Nghiên cứu đột biến gen ATP7B trên bệnh nhân Wilson người lớn

Bài viết Nghiên cứu đột biến gen ATP7B trên bệnh nhân Wilson người lớn trình bày xác định các dạng đột biến trên toàn bộ 21 exon của gen ATP7B và tỉ lệ của các đột biến này ở bệnh nhân Wilson người lớn.

Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 25 * Số * 2021 Nghiên cứu Y học NGHIÊN CỨU ĐỘT BIẾN GEN ATP7B TRÊN BỆNH NHÂN WILSON NGƢỜI LỚN Lê Hữu Phước1 TÓM TẮT Mục tiêu: Xác định dạng đột biến toàn 21 exon gen ATP7B tỉ lệ đột biến bệnh nhân Wilson người lớn Đối tượng phương pháp nghiên cứu: Nghiên cứu cắt ngang, thực 56 bệnh nhân chẩn đoán bệnh Wilson theo tiêu chuẩn Ferenci Gen ATP7B phân tích kỹ thuật giải trình tự trực tiếp từ exon 121 Phân tích trình tự gen exon so sánh với hệ thống liệu NCBI (National Center for Biotechnology Information) để xác định dạng đột biến gen ATP7B tỉ lệ đột biến Kết quả: Tuổi trung bình 26,91 ± 7,24, tuổi nhỏ 18, lớn 51, nam chiếm 42,9%, nữ 57,1% Tỉ lệ phát đột biến gen nghiên cứu 96,4% Dạng đột biến c.525 – 526 insA Thr 850 Ile thường gặp nhất, chiếm tỉ lệ 15,8%; Ser 105 Stop 14,6% đột biến Arg 778 Leu 7,3% Kết luận: Có dạng đột biến gen thường gặp bệnh nhân Wilson người lớn đột biến c.525-526insA, Thr 850 Ile, Ser 105 Stop Arg 778Leu Trong tỉ lệ đột biến c.525-526insA Thr 850 Ile 15,8%, Ser 105 Stop 14,6% đột biến Arg 778 Leu 7,3% Từ khóa: bệnh Wilson, genATP7B, đột biến gen ABSTRACT STUDY OF ATP7B GENE MUTATION IN THE ADULT PATIENTS WITH WILSON DISEASE Le Huu Phuoc * Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Vol 25 - No - 2021: 87 - 91 Objectives: The objective of this study was to determine all kinds of mutation on 21 exons of ATP7B gene and the rate of these mutations in the adult patients with Wilson disease Methods: A cross-sectional study was conducted on 56 patients with Wilson disease diagnosed basing on standards of Ferenci criteria ATP7B gene were analyzed by direct sequencing of exon 1-21 Analysing sequence on exons and comparison of these exons to database from NCBI (National Center for Biotechnology Information) to determine all kinds of mutations of ATP7B gene and the rate of these mutations Results: The average age was 26.91 ± 7.24, 42.9% male, 57.1% female The youngest patient was 18 years old, the oldest one was 51 The rate of gene mutations in this study was 96.4% The c.525 – 526 insA and Thr 850 Ile mutation was common, accounted for 15.8%, Ser 105 Stop mutation accounted for 14.6% and Arg 778 Leu mutation accounted for 7.3% Conclusions: There were four kinds of gene mutations commonly in the adult patients with Wilson disease including c.525 – 526 insA mutation, Thr 850 Ile mutation, Ser 105 Stop mutation and Arg 778 Leu mutation The rate of these mutations was 15.8%, 15.8% and 14.6% and 7.3% respectively Keywords: Wilson disease, ATP7B gene, gene mutation Khoa Viêm Gan, bệnh viện Chợ Rẫy Tác giả liên lạc: ThS.BS Lê Hữu Phước ĐT: 0978133180 Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Bệnh Viện Chợ Rẫy Email: huuphuocbnd@yahoo.com 87 Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 25 * Số * 2021 Nghiên cứu Y học ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh Wilson bệnh di truyền lặn nhiễm sắc thể thường, đột biến gen ATP7B Gen có vai trị điều hịa q trình hấp thu, phân bố thải trừ đồng (Cu) thể Khi gen ATP7B bị đột biến, trình đào thải Cu bị rối loạn, Cu lắng đọng mơ Tùy theo thời gian, vị trí mà lâm sàng có biểu khác tốn thương não, gan, mắt, xương, khớp, thận Nếu không điều trị, bệnh diễn tiến nặng dần tử vong(1) Chẩn đốn bệnh dựa triệu chứng lâm sàng số sinh hóa ceruloplasmin máu giảm, đồng nước tiểu tăng Việc phát bệnh giai đoạn sớm khó khăn dựa vào lâm sàng sinh hóa Hiện nay, phân tích đột biến gen xét nghiệm đặc hiệu giúp chẩn đốn sớm, xác bệnh Wilson Từ mở đường cho việc tầm soát người nghi ngờ mắc bệnh, thành viên gia đình bệnh nhân Do đó, chúng tơi tiến hành đề tài nghiên cứu nhằm mục tiêu: Xác định dạng đột biến toàn 21 exon gen ATP7B tỉ lệ đột biến bệnh nhân Wilson người lớn ĐỐI TƢỢNG- PHƢƠNG PHÁP NGHIÊNCỨU Đối tƣợng nghiên cứu Các bệnh nhân chẩn đoán bệnh Wilson bệnh viện Chợ Rẫy từ 9/2015 9/2020 Tiêu chuẩn chọn mẫu Tất bệnh nhân ≥16 tuổi, đủ tiêu chuẩn chẩn đoán bệnh Wilson Ferenci Tiêu chuẩn loại trừ Bệnh nhân (BN) không đồng ý tham gia nghiên cứu Không thu thập đủ số liệu cho nghiên cứu Phƣơng pháp nghiên cứu Thiết kế nghiên cứu Nghiên cứu cắt ngang mô tả Thu thập số liệu theo mẫu bệnh án bệnh nhân Wilson đủ tiêu chuẩn chọn lựa 88 Cỡ mẫu Toàn bộ, gồm 56 bệnh nhân thỏa tiêu chuẩn chẩn đoán Wilson theo Ferenci R(2) Bảng 1: Bảng điểm chẩn đoán bệnh Wilson Ferenci Triệu chứng Vịng Kayser-Fleischer Triệu chứng thần kinh Ceruloplasmin máu Có Khơng Nặng Nhẹ Khơng có >20 mg/dl 10 – 20 mg/dl 250g/g gan khô 50-250 g/g gan khô Bình thường Bình thường Cu nước tiểu 24h 1-2 ULN > ULN Có Thiếu máu tán huyết coomb test (-) Không Cả allen Đột biến gen ATP7B Chỉ allen Không đột biến gen Tổng số điểm ≥ 4: chẩn đoán xác định bệnh Wilson = 3: mắc bệnh Wilson ≤ 2: loại trừ bệnh Wilson Cu gan (đã loại trừ tắc mật) Điểm 2 0 2 -1 Phương pháp chọn mẫu Chọn mẫu theo phương pháp thuận tiện, liên tục dựa theo tiêu chuẩn chẩn đoán Ferenci R Các bước tiến hành Các bệnh nhân nghi ngờ mắc bệnh Wilson đưa vào quy trình tầm sốt bao gồm: khám mắt tìm vịng Kayser-Fleischer, ceruloplasmin máu, đồng niệu 24 phân tích đột biến gen ATP7B Phân tích đột biến gen ATP7B: Các bệnh nhân đủ tiêu chuẩn chẩn đoán bệnh Wilson theo Ferenci tiến hành lấy 2ml máu tĩnh mạch, phân tích đột biến gen theo quy trình giải trình tự DNA tồn 21 exon vùng promoter gen ATP7B kỹ thuật Sanger Giải trình tự phương pháp Sanger: Sản phẩm PCR tinh thực phản ứng cylce sequencing với BigDye® Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Bệnh Viện Chợ Rẫy Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 25 * Số * 2021 Terminator v3.1 Cycle Sequencing kit (Applied Biosystems, Mỹ) theo hai chiều xi ngược Sản phẩm sau kết tinh ethanol, hịa tan tyrong Hi-Di formanide, biến tính 950C trước làm đột ngột Trình tự DNA đọc máy ABI 3130 Genetic Analyzer, với POP-7 polymer capillary 50cm (Applied Biosystems, Mỹ) Nghiên cứu Y học KẾT QUẢ Tuổi Bảng 1: Phân bố đặc điểm theo tuổi giới Đặc điểm Tuổi < 20 20-29 30-39 40-49 ≥ 50 Giới Nam Nữ Tổng Phân tích kết giải trình tự: Kết giải trình tự phân tích phần mềm CLC Main Wordbench, so sánh với trình tự chứa gen ATP7B mang mã số NG-008806 Gen-Bank để xác định đột biến gen Tỷ lệ (%) 34 11 2 12,5 60,7 19,6 3,6 3,6 24 32 56 42,9 57,1 100,0 Tuổi trung bình 26,91 ± 7,24, nhỏ 18, lớn 51 Nữ chiếm ưu (57,1%), nam 42,9% (Bảng 1) Biến số nghiên cứu Tuổi: biến liên tục (năm) Giới: biến nhị giá (nam/nữ) Thể lâm sàng Ceruloplasmin: biến liên tục (mg%) Bảng 2: Thể lâm sàng Đồng niệu 24 giờ: biến liên tục (mcg%) Vòng Kayser-Fleischer: (dương, âm) Số BN biến nhị Thể lâm sàng Gan đơn Gan – thần kinh Gan – huyết học Tổng giá Đột biến gen: biến phân loại, gồm giá trị tương ứng tên đột biến giá trị không (không phát đột biến) Kiểu đột biến: biến phân loại, gồm giá trị: chèn vào, thay Phương pháp thu thập số liệu Bệnh án nghiên cứu ghi nhận dấu hiệu lâm sàng, cận lâm sàng Khám mắt tìm vịng Kayser-Fleischer: thực khoa mắt, bệnh viện Chợ Rẫy Ceruloplasmin máu, đồng niệu 24 thực khoa sinh hóa, bệnh viện Chợ Rẫy Phân tích đột biến gen ATP7B thực trung tâm sinh học phân tử, đại học Y Dược thành phố Hồ Chí Minh Phân tích xử lý số liệu Xử lý số liệu phần mềm SPSS 18.0 Các biến liên tục kiểm định t độc lập; biến phân loại phân tích trình bày theo tần suất (%); so sánh nhóm dung test xác Fisher Số BN 35 16 56 Tỷ lệ (%) 62,5 28,6 8,9 100,0 Thể gan đơn chiếm tỉ lệ cao (62,5%), thể gan – thần kinh (Bảng 2) Đột biến gen ATP7B Bảng 3: Số lượng đột biến gen bệnh nhân Số lượng đột biến gen Tổng Số BN 26 28 56 Tỷ lệ (%) 3,6 46,4 50,0 100,0 Bảng 4: Đột biến gen Đột biến gen ala 1231 thr ala 1295 val ala 874 val arg 771 leu arg 778 gln arg 778 leu arg 919 gly asp 1027 his asp 765 gly c 2304 - 2305 insC c 525-526 insA gle 1173 lys Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Bệnh Viện Chợ Rẫy Gen đột biến 1 1 13 Tỷ lệ (%) 1,2 1,2 1,2 1,2 1,2 7,3 1,2 3,7 6,1 3,7 15,8 1,2 89 Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 25 * Số * 2021 Nghiên cứu Y học Đột biến gen gly 943 asp ile 1148 thr leu 1209 val leu 1371 pro leu 792 pro leu 902 pro p asp 765 gly pro 1052 leu pro 1273 gln pro 992 leu ser 105 stop ser 1356 pro thr 762 pro thr 850 ile val 1297 ile Tổng Gen đột biến 1 12 1 13 82 Tỷ lệ (%) 1,2 4,9 1,2 2,4 1,2 3,7 1,2 2,4 1,2 1,2 14,6 1,2 1,2 15,8 1,2 100,0 Có dạng đột biến gen thường gặp là: c 525526 insA (15,8%), thr 850 ile (15,8%), ser 105 stop (14,6%) arg 778 leu (7,3%) (Bảng 3, 4) Bảng 5: Vị trí đột biến Vị trí đột biến exon 10 exon 11 exon 12 exon 13 exon 14 exon 16 exon 17 exon 18 exon exon 20 exon exon Tổng Gen đột biến 13 5 25 18 82 Tỷ lệ (%) 15,9 4,9 2,4 1,2 6,1 6,1 2,4 3,7 30,5 3,7 22,0 1,2 100,0 Đột biến thường xảy exon (30,5%), exon (22,0%) exon 10 (15,9%) (Bảng 5) BÀN LUẬN Bệnh Wilson bệnh gặp Theo Gollan JL(1), tỉ lệ bệnh khoảng 1/30.000-1/100.000 trẻ sinh tần suất gen bệnh khoảng 0,56% Bệnh gặp nơi, chủng tộc giới Ngày người ta biết nguyên nhân đột biến gen ATP7B nằm nhiễm sắc thể 13ql4.3 bệnh nhân Tần suất, kiểu đột biến gen khác tùy theo chủng tộc Các nghiên cứu giới 90 chứng minh đột biến Hisl069Gln exon 14 gen ATP7B thường gặp Châu Âu; đó, đột biến Arg778Leu exon phổ biến quần thể Châu Á(3) Trong nghiên cứu chúng tôi, tỉ lệ phát đột biến gen 96,4% Chúng phát dạng đột biến thường gặp là: c.525-526insA, Thr 850 Ile, Ser 105 Stop Arg 778 Leu Đột biến c.525-526insA loại đột biến thường gặp nhất, chiếm tỉ lệ 15,8% (Bảng 5) Đây đột biến chèn thêm nucleotide (insertion), tạo thêm 27 acid amin lạ kết thúc giải mã sớm codon 203 Kết nghiên cứu phù hợp so với số tác giả khác Năm 2012, Hoàng Lê Phúc cộng sự(4) thực đề tài “Nghiên cứu phát đột biến exon gen ATP7B bệnh nhân Wilson Việt Nam” Nghiên cứu thực 15 bệnh nhân Wilson bệnh viện Nhi Đồng 1, thành phố Hồ Chí Minh Kết nghiên cứu sau: đột biến c.525-526 insA chiếm tỉ lệ 26,7% Như vậy, tỉ lệ đột biến c.525- 526insA nghiên cứu chúng tơi cao, phù hợp tác giả Hồng Lê Phúc Đột biến Thr 850 Ile chiếm tỉ lệ 15,8% (Bảng 5) Đây đột biến thay nucleotide, Threonine vị trí 850 bị thay Isoleucine, kéo theo thay đổi Threonin vị trí 850 thành Isoleucine Theo nghiên cứu giới, đột biến Thr 850 Ile thường gặp Châu Á Nghiên cứu Lei cộng Đài Loan, phương pháp khuếch đại chuỗi cắt enzyme giới hạn nhiệt độ 37°C, cho thấy đột biến Thr 850 Ile (20,0%)(5) Như vậy, kết nghiên cứu phù hợp với tác giả Châu Á Năm 2007, Đỗ Thanh Hương(6) tiến hành nghiên cứu đột biến gen bệnh nhân Wilson phương pháp giải trình tự gen Đối tượng nghiên cứu bao gồm 23 bệnh nhân khoa thần kinh, bệnh viện Bạch Mai Tác giả tập trung khảo sát loại đột biến Arg778Leu Kết quả: tỉ lệ đột biến Arg778Leu dạng dị hợp 8,7% Trong nghiên cứu Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Bệnh Viện Chợ Rẫy Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 