Đột biến gen ATP7B ở bệnh nhân Wilson thể gan

Bài viết Đột biến gen atp7b ở bệnh nhân Wilson thể gan trình bày: Nghiên cứu được tiến hành nhằm phát hiện các dạng ñột biến gen ATP7B ở bệnh nhân Wilson thể gan, 16 bệnh nhân chẩn ñoán xác ñịnh bệnh Wilson thể gan dựa theo tiêu chuẩn của Ferenci ñược lựa chọn vào nghiên cứu, kỹ thuật giải trình tự gen ñược sử dụng ñể xác ñịnh ñột biến trên gen ATP7B,... Mời các bạn cùng tham khảo.

2015 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC ðỘT BIẾN GEN ATP7B Ở BỆNH NHÂN WILSON THỂ GAN ðỗ Thanh Hương, Trần Huy Thịnh, Ninh Quốc ðạt, Trần Vân Khánh Trường ðại học Y Hà Nội Nghiên cứu ñược tiến hành nhằm phát dạng ñột biến gen ATP7B bệnh nhân Wilson thể gan 16 bệnh nhân chẩn đốn xác ñịnh b ệnh Wilson thể gan dựa theo tiêu chuẩn Ferenci ñược lựa chọn vào nghiên cứu Kỹ thuật giải trình tự gen sử dụng để xác ñịnh ñột biến gen ATP7B Kết cho thấy ñã phát ñược18 dạng ñột b iến gen ATP7B nhóm bệnh nhân Wilson thể gan, phát ñược dạng ñột b iến chưa ñược công b ố (p.T850I, c ins 47/48 CGGCG, p.F1240I p.G50S); 11 đột biến cơng b ố gây b ệnh (p.S105Stop, c.-75C > A, c.-118/117 ins GCCGC, p.W939C, p.C980S, p.C980Stop, p.G943D, p.N1270I, p.T715A, p.R778L, c.4060 + C > T) đột b iến dạng đa hình thái hay thể biến dị (p.V456L, p.K832R, p.F1144I) Từ khóa: Bệnh Wilson thể gan, gen ATP7B, ñột biế n gen I ðẶT VẤN ðỀ gan ng thường ñược chẩn ñoán muộn với Bệnh Wilson ñược biết ñến bệnh thối biểu triệu chứng nặng Nếu bệnh hóa gan - nhân đậu, tác giả Kinnear chẩn đốn ñiều trị sớm ñặc biệt Wilson mơ t ả lần vào năm 1912 [ 1] bệnh nhân Wilson thể gan, ngăn chặn Cho ñến nay, bệnh ñược phát hầu hết quốc gia chủng tộc Thế giới ñược biến chứng hạn chế phát triển bệnh với tỷ lệ mắc 1/105 ñến 1/35.000 trẻ sinh Ở Việt Nam, lần có hai t rường ðây bệnh di truyền, ñột biến gen lặn hợp bệnh nhân bị bệnh Wilson ñược phát nhiễm sắc thể thường 13q14.3, mã hóa gen mang ñột biến gen Arg778Leu vào năm 2010 ATP7B gây t hiếu hụt enzym A TP ase typ P [3] Các nghiên cứu sau tiếp tục xác định (P - A TP ase) [2] Gen A TP7B gồm 21 ex on ñột biến số vùng t rọng điểm hồn chiều dài khoảng 80kb, mã hóa c ho phân tử thiện quy trình xác định đột biến gen A TP7B protein 1465 acid amin Gen có vai trò [4; 5] Như vậy, số lượng nghiên cứu đột biến điều hòa q trình hấp thu, phân bố thải gen A TP7B Việt Nam hạn chế chưa trừ ñồng t rong thể Do ñó, ñột biến ñầy ñủ ñột biến gen A TP 7B, chưa có gen xảy s ẽ gây rối loạn q t rình chuyển phân tích gen giúp chẩn đốn sớm bệnh hóa đồng, đặc biệt giảm tiết ñồng qua nhân tổn thương gan Do vậy, ñề tài ñược tiến ñường mật Lượng ñồng ứ lại t rong thể hành nhằm phát dạng ñột biến gen lắng ñọng dần t ổ chức: gan, não ATP7B bệnh nhân Wilson thể gan (chủ yếu nhân xám trung ương), mắt, da, thận, xươ ng, gây c ác triệu c hứng ña II ðỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP dạng lâm sàng B ệnh biểu sớm ðối tượng 16 bệnh nhân ñược chẩn ñoán xác ñịnh ðịa liên hệ: ðỗ Thanh Hương, Bộ môn Nhi, Trường ðại học Y Hà Nội Email: drdothanhhuong@yahoo.com Ngày nhận: 27/5/2015 