Bài báo này tác giả đề cập tới chất lượng tế bào gốc sinh tinh và tinh trùng sau nuôi cấy, khả năng thụ tinh và đánh giá một sự kiện quan trọng đó là phân chia giảm nhiễm, từ tế bào mang 46 nhiễm sắc thể thành tế bào mang 23 nhiễm sắc thể.
Xây Dựng số tiêu đánh giá chất l-ợng tế bào gốc sinh tinh tinh trùng sau nuôI cÊy Nguyễn Đình Tảo*; Trịnh Thế Sơn* Tãm t¾t Trên sở ni cấy tế bào dòng tinh tạo hệ tinh trùng từ tế bào gốc (TBG) sinh tinh môi trường nuôi cấy, mở tương lai đầy hứa hẹn cho BN khơng có tinh trùng tinh dịch không tắc Trong trình ni cấy tế bào phân chia phát triển tạo thành tinh tử Bài báo đề cập tới chất lượng tế bào gốc sinh tinh (TBGST) tinh trùng sau nuôi cấy, khả thụ tinh đánh giá kiện quan trọng phân chia giảm nhiễm, từ tế bào mang 46 nhiễm sắc thể (NST) thành tế bào mang 23 NST * Từ khóa: Tế bào gốc sinh tinh; Tinh trùng; Chất lượng tế bào gốc Establish criteria to evaluation of spermatogenesis cell qualification and spermatic after invitro cultrure Summary Based on in vitro culture of spermatogenesis cell, new cell generation developed in culture medium This have open new erea for men who sustained in non-obstructive In this paper, we focus on the quality and ability of fertilization of sperm from culture Especially, the cell going on meiosis, the cell bearing 46 chromosome divided into 23 chromosome * Key words: Spermatogenesis cell; Spermatic: Quality of sperm cell Đặt Vấn Đề Trờn sở nuôi cấy tế bào, nhà khoa học giới thành công tạo hệ tế bào Đặc biệt nuôi cấy tế bào dòng tinh BN khơng có tinh trùng tinh dịch không tắc Trong môi trường nuôi cấy tế bào phân chia phát triển tạo thành tinh tử, tinh trùng Từ năm 2006, nhiều tác giả tiến hành tiêm tinh tử tinh trùng sau ni cấy vào bào tương nỗn, kết bước đầu mở nhiều triển vọng cho cặp vô sinh, đặc biệt BN Azoospermia không tắc có chẩn đốn dòng tinh phát triển nửa chừng (muturation arrest) [14] + Dong Ryul Lee Kye Seong Kim (2006) phân lập tế bào dòng tinh BN kh không tắc, phát triển tinh trùng nửa chừng Các tinh bào I nuôi cấy phân chia giảm nhiễm thành tinh bào II tinh tử Tinh tử tiêm vào noãn theo dõi ngày Kết cho thấy sau ngày ICSI, 23,1% noãn phát triển thành tiểu nhân [5] + N Sofikitis (2005) nuôi cấy TBG sinh tinh, công bố thành công với kỹ thuật ISCI 75% tạo phơi với spermatid ni cấy 24% có thai động vật thực nghiệm Trong nghiên cứu này, tiến hành phân lập, nuôi cấy TBG sinh tinh Kết bước đầu cho thấy TBGST phát triển môi trường nuôi cấy, tăng số lượng, tạo thành tinh tử tròn, tinh tử kéo dài tinh tử kéo dài, Tuy nhiên, chất lượng tế bào vấn đề tiếp tục nghiên cứu Để giải vấn đề tiến hành đánh chất lượng tế bào sinh sản phát triển môi trường nuôi cấy từ TBGST tinh trùng sau