù LQC phương pháp xây dựng cao so với phương pháp công bố [6, 7], phương pháp sử dụng detector DAD thông dụng Sau thẩm định, phương pháp định lượng dùng để đánh giá sinh khả dụng so sánh nồng độ dược chất dịch tiền phòng chế phẩm KẾT LUẬN Kết thẩm định tính chọn lọc, khoảng tuyến tính, giới hạn định lượng dưới, độ đúng, độ xác độ ổn định cho thấy phương pháp xây dựng đạt yêu cầu FDA phân tích dịch sinh học [5] TÀI LIỆU THAM KHẢO Đặng Thị Hiền, Vũ Ngọc Mai, Nguyễn Trần Linh Nghiên cứu bào chế bước đầu đánh giá khả giải phóng dược chất in vitro nhũ tương nano nhỏ mắt diclofenac Tạp chí Y - Dược học Quân 2012, 37 (1), tr.27-32 Đặng Thị Hiền, Nguyễn Hồng Vân, Nguyễn Thị Phượng CS Nghiên cứu bào chế nhũ tương nano nhỏ mắt diclofenac thiết bị phân cắt tốc độ cao Tạp chí Y - Dược học Quân 2013, 38 (1), tr.7-12, Đặng Thị Hiền, An Phương Hà, Quản Duy Quang, Vũ Ngọc Mai, Nguyễn Trần Linh Đánh giá sinh khả dụng thuốc nhỏ mắt nhũ tương nano diclofenac mắt thỏ Tạp chí Nghiên cứu Dược & Thơng tin thuốc 2015, (4), tr.19-23 Karen L.Goe, Paul Chrisp Ocular diclofenac: A review of its pharmacology and clinical use in cataract surgegy, and potential in other inflammatory ocular conditions Drug and Aging 1992, Vol 2, Issue 6, pp.473-486 (First online: 17 November 2012) Food and Drug Administration Guidance for industry: Bioanalytical Method Validation 2001 Kuhlmann O, Krauss GJ Crocheted ETFE-reactor for on-line post-column photoderivatization of diclofenac in highperformance liquid chromatography J Pharm Biomed Anal 1997, 16 (4), pp.553-559 Praksah TB, Sri KV, Krishna SR Determination of diclofenac potassium in human plasma by LC-MS Asian Journal of Chemistry 2009, 21 (6), pp.4183-4189 Akhter S, Talegaonkar S, Khan ZI et al Assessment of ocular pharmacokinetics and safety of Ganciclovir loaded nanoformulations Journal of Biomedical Nanotechnology 2011, (1), pp.144-145 109 ... Thẩm định phương pháp định lượng diclofenac dịch tiền phòng mắt thỏ: Quy trình thẩm định phương pháp định lượng tiến hành theo hướng dẫn FDA [5] - Tính chọn lọc: chuẩn bị mẫu dịch tiền phòng. .. phân tích cần thẩm định Trong giới hạn cho phép đề tài với trang thiết bị, nguyên vật liệu có, việc thẩm định phương pháp định lượng diclofenac có dịch tiền phòng mắt thỏ phương pháp HPLC - detector... thẩm định tính chọn lọc mAU mAU Diclofenac Hình 1: Sắc ký đồ dịch tiền phòng trắng Diclofenac Hình 2: Sắc ký đồ dịch tiền phòng có chứa diclofenac 500 ng/ml Kết sắc ký đồ (n = 6) cho thấy, thời