Ngày ñược chấp thuận: 20/7/2015 TCNCYH 95 (3) - 2015 bệnh Wilson theo thang ñiểm Ferenci ñều có tổng số ñiểm WD ≥ 4, với biểu tăng enzym gan (AS T ALT ≥ 60 UI/l), tăng lượng ñồng nước tiểu 24 (≥ 100 µg/ngày), TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC ceruloplasmin huy ết giảm (< 20mg/dl)), Xử lý số liệu có vòng Kayser - Fleischer [6] phân loại thể Số liệu ñược thu thập theo mẫu bệnh lâm sàng theo tiêu chuẩn Hội Gan Mật án nghiên cứu thống Nghiên cứu ñược quốc tế năm 2003 [ 7] Các bệnh nhân thể gan ñược chọn làm đối tượng nghiên u có tăng enzym gan, số bệnh nhân có biểu suy gan khơng có triệu chứng thần kinh Các bệnh nhân ñược ñiều trị bệnh viện Bạch Mai bệnh viện Nhi Trung ương thực t ại Trung tâm Nghiên cứu Gen Protein, Trường ðại học Y Hà Nội ðạo đức nghiên cứu Bệnh nhân hồn tồn tự nguyện tham gia vào nghiên cứu c ó quyền rút khỏi nghiên cứu khơng đồng ý tiếp tục tham gia vào Phương pháp Lấy mẫu bệnh phẩm: 2ml máu tĩnh mạch chống đơng EDTA Kỹ thuật tách chiết DNA từ máu ngoại vi: DNA t số tách c hiết từ máu tồn phần phenol - chloroform - isopropanol (25:24:1) nghiên cứu Bệnh nhân thơng báo kết xét nghiệm gen ñể giúp c ho bác sỹ tư vấn di truyền lựa chọn phác ñồ ñiều trị phù hợ p Các thơng tin cá nhân đảm bảo bí mật III KẾT QUẢ Kỹ thuật giải t rình tự gen: Toàn 21 exon gen A TP7B ñược khuếch ñại với cặp Kết xác ñịnh ñột biến gen ATP7B mồi ñặc hiệu [ 2] Các sản phẩm PCR ñược Nghiên cứu ñã phát ñược 18 dạng ñột tiến hành giải trình tự trực tiếp máy ABI biến exon: 1, 2, 3, 8, 10, 13, 14, 16, 18 3100 Genetic Analyzer Kết ñược thu thập 5’UTR Các ñột biến hay gặp là: p.V456L xử lý phần mềm AB I PRISMTM 3100 – exon (9/18 ñột biến); ñột biến -ins 47/ 48 A vant CGGCG t rên exon (7/18 ñột biến); ñột biến Data Collection, DNA S equencing Analysis 5.2 BLAS T NCBI c -75 C > A vùng 5’ UTR (6/18 ñột biến) Các gen ñột biến ñược so sánh t rên ngân (bảng 1) Trong có dạng đột biến hàng gen: DNA (NG - 008806) mRNA (NM- chưa cơng bố, là: p T850I; c ins 000053) 47/48 CGGCG (hình 1); p.F1240I p.G50S Người bình thường Bệnh nhân mã số W11.00 TCNCYH 95 (3) - 2015 2015 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC Người bình thường Bệnh nhân mã số W11.00 Hình Hình ảnh giải trình tự gen ATP7B exon exon bệnh nhân W11.00 Bảng Kết xác ñịnh ñột biến gen ATP7B bệnh nhân Wilson TT Mã số W1.00 W5.00 W11.00 W17.00 Exon ðột biến Thể ñột Chú Tài liệu p.S105 Stop ðồng hợp DV Mak CM, (2008) 10 p.K832R (c.2652A > G) Dị hợp SNP Okada T, (2000) Ins 47/48 CGGCG Dị hợp New p.V456L (c.1523 G > C) Dị hợp SNP 10 p.T850I (c.2706 C > T) Dị hợp New ins 47/48 CGGCG Dị hợp New p.V456L (c.1523G >C) Dị hợp SNP Gu YH, (2003) 5’UTR c.-75C > A ðồng hợp DV Yamaguchi A, 5’UTR c.