Đa hình di truyền trên gen CRHR1 và FCER2 có ảnh hưởng đáng kể đến đáp ứng thuốc corticoid trong điều trị hen phế quản. Tuy nhiên chưa có nghiên cứu nào mô tà mối liên hệ giữa kiểu gen và khả năng đáp ứng thuốc corticoid ở bệnh nhân nhi hen phế quản Việt Nam. Đề tài nghiên cứu nhằm xây dựng quy trình phân tích kiểu gèn của đa hình rs242941 trên gen CRHR1 và đa hình rs28364072 trên gen FCER2 ở bệnh nhân nhi hen phế quản.
Chemistry Biochemistry and Implications The Royal Society of Chemistry, 2-4 17 Sasaki, J., Lu, c., Machiya, E., Tanahashi, M., Hamada, K (2007) Processed black garlic (Allium Sativum) extracts enhance anti-tumor potency against mouse tumors Medical and Aromatic Piant Science and Biotechnology, 1(2), 278-281 18 Sato, E., Kohno, M., Ha mano, H., Niwano, Y (2006) increased Anti-oxidative Potency of Garlic by Spontaneous Short-term Fermentation Plant Foods for Human Nutrition, 61,157-160 19 Wang, D., Feng, Y Liu, J„ Yan, J., Wang, M„ Sasaki, J., Lu, c (2010) Black Garlic (Allium sativum) Extracts Enhance the Immune System Medicinal and Aromatic Plant Science and Biotechnology, 37-40 20 Wang, X., Jiao, F., Wang, Q w , Wang, J., Yang, K„ Hu, R R., Liu, H c., Wang, H Y., Wang, V s (2012) Aged black garlic extract induces inhibition of gastric cancer cell growth in vitro and in vivo Molecular Medicine Report, 5,66-72 21 Xu, G., Ye, X., Chen, J„ Liu, D (2007) Effect of heat treatment on the phenolic compounds and antioxidant capacity of citrus peel extracts Journal of agricultural Food Chemistry, 55, 330-335 22 Yeh, Y Y., Liu, L (2001) Cholesterol-Lowering Effect of Garlic Extracts and Organosulfur The Journal of Nutrition, 131, 989-993 23 Yiimaz, Y-, & Toledo, R (2005) Antioxidant activity of water-soluble Maillard reaction products Food Chemistry, 93, 273-27 XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÂN TÍCH GEN CRHR1 VÀ FCER2 Ở BỆNH NHÂN NHI HEN PHÉ QUẢN Phạm Thị Hồng Nhung1, Vũ Thị Thơm 1, Đậu Thế Huy1, Nguyễn Thị Thu Hằng2, Đỉnh Đoàn Long , Dương Thị Ