Gen APC (tumor - supresor adenomatous polyposis coli gene) là một gen ức chế khối u có 15 exon nằm tại vị trí 5q21-q22, mã hóa protein gồm 2843 acid amin. Các đột biến dòng mầm gây mất chức năng của protein APC làm β-catenin tích tụ trong tế bào và đi vào nhân, kích hoạt yếu tố phiên mã hoạt động, kích thích sự tăng sinh mất kiểm soát của tế bào dẫn đến ung thư.
Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 19 * Số * 2015 Nghiên cứu Y học XÂY DỰNG QUY TRÌNH GIẢI TRÌNH TỰ cDNA GEN APC Đồn Nam Khánh*, Lê Minh Khơi**, Nguyễn Thị Băng Sương** TÓM TẮT Giới thiệu: Gen APC (tumor - supresor adenomatous polyposis coli gene) gen ức chế khối u có 15 exon nằm vị trí 5q21-q22, mã hóa protein gồm 2843 acid amin Các đột biến dòng mầm gây chức protein APC làm β-catenin tích tụ tế bào vào nhân, kích hoạt yếu tố phiên mã hoạt động, kích thích tăng sinh kiểm soát tế bào dẫn đến ung thư Mục tiêu: Xây dựng quy trình giải trình tự cDNA gen APC Đối tượng phương pháp: RNA tổng số tách chiết chloroform, isopropanol có bổ sung isogen tổng hợp thành cDNA phương pháp MMLV – RT Sử dụng 10 cặp mồi để khuếch đại 15 exon gen APC giải trình tự máy tự động Kết phân tích phần mềm chuyên dụng Kết quả: Xây dựng thành công quy trình giải trình tự cDNA gen APC với nhiệt độ bắt cặp tối ưu 61oC, độ nhạy quy trình ng/ μL Sản phẩm giải trình tự tương đồng với trình tự gen APC Kết luận: Xây dựng thành cơng quy trình giải trình tự cDNA gen APC Từ khóa: Gen APC, khuếch đại gen, quy trình giải trình tự ABSTRACT ESTABLISH THE PROTOCOL FOR AMPLIFICATION AND SEQUENCING OF APC GENE Doan Nam Khanh, Le Minh Khoi, Nguyen Thi Bang Suong * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Supplement of Vol 19 - No - 2015: 189 - 193 Introduction: APC (adenomatous polyposis coli) is a tumor suppressor gene It contains 15 exons located at 5q21-q22 The 2843 amino-acid APC protein plays an important role in regulating the Beta-catein growth signal factor Mutations in APC gene make Beta-catenin accumulate and translocate from the cytoplasm to the nucleus, where it might serve as a transcriptional factor to stimulate tumour formation Aim: Establish the protocol for sequencing cDNA APC gene Materials and Methods: RNA was extracted by chloroform, isopropanol anh isogen cDNA synthesized using MMLV –RT method Fifteen exons of APC gene were ampliflied and sequenced using 10 pairs of primer and ABI system, respectively Results were analysed with professsional software Results: PCR for amplifying 15 exons of APC gene was optimized with annealing temperature at 61oC and the method has sensitivity of ng /μL Sequenced products are identical to standard sequence database of APC gene from NCBI genbank Conclusion: We have successfully established the protocol for amplifying and identifying all sequences of APC gene Key words: APC gene, RT-PCR, sequencing protocol ĐẶT VẤN ĐỀ Gen APC (adenomatous polyposis coli gene) gen ức chế khối u có tổng cộng 15 exon nằm vị trí 5q21-q22, exon 15 có kích thước lớn, bao gồm 6574 bp (base pair), chiếm 75% trình tự mã hóa protein * Khoa Sinh học, Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia TP Hồ Chí Minh ** Đại học Y Dược Tp Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: PGS.TS Nguyễn Thị Băng Sương ĐT: 0913281386 Email: suongnguyenmd@gmail.com Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học 189 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 19 * Số * 2015 Sản phẩm dịch mã gen protein APC, gồm 2843 acid amin, kích thước khoảng 310 kDa Protein APC tham gia vào phức hợp phân hủy β-catenin Các đột biến dòng mầm làm chức protein APC làm βcatenin tích tụ tế bào vào nhân, kích hoạt yếu tố phiên mã TCF/LEF hoạt động, kích thích tăng sinh kiểm soát tế bào dẫn đến ung thư5,1,4 Người mang gen APC bị đột biến mắc bệnh đa polyp tuyến gia đình (hereditary familial adenomatous polyposis: FAP) – bệnh di truyền với biểu lâm sàng xuất hàng trăm đến hàng ngàn polyp đại trực tràng, không điều trị 100% bệnh nhân bị ung thư đại trực tràng Bên cạnh nguy ung thư đại trực tràng, bệnh làm gia tăng nguy mắc nhiều loại ung thư khác ung thư dày, tá tràng, ung thư nguyên bào gan, ung thư tụy, ung thư tuyến giáp Các nghiên cứu giới tìm thấy khoảng 1000 đột biến khác gene APC gây bệnh FAP Đa số đột biến điểm nằm rải rác toàn chiều dài gene APC(3,7 Do đó, muốn xác định đột biến gen APC mức độ DNA, cần phải thiết kế 37 cặp mồi Việc gây tốn tài lẫn thời gian Trong đó, chẩn đốn mức độ mRNA cần 10 cặp mồi khuếch đại tồn chiều dài đoạn gene APC Ngoài ra, mức độ mRNA phát đột biến hay chèn tồn exon, khơng bỏ sót đột biến xảy q trình hoàn thiện mRNA Việc phát đột biến gen APC cần thiết để phát điều trị sớm ung thư Đột biến gen APC đột biến gen trội di truyền nên người nhà bệnh nhân bị đột biến gen APC cần xét nghiệm kiểm tra có bị đột biến gen hay khơng để phòng tránh nguy ung thư thực tư vấn di truyền nhằm hạn chế lan truyền gen đột biến cộng đồng Hiện nay, Việt Nam, chưa có quy trình giải trình tự cDNA gen APC Do chúng tơi 190 tiến hành nghiên cứu xây dựng quy trình giải trình tự gen ĐỐI TƯỢNG-PHƯƠNGPHÁP NGHIÊNCỨU Đối tượng nghiên cứu Trong nghiên cứu này, chúng tơi tiến hành giải trình tự cDNA gen APC 10 người bình thường khỏe mạnh Nội soi đại trực tràng không phát polyp Phương pháp nghiên cứu Tách chiết RNA tổng số từ mẫu máu Máu ngoại vi thu nhận giữ ống chống đơng EDTA ly trích vòng 24 Sử dụng quy trình tách chiết RNA tổng số chloroform, isopropanol có bổ sung isogen nhằm tách chiết mRNA có chất lượng tốt Tiến hành kiểm tra sản phẩm thu phương pháp điện di gel agarose 0,8%, đo nồng độ độ tinh máy NanoDrop 2000 Kĩ thuật tổng hợp cDNA từ RNA tổng số Sản phẩm RNA toàn phần sau tách chiết tiến hành phản ứng RT-PCR tạo cDNA phương pháp MMLV –RT Sản phẩm cDNA sau kiểm tra cách thực phản ứng PCR với cặp mồi gen GADPH Phản ứng PCR khuếch đại exon Các điều kiện cần tối ưu hóa là: nhiệt độ lai, lượng mẫu/phản ứng để đạt kết nhân tốt Kỹ thuật giải trình tự gen phân tích kết Sản phẩm PCR tinh sạchvà giải trình tự đoạn gen khuếch đại Kết giải trình tự phân tích phần mềm CLC Main Workbench v5.5 KẾT QUẢ Kết tách chiết RNA tổng số kiểm tra chất lượng cDNA Nhận xét: điện di kiểm tra RNA tổng số tách chiết gel agarose 0,8%, thấy rõ vạch sáng 28S rRNA 18S rRNA tương đương Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 19 * Số * 2015 với vạch 5kb 2kb thang Kết tỷ số A260/A280 mẫu khoảng 2,0 – 2,1 chứng tỏ chất lượng RNA tổng số tách kit PAXgene Blood RNA Tubes đạt yêu cầu cho thí nghiệm Khi sử dụng cặp mồi GADPH F/R để kiểm tra chất lượng cDNA tổng hợp Ta nhận thấy mẫu cDNA dùng làm khuôn mẫu cho phản ứng cho sản phẩm khuếch đại kích thước 350 bp Băng sản phẩm GADPH sáng rõ chứng tỏ cDNA tổng hợp tốt đảm bảo sử dụng làm khn mẫu cho sản phẩm PCR giải trình tự (Hình 1) Nghiên cứu Y học Ở hai nhiệt độ bắt cặp 55 58oC có băng sản phẩm kí sinh amplicon Từ 61oC khơng sản phẩm kí sinh nhiệt độ 63 oC trở lên độ sáng băng sản phẩm giảm rõ rệt tất mồi chứng tỏ lượng sản phẩm khuếch đại thấp Chúng lựa chọn nhiệt độ bắt cặp 61oC nhiệt độ tối ưu đảm bảo độ đặc hiệu tất mồi phản ứng PCR, đồng thời đạt lượng sản phẩm PCR cao (Hình 2) Hình 1: Kết điện di RNA tách chiết kiểm tra chất lượng cDNA mồi GADPH 1A: Giếng T: Thang Kb DNA; Giếng 1-3: Các mẫu RNA tách chiết 1B: Giếng T: Thang Kb Plus DNA; Giếng 1-5: Sản phẩm PCR gen GADPH Kết khảo sát nhiệt độ bắt cặp Chúng khảo sát nhiệt độ bắt cặp 55oC, 58oC, 61oC, 63oC với số điều kiện sau: - Các thành phần phản ứng bao gồm: 1µl mồi xi 10pmol, 1µl mồi ngược 10pmol, 2µl đệm PCR 10X, 2µl dNTP 2,5 mM, TakaraTaq 0,5U, cDNA genome mẫu 5µl tổng thể tích 20 µl - Chu trình nhiệt: Biến tính 94oC phút, sau 35-40 chu kỳ gồm 94oC 10 giây; 55oC/ 58oC/61oC/63oC 30 giây; 72oC phút, giai đoạn kết thúc gồm 72oC phút Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học Hình 2: Kết khảo sát nhiệt độ bắt cặp Giếng T: Thang Kb Plus DNA; Giếng (-): Chứng âm; Giếng 1: Nhiệt độ 55oC; Giếng 2: Nhiệt độ 58oC; Giếng 3: Nhiệt độ 61oC; Giếng 4: Nhiệt độ 63oC Kết khảo sát độ nhạy phản ứng PCR Để khảo sát độ nhạy quy trình chúng tơi sử dụng nồng độ cDNA mẫu sau 1,5,10,30,50,80,100ng/µl tiến hành phản ứng PCR với nhiệt độ bắt cặp 61oC Từ giếng bắt đầu xuất băng sản phẩm mục tiêu băng sản phẩm sáng rõ nét giếng 7, điều chứng tỏ ngưỡng cDNA mẫu mà quy trình khuếch đại 5ng/µl (Hình 3) 191 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 19 * Số * 2015 Hình 3: Kết khảo sát độ nhạy phản ứng Giếng T: Thang Kb Plus DNA; Giếng (-): Chứng âm; Giếng 1: Nồng độ ng/μl; Giếng 2: Nồng độ ng/μl; Giếng 3: Nồng độ 10 ng/μl; Giếng 4: Nồng độ 30 ng/μl;Giếng 5: Nồng độ 50 ng/μl; Giếng 6: Nồng độ 80 ng/μl; Giếng 7: Nồng độ 100 ng/μl; Kết PCR exon Chúng tiến hành thực phản ứng PCR với 10 cặp mồi khuếch đại 15 exon gen APC với nhiệt độ bắt cặp 61oC 10 băng sản phẩm PCR sáng rõ nét chứng tỏ quy trình PCR khuếch đại exon tốt, sử dụng sản phẩm PCR để tiến hành giải trình tự (Hình 4) Hình 4: Kết PCR exon Giếng T: Thang Kb Plus DNA; Giếng (-): Chứng âm; Giếng 1-10: Sản phẩm PCR 15 exon Kết giải trình tự Sau có sản phẩm PCR, chúng tơi tiến hành tinh giải trình tự Kết giải trình tự phân tích phần mềm CLC Main Workbench v5.5 Kết giải trình tự trình tự gen APC từ sở liệu NCBI có độ tương đồng 100%, chứng tỏ xây dựng thành công quy trình giải trình tự gen APC (Hình 5) Hình Kết giải trình tự amplicon thuộc exon 15 gen APC thể, phổ biến bệnh ung thư BÀN LUẬN đường tiêu hóa(1,4,6) Các nghiên cứu đột biến APC gen ức chế khối u, gồm15 exon, gen APC tìm 1000 đột biến công sản phẩm dịch mã dài 2843 acid amin(1,2,4) Đột bố sở liệu Leiden Open Variations biến dòng mầm gene làm chức Database (http://www.LOVD.nl) Hầu hết protein APC, dẫn đến bệnh liên quan 192 Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 19 * Số * 2015 đột biến đột biến điểm nên giải trình tự phương pháp hiệu để phát hiệu đột biến gen APC(5) Trong nghiên cứu này, thiết kế 10 cặp mồi đặc hiệu để khuếch đại toàn 15 exon gen APC Các mồi đảm bảo yêu cầu thơng số lý thuyết Trong quy trình giải trình tự cDNA bước tách chiết RNA tổng hợp cDNA khâu quan trọng Khi sử dụng quy trình tách chiết RNA tổng số thơng thường có bổ sung isogen việc phá vỡ tế bào quy trình MMLV – RT tổng hợp cDNA cho sản phẩm mRNA tách chiết, sản phẩm cDNA có chất lượng cao Bên cạnh đó, nhiệt độ bắt cặp thông số vô quan trọng cho phản ứng PCR Vì chúng tơi tiến hành thử nghiệm nhiệt độ bắt cặp theo dải nhiệt độ từ 55 đến 63oC, kết lựa chọn nhiệt độ bắt cặp tối ưu 61oC đảm bảo yêu cầu độ đặc hiệu phản ứng PCR lượng sản phẩm khuếch đại Chúng tiến hành khảo sát độ nhạy quy trình, kết PCR cho thấy quy trình chúng tơi có độ nhạy cao, thực với nồng cDNA từ 5ng/µl trở lên Khi so sánh kết sản phẩm giải trình tự với trình tự gen APC lấy từ sở liệu NCBI, kết trình tự hồn tồn tương đồng với Điều khẳng định quy trình giải trình tự cDNA gen APC xây dựng thành công Với quy trình xây dựng được, chúng tơi thực bước nghiên cứu để tìm kiếm phân tích đột biến gen APC người Việt Nam KẾT LUẬN Chúng xây dựng thành cơng quy trình giải trình tự cDNA gen APC.Từ ứng dụng phát đột biến gen APC bệnh nhân Việt Nam Đây bước quan trọng khơng chẩn đốn mà tầm sốt đối tượng có yếu tố nguy cao TÀI LIỆU THAM KHẢO Benchabane H, Ahmed Y (2009), “The adenomatous polyposis coli tumor suppressor and Wnt signaling in the regulation of apoptosis”, Adv Exp Med Biol, 656:75-84 Half E, Bercovich D and Rozen P (2009), “Familial adenomatous polyposis”, Orphanet J Rare Dis, 4: 22 Laurent-Puig P, Béroud C, Soussi T (1998), “APC gene: database of germline and somatic mutations in human tumors and cell lines”, Nucleic Acids Res, 26:269–270 Leppert M, Dobbs M, Scambler P, O’Connell P, NakamuraY, Stauffer D, Woodward S, Burt R, Hughes J, Gardner E (1987), “The gene for familial polyposis coli maps to the long arm of chromosome 5”, Science, 238(4832):1411-3 Plawski A, Slomski R (2009), “APC gene mutations causing familial adenomatous polyposis in Polish patients”, J Appl Genet, 49(4): 407–414 Powell SM., Zilz N, Beazer-Barclay Y, Bryan TM, Hamilton SR, Thibodeau SN, Vogelstein B, Kinzler KW (1992), “APC mutations occur early during colorectal tumorigenesis”, Nature, 359: 235-237 Yang J, Zhang W, Evans PM, Chen X, He X, Liu C (2006), “Adenomatous polyposis coli (APC) differentially regulates beta-catenin phosphorylation and ubiquitination in colon cancer cells”, J Biol Chem, 281: 17751-17757 Ngày nhận báo: 17/8/2015 Ngày phản biện nhận xét báo: 16/9/2015 Ngày báo đăng: Chuyên Đề Điều Dưỡng Kỹ Thuật Y Học Nghiên cứu Y học 20/10/2015 193 ... hạn chế lan truyền gen đột biến cộng đồng Hiện nay, Việt Nam, chưa có quy trình giải trình tự cDNA gen APC Do chúng tơi 190 tiến hành nghiên cứu xây dựng quy trình giải trình tự gen ĐỐI TƯỢNG-PHƯƠNGPHÁP... 15 exon Kết giải trình tự Sau có sản phẩm PCR, chúng tơi tiến hành tinh giải trình tự Kết giải trình tự phân tích phần mềm CLC Main Workbench v5.5 Kết giải trình tự trình tự gen APC từ sở liệu... lấy từ sở liệu NCBI, kết trình tự hồn toàn tương đồng với Điều khẳng định quy trình giải trình tự cDNA gen APC chúng tơi xây dựng thành cơng Với quy trình xây dựng được, chúng tơi thực bước nghiên