-118/117 ins GCCGC ðồng hơp DV Gu YH, (2003) p.V456L (c 1523 G > C) Dị hợp SNP Gu YH, (2003) 10 p.K832R (c.2652A > G) ðồng hợp SNP Okada T, (2000) ins 47/48 CGGCG Dị hợp New p.V456L (c 1523 G > C) Dị hợp SNP Gu YH, (2003) 10 p.K832R (c.2652A > G) Dị hợp SNP Okada T, (2000) 12 p.W939C (c.2974G > C) Dị hợp DV Folhoffer A, 13 p.C980S (c.3106G > C; Dị hợp DV Mak CM, (2005) Gu YH, (2003) W19.00 TCNCYH 95 (3) - 2015 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC TT Mã số W19.00 W21.00 W22.00 W23.00 W24.00 10 W29.00 11 W32.00 12 13 14 W33.00 W36.00 W40.00 Exon ðột biến Thể ñột Chú Tài liệu 13 p.C980 Stop(c.3107C > A) Dị hợp DV Mak CM, (2008) 16 p.F1144I (c.3587T > A) Dị hợp SNP Todorov T, ins 47/48 CGGCG Dị hợp New p.V456L (c 1523 G > C) Dị hợp SNP ins 47/48 CGGCG Dị hợp New p.V456L (c.1523G > C) Dị hợp SNP Gu YH, (2003) 14 p.G943D ðồng hợp DV Wan L, (2006) 5’UTR c.-75C > A ðồng hợp DV ins 47/48 CGGCG ðồng hợp New p.V456L (c 1523 G > C) ðồng hợp SNP 18 p.F1240I (c.3975C > A) Dị hợp New 18 p.N1270I (c.3966A > T) Dị hợp DV Yamaguchi A, p.T715A (c.2147T > G) Dị hợp DV Gupta A, (2005) p.R778L (c 2490 G > T) Dị hợp DV Nanji MS, ins 47/48 CGGCG Dị hợp New 10 p.T850 I (c.2706 C > T) Dị hợp New 5’UTR c.-75C > A Dị hợp DV Yamaguchi A, p.V456L (c 1523 G > C) Dị hợp SNP Gu YH, (2003) 10 p.K832R (c.2652A > G) Dị hợp SNP Okada T, (2000) 5’UTR c.-75C > A Dị hợp DV Yamaguchi A, p.G50S (c.305G > A) Dị hợp New 18 c.4060 + C > T Dị hợp DV Liu XQ, (2004) 5’UTR c.-75C > A Dị hợp DV Yamaguchi A, 5’UTR c.-118/117 ins GCCGC Dị hợp DV Gu YH, (2003) p.V456L (c 1523 G > C) Dị hợp SNP Gu YH, (2003) Gu YH, (2003) Yamaguchi A, (1998) Gu YH, (2003) TCNCYH 95 (3) - 2015 2015 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC TT Mã số 15 W44.00 16 W45.00 Exon ðột biến Thể ñột Chú Tài liệu 5’UTR c.-75C > A ðồng hợp DV Yamaguchi A, 5’UTR c.-118/117 ins GCCGC ðồng hợp DV Gu YH, (2003) 5’UTR c.-75C > A ðồng hợp DV Yamaguchi A, 5’UTR c.-118/117 ins GCCGC ðồng hợp DV Gu YH, (2003) * New: ðột biến mới; DV: Disease Variant (ñột biến gây bệnh); SNP: Single Nucleotide Polymorphism (tính đa hình đơn nucleotid) IV BÀN LUẬN (c.2706 C > T); c ins 47/48 CGGCG; p.F1240I Thống kê từ nghiên cứu Thế giới cho thấy có 300 dạng đột biến gen gây (c.3975C > A) p.G50S (c.305G > A) bệnh Wilson, bao gồm đột biến vơ nghĩa, 19.00; W21.00; W22.00; W24 00; W32.00) sai nghĩa, thêm bớt nucleotide gây lệch mang ñột biến c ins 47/48 CGGCG ex on khung dịch mã protein [6] Tần suất mắc ðột biến thêm nucleotide CGGCG dạng ñột biến khác quốc gia vùng mã hóa acid amin gây lệch tồn chủng tộc Thế giới [8 - 14] Trong đó, khung dịch mã, làm khả tổng hợp dạng ñột biến phổ biến nhóm bệnh protein Bệnh nhân có biểu bệnh nặng nhân Wilson khu vực châu Âu ñột biến ñây ñột biến ñồng hợp tử H1069Q (C3270A ) gây thay Có bệnh nhân (mã số W5.00; W11.00; W Bệnh nhân mã số W5.00 W32.00 mang Histidine thành Glutamine thuộc vùng N ñột biến p.T850I (c.2706 C > T) ex on protein A TP7B [ 10; 12] ðột biến Arg778Leu 10 ðột biến nằm vùng cấu trúc exon gen A TP 7B ñã ñược công bố xuyên màng ðột biến p T850I làm thay ñổi phổ biến quần thể người châu Á [9; 11; 13; 14] Kết nghiên cứu chúng tính chất acid amin vị trí 850 làm ảnh hưởng ñến chức prot ein Hơn nữa, tơi năm 2007 phát bệnh nhân mang bệnh nhân có thêm đột biến c ñột biến Arg778Leu dạng dị hợp nhóm ins 47/48 CGGCG exon 1dạng dị hợ p cho 29 bệnh nhân phân tích gen [3] Trong nên dạng ñột biến gây nên biểu nhóm nghiên cứu (năm 2012 - 2014), lâm sàng bệnh Wilson chúng tơi phát 18 dạng ñột biến Bệnh nhân mã số W36.00 mang ñột biến có bệnh nhân mang ñột biến Arg778Leu p.G50S (c.305G > A) exon bệnh Những ñột biến ñều nằm vùng chức nhân mã số W24.00 mang ñột biến protein A TP 7B [8] Cũng p.F1240I (c.3975C > A) exon 18 Cả hai nghiên cứu phát ñược dạng ñột bệnh nhân ñều mang đột biến missense biến chưa cơng bố, là: p.T850I nằm vùng mã hoá (thay nucleotid TCNCYH 95 (3) - 2015 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC Lời cảm ơn dẫn ñến thay acid amin) làm biến ñổi cấu trúc chức gen A TP 7B biểu t riệu chứng tích lũy đồng gan Trong nghiên cứu này, có trường hợp mang đột biến (bệnh nhân mã số W23.00): ñột biến p.G943D exon 14 dạng đồng hợp cơng bố gây bệnh; lại 15/ 16 Nghiên cứu thực với hỗ trợ kinh phí ðề tài cấp Bộ Y tế: “Nghiên cứu phát ñột biến gen A TP7B gây bệnh Wilson” giúp ñỡ cán Trung tâm nghiên cứu Gen - P rotein, Bộ môn Nhi, Trường ðại học Y Hà Nội TÀI LIỆU THAM KHẢO trường hợp mang ñột biến Trong số bệnh nhân mang từ đột biến trở lên dạng ñồng hợp tử Wilson SAK (1912) Progressive len- mang t ồn đột biến dị hợp tử kèm theo ticular thể biến dị: bệnh nhân mã số W19.00 mang ñột biến ñều dạng dị hợp tử; bệnh nhân mã disease associated with cirrhosis of the liver degeneration: a familial nervous Brain, (34), 295 - 507 Bull P, Thoma s G R, Forbe s J et al số W5.00 mang ñột biến dị hợp p.V456L (c 1523 G > C) dạng S NP ñược công bố (1993) The Wilson disease gene is a putative khơng gây bệnh lại có thêm đột biến copper transporting P-type A TP ase similar to dạng dị hợp tử p T850I (c.2706 C > T) c ins 47/48 CGGCG ðiều giải the Menkes disease gene Nat ure Genet, (5), thích bệnh nhân mang ñột biến dù dạng dị ðỗ Thanh Hương, Nguyễn Văn Liệu, hợp ng vùng chức tổng hợp gen phối hợp nhiều ñột biến dị hợp Phan Tuấn Nghĩa, Nguyễn Thị Vân Anh (2010) ðột biến gen R778L bệnh nhân tạo hiệu ứng cộng hưởng gây bệnh Như vậy, ñột biến gen gây bệnh Wilson thể 235 327 - 337 Wilson Việt Nam Tạp chí Nhi k hoa, (3), 231 - gan gen A TP 7B có nhiều dạng, Hồ Cẩm Tú, Tạ Minh Hiếu, Trần Vân bệnh nhân có nhiều ñột biến Khánh, Tạ Thành Văn (2011) Xây dựng quy dị hợp khác tạo nên biểu t ổn trình xác định đột biến gen A TP7B gây bệnh thương gan thay ñổi số sinh hóa Wilson Tạp chí Nghiên cứu Y học, 74(3), máu nước tiểu ðặc ñiểm c ho 26 - 29 thấy t ính đa hình c bệnh lý di truy ền gen lặn t rên nhiễm s ắc t hể t hườ ng Nguyễn Thị Mai Hương, Ngô Diễm Ngọc, Nguyễn Phương Mai cộng (2013) Xác ñịnh ñột biến gen A TP7B V KẾT LUẬN vùng hot-spots bệnh nhân Wilson Tạp chí Y Nghiên cứu phát 18 ñột biến học Việt Nam, 407(2), 132 - 135 có đột biến chưa cơng Peter Ferenci (2006) Regional distribu- bố (p T850I, c ins 47/48 CGGCG, p.F1240I tion of mutations of the A TP7B gene in patients with Wilson disease: impact on genetic p.G50S ); 11 đột biến cơng bố gây bệnh (p.S105Stop, c.-75C > A, c.