nuôi cấy với mục tiêu: - Đánh giá khả phân chia phát triển TBGST môi trường nuôi cấy - Đánh giá khả tạo phôi ống nghiệm tinh tử sau nuôi cấy ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIªN CỨU Đối tƣợng nghiên cứu - Đối tượng 1: + 50 mẫu ống sinh tinh 50 chuột nhắt chưa trưởng thành - ngày tuổi + 100 noãn 10 chuột nhắt trưởng thành, - 10 tuần tuổi Tiêu chuẩn lựa chọn: Noãn chuột lấy vào thời điểm 14 sau tiêm hCG - Đối tượng 2: + 50 mẫu ống sinh tinh 50 BN khơng có tinh trùng + 125 nỗn 20 BN tiến hành kích thích buồng trứng làm TTTON Trung tâm Công nghệ Phôi, Học viện Quân y Hóa chất thiết bị sử dụng nghiên cứu * Thiết bị: - Tủ ấm 370C, 6% CO2 (Forma, Mỹ) - Kính hiển vi soi ngược có gắn hệ thống kính tương phản Hoffman, máy ảnh Canon vi thao tác Narishige (Olympus IX 70, Nhật) - Kính hiển vi soi (Olympus 30, Nhật) - Hood vô trùng (Sanyo, Nhật) - Dụng cụ tiêu hao: hộp cấy nunc, pipette 1ml, ml, 10 ml, đĩa petri đường kính 30mm, 60mm, 100mm, pipette pasteur, kim thực kỹ thuật ICSI * Hóa chất: - Môi trường nuôi cấy: collagenase týp I (SIGMA Chemical Co); DNase I(Gibco); soybean trypsin inhibitor (Gibco), hyaluronidase (Sigma) mơi trường PBS; huyết fetal bovine serum (Gibco); axít amin không cần thiết (Gibco) - Thuốc nội tiết: gonal-F 75 IU (Serono, Thụy Sỹ), pregnyl 1000 IU (Organon, Hà Lan) - Môi trường nuôi phôi chuột: M16, Bovine Serum Albumin (Sigma, Mỹ) - Môi trường nuôi cấy phôi: G-IVF, G1 pus, G2 plus (Vitrolife, Thụy Điển) Phƣơng pháp nghiên cứu * Phương pháp ICSI (Intracytoplasmic Sperm Injection) (theo Palermo (1992) [6]) Kỹ thuật ICSI thực đĩa nhiệt kính hiển vi đảo ngược Olympus IX 70, độ phóng đại 200 lần có gắn vi thao tác Nỗn sau rã đơng ủ tủ ấm, cho vào giọt môi trường G-IVF plus (Vitrolife) Tinh trùng hút vào kim tiêm, tiêm tinh trùng vào bào tương noãn điểm Noãn sau thực ICSI, rửa lần mơi trường G-IVF plus sau tiếp tục nuôi cấy tủ ấm 6% CO2, 370C * Nuôi cấy theo dõi phôi: Sau 16 - 18 giờ, thực kỹ thuật ICSI, đánh giá noãn thụ tinh, nỗn thụ tinh bình thường chuyển sang hộp nuôi chứa môi trường G1 plus Phôi nuôi cấy tủ ấm 6% CO2, 370C đến ngày thứ [7,10] * Kỹ thuật nhuộm FISH: FISH (Fluorescence in situ hybridisation) kỹ thuật cho phép nhìn thấy đoạn gen tế bào, lai ghép mồi với ADN tế bào phát kính hiển vi huỳnh quang KẾT QUẢ Nghiªn cøu VÀ BÀN LUẬN Tế bào dòng tinh nhuộm FISH Qua phân tích nhuộm FISH cho thấy, ngày đầu q trình ni cấy, có tinh nguyên bào tinh bào 1, tế bào có 46 nhiễm sắc thể (NST) thân NST giới tính Trên kính hiển vi huỳnh quang, tế bào phân biệt NST 18 bắt màu xanh lam NST giới tính (màu xanh thẫm) Y (màu hồng vàng) Hình 1A Sau 15 ngày, q trình ni cấy, TBG phân chia giảm nhiễm, kết tạo tế bào đơn bội NST Trên kính hiển vi huỳnh quang, tế bào phân biệt NST 18 bắt màu xanh lam NST giới tính X (màu xanh thẫm) Y (màu hồng vàng) NST X NST X NST 18 NST 18 Hình 1A: Tế bào nuôi cấy ngày Đánh giá khả thụ tinh tế bào sau nuôi cấy kỹ thuật ICSI thực nghiệm (n = 100 noãn) * Khả thụ tinh tinh tử chuột sau nuôi cấy: Khả thụ tinh tinh tử sau nuôi cấy 66/100, đạt tỷ lệ 68% Theo John Dumoulin (2001) [4] Hồ Mạnh Tường (2004) [2], tỷ lệ thụ tinh kỹ thuật ICSI với tinh trùng 67% 60,8% Kết cho thấy kỹ thuật ICSI ngày phổ biến giới mà người, mức độ áp dụng hoạt động trung tâm giới ngày hiệu đáng tin cậy Đây tỷ lệ thụ tinh cao, điều chứng tỏ ni cấy làm cho khả biệt hóa tinh tử diễn nhanh hơn, tinh tử trưởng thành có khả thụ tinh cao Qua cho thấy định xu hướng ni cấy tế bào dòng tinh hợp lý cần thiết * Sự phát triển phôi chuột ngày sau thụ tinh: Bảng 1: Số phôi Tỷ lệ % Cộng: phôi độ 4, độ Phôi độ 18 27,27% 40 (60,6%) Phôi độ 22 33,33% Phôi độ 16 24,24 Phôi độ 10 15,15% Tổng 66 100 % Kết phát triển phơi ngày với 66,6% hình thái phơi bình thường Theo John Dumoulin (2001) [7] Nguyễn Thanh Tùng (2011) [3], tỷ lệ hình thái phơi bình thường ngày với định phương pháp ICSI thông thường 53,7% 69,2% chưa thấy có khác biệt, cho thấy khả biệt hóa tế bào dòng tinh sau nuôi cấy phần ổn định mặt di truyền Đánh giá khả thụ tinh tế bào sau nuôi cấy kỹ thuật ICSI lâm sàng (n = 125 noãn) * Khả thụ tinh tinh tử sau nuôi cấy.: Đối với BN khơng có tinh trùng khơng tắc, tiêu mơ học chẩn đốn ống sinh tinh khơng có tinh tử, chúng tơi ni cấy Mặc dù q trình ni cấy phát phân chia, phát triển TBG sinh tinh thành tinh tử tròn, tinh tử kéo dài, song chất lượng tinh tử vấn đề cần tiếp tục nghiên cứu Vì vậy, nghiên cứu đánh giá khả thụ tinh tinh tử kéo dài nuôi cấy BN chẩn đốn khơng có tinh trùng có tinh tử tròn lòng ống sinh tinh * Khả thụ tinh tinh tử sau nuôi cấy: số nỗn thu được: 125; số phơi tạo thành: 80 (64%) Khả thụ tinh tinh tử sau nuôi cấy 80/125, đạt tỷ lệ 64% Theo John Dumoulin, (2001) [4] Hồ Mạnh Tường (2004) [1], tỷ lệ thụ tinh kỹ thuật ICSI với tinh trùng ni cấy (có sẵn) 67% 60,8% Kết cho thấy kỹ thuật ICSI ngày phổ biến giới mà hiệu đáng tin cậy Đây tỷ lệ thụ tinh cao, điều chứng tỏ nuôi cấy làm cho khả biệt hóa tinh tử diễn nhanh hơn, tinh tử trưởng thành có khả thụ tinh cao Qua cho thấy định xu hướng nuôi cấy tế bào dòng tinh hợp lý cần thiết Sự phát triển phôi ngày sau thụ tinh Bảng 2: Sự phát triển phôi ngày với tinh tử sau nuôi cấy Số phôi (tỷ lệ) Cộng: phôi độ 4, độ Phôi độ 16 (30,18%) 35 (66,02%) Phôi độ 19 (35,84) Phôi độ 14 (26,41) Phôi độ (7,54%) Kết phát triển phôi ngày với tỷ lệ 66,02% hình thái phơi bình thường Theo John Dumoulin (2001) [4] Nguyễn Thanh Tùng (2011) [3], tỷ lệ hình thái