25 * Số * 2021 chúng tôi, đột biến Arg778Leu chiếm tỉ lệ 7,3% (Bảng 5), tương tự giả Đỗ Thanh Hương Trong nghiên cứu có bệnh nhân khơng phát đột biến gen (Bảng 4), chiếm 3,6%, đủ tiêu chuẩn chẩn đoán bệnh Wilson theo Ferenci R(2) Gen ATP7B cấu tạo exon, intron, promoter vùng tiếp nối Chúng ta chưa biết rõ hoàn toàn cấu trúc, chức vùng Với kỹ thuật xét nghiệm nay, phát đột biến exon intron, vị trị khác chưa thực Điều giải thích có bệnh nhân không phát đột biến Hy vọng tương lai không xa, hiểu biết đầy đủ hơn, trọn vẹn biến đổi gen bệnh phức tạp Về vị trí đột biến, thường xảy exon (30,5%) exon (22%) (Bảng 6) Kết nghiên cứu phù hợp với Hoàng Lê Phúc(4), Đỗ Thanh Hương(6) tác giả Châu Á Trên sở đó, chúng tơi đề xuất khảo sát exon nghiên cứu nhằm tiết kiệm chi phí cho bệnh nhân Nghiên cứu Y học KẾT LUẬN Có dạng đột biến gen thường gặp bệnh nhân Wilson người lớn đột biến c.525526insA, Thr 850 Ile, Ser 105 Stop Arg 778Leu Trong tỉ lệ đột biến c.525-526insA Thr 850 Ile 15,8%, Ser 105 Stop 14.6% đột biến Arg 778 Leu 7,3% TÀI LIỆU THAM KHẢO Gollan JL (1998) “Wilson disease in 1998: genetic, diagnostic and therapeutic aspects” J Hepatol, 28:28-36 Ferenci P, et al (2006) "Regional distribution of mutations of the ATP7B giene in patients with Wilson disease: impact on gienetic testing" Hum Gienet, 120:151-159 Maier T, Ferenci R, Polli C, et al (1997) “Detection of the Hisl069Glu mutation in Wilson disease by rapid polymerase chain reaction” Ann Intern Med., 127:21-26 Hoàng Lê Phúc cộng (2012) “Nghiên cúu phát đột biến exon gen ATP7B bệnh nhân Wilson Việt Nam” Y Học Thành Phố Hồ Chí Minh, 16(4):1-4 Wan L, Tsai CH, Hsu CM, et al (2006) “Mutation analysis of Taiwanese Wilson disease patients” Biochemical and Bio-physical Research Communication, 345:734-738 Đỗ Thanh Hương (2007) Nghiên cứu đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng bước đầu phát đột biến gen bệnh Wilson Luận Văn Bác sĩ Nội Trú, Đại Học Y khoa Hà Nội Ngày nhận báo: 04/04/2021 Ngày nhận phản biện nhận xét báo: 05/05/2021 Ngày báo đăng: 25/05/2021 Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Bệnh Viện Chợ Rẫy 91 ... dạng đột biến toàn 21 exon gen ATP7B tỉ lệ đột biến bệnh nhân Wilson người lớn ĐỐI TƢỢNG- PHƢƠNG PHÁP NGHIÊNCỨU Đối tƣợng nghiên cứu Các bệnh nhân chẩn đoán bệnh Wilson bệnh viện Chợ Rẫy từ 9/2015... thần kinh (Bảng 2) Đột biến gen ATP7B Bảng 3: Số lượng đột biến gen bệnh nhân Số lượng đột biến gen Tổng Số BN 26 28 56 Tỷ lệ (%) 3,6 46,4 50,0 100,0 Bảng 4: Đột biến gen Đột biến gen ala 1231 thr... Kết nghiên cứu phù hợp so với số tác giả khác Năm 2012, Hoàng Lê Phúc cộng sự(4) thực đề tài ? ?Nghiên cứu phát đột biến exon gen ATP7B bệnh nhân Wilson Việt Nam” Nghiên cứu thực 15 bệnh nhân Wilson