-118/117 ins GCCGC, p.W939C, p.C980S, p.C980 Stop, testing Hum Genet, (120), 151 - 159 p.G943D, p.R778L, (2003) Diagnosis and phenotypic classifica- c.4060 + C > T) ñột biến dạng ña tion of Wilson disease Liver International, hình thái (p.V456L, p.K832R, p.F1144I) (23), 139 - 142 p.N1270I, p.T715A, Ferenci P, Caca K, Loudianos G et al TCNCYH 95 (3) - 2015 2015 TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC Michael D Bates, Nicholas P Matarazzo (2009) Different types of anorectal of Wilson disease in Spanish patients.Hepatol Res, (37), 18 - 26 malformations are associated with different 12 Wu ZY, Wang N, Lin MT et al (2001) combinations of ot her congenital anomalies Mutation analysis and the correlation bet ween conference on clinical research for rare Dis- genotype and phenotype of A rg778Leu mutation in chines e patients wit h Wilson disease eases Mak CM, Lam CW, Tam S et al (2008) Mutational analysis of 65 Wilson disease patients in Hong Kong Chinese: identification of 17 novel mutations and its genetic heterogeneity Journal of human genetics (53), 55 - 63 Archives of neurology, (58), 971 - 976 13 Santhosh S (2006) A TP7B mutations in families in a predominantly Southern Indian cohort of Wilson’s Disease patients Indian J Gastroenterol (25), 277 - 282 14 Gupta A (2007) Molecular pathologenesis of Wilson disease among Indi- 10 Curti s D, Durkie M, Balac P et al ans: a pers pective on mutation s pectrum in (1999) A study of Wilson disease mutations in ATP7B gene, prevalent defects, clinical het- Britain Human mut ation, (14), 304 - 311 erogeneity an implication towards diagnosis 11 Brage A, Tome S, Garcia A et al (2007) Clinical and molecular characterization Cellular and molecular neurobiology, (37), 1023 - 1033 Summary IDENTIFICATION OF ATP7B GENE MUTATION IN PATIENTS WITH HEPATIC WILSON DISEASE Objective of the study was to identify ATP 7B gene mutation features of hepatic Wilson disease Sixteen patients wit h confirmed hepatic Wilson disease on Ferenci’s criteria were analyzed by direct sequencing to identify ATP7B gene mutation We identified 18 mut ations in ATP 7B gene: four new mutations have not been published, p T850I, c ins 47/48 CGGCG, p.F1240I and p.G50S; eleven identified disease-causing mutations are p.S105Stop, c.-75C > A, c.-118/117 ins GCCGC, p.W939C, p.C980S, p.C980Stop, p.G943D, p N1270I, p T715A, p.R778L, and c.4060 + C > T In addition, three SNP mutations are also identified, p.V456L, p.K832R, and p.F1144I Keywords: hepatic Wilson di sease, ATP7B gene, mutation TCNCYH 95 (3) - 2015 ... tích gen [3] Trong nên dạng ñột biến gây nên biểu nhóm nghiên cứu (năm 2012 - 2014), lâm sàng bệnh Wilson chúng tơi phát 18 dạng đột biến Bệnh nhân mã số W36.00 mang ñột biến có bệnh nhân mang đột. .. ñột biến trở lên dạng đồng hợp tử Wilson SAK (1912) Progressive len- mang t ồn đột biến dị hợp tử kèm theo ticular thể biến dị: bệnh nhân mã số W19.00 mang ñột biến ñều dạng dị hợp tử; bệnh nhân. .. nhóm bệnh protein Bệnh nhân có biểu bệnh nặng nhân Wilson khu vực châu Âu ñột biến ñây ñột biến ñồng hợp tử H1069Q (C3270A ) gây thay Có bệnh nhân (mã số W5.00; W11.00; W Bệnh nhân mã số W5.00