phơi bình thường ngày với định phương pháp ICSI thông thường 53,7% 69,2%, chưa thấy có khác biệt, cho thấy khả biệt hóa tế bào dòng tinh sau ni cấy phần ổn định mặt di truyền [1] KẾT LUẬN Qua nghiên cứu, đánh giá chất lượng TBGST tinh trùng sau ni cấy, chúng tơi có số kết luận sau: - Trong q trình ni cấy, TBGST phân chia giảm nhiễm tạo thành tinh bào I, tinh bào II tinh tử tròn, tinh tử kéo dài tinh tử kéo dài - Khả thụ tinh chất lượng phôi tạo thành với tinh trùng sau nuôi cấy + Trên thực nghiệm, 68% tinh tử có khả thụ tinh tạo phơi, số phơi độ độ ngày đạt 60,6% - Trên người, tinh tử có khả thụ tinh tạo phôi với tỷ lệ 64%, số phơi độ độ ngày đạt 66,02% TÀI LIỆU THAM KHẢO Hồ Mạnh Tường CS Thụ tinh ống nghiệm: tiêm tinh trùng vào bào tương trứng Bệnh viện Từ Dũ, Thành phố Hồ Chí Minh 2004 Nguyễn Kim Giao Hiển vi điện tử truyền qua Nhà xuất Y học 2004 Nguyễn Thanh Tùng Nghiên cứu hình thái cấu trúc hợp tử giai đoạn tiền nhân phôi hai ngày tuổi BN thụ tinh ống nghiệm Luận án Tiến sỹ Y học 2011 Trần Quán Anh CS Vô sinh nam giới, Bệnh học giới tính nam, Nhà Xuất Y học tr.253324 Dong Ryul Lee Isolation of male germ stem cell-like cell from testicular tissue of non-obsructive azoospermic patients and differencation into haploid male germ cells in vitro 2006 Francavilla S., Bianco M.A., Cordeschi G Ultrastructural analysis of chromatin defects in testicular spermatids in azoospermic men submitted to TESE–ICSI Human Reproduction 16 (7), pp.1440-1448 John C.M, Dumoulin et al Comparison of in-vitro development of embryos originating from either conventional in-vitro fertilization or intracytoplasmic sperm injection Human Reproduction Vol15, N 02, pp.402-409 Junquera L.C., Carneiro J The male reproduction system pp.418-434 Basic Histology, McGraw-hill Lucena E, Bernal DP, Lucena C, Rojas A, Moran A, Lucena A Successful ongoing pregnancies after vitrification of oocytes Fertility and Sterility 85, pp.108-111 10 Lynette Scott et al The morphology of human pronuclear embryos is positively related to blastocyst development and implantation Human Reproduction Vol 15, N011, pp.2394-2403 ... tiến hành đánh chất lượng tế bào sinh sản phát triển môi trường nuôi cấy từ TBGST tinh trùng sau nuôi cấy với mục tiêu: - Đánh giá khả phân chia phát triển TBGST môi trường nuôi cấy - Đánh giá khả... hóa tế bào dòng tinh sau nuôi cấy phần ổn định mặt di truyền [1] KẾT LUẬN Qua nghiên cứu, đánh giá chất lượng TBGST tinh trùng sau nuôi cấy, chúng tơi có số kết luận sau: - Trong q trình ni cấy, ... khả biệt hóa tế bào dòng tinh sau ni cấy phần ổn định mặt di truyền Đánh giá khả thụ tinh tế bào sau nuôi cấy kỹ thuật ICSI lâm sàng (n = 125 noãn) * Khả thụ tinh tinh tử sau ni cấy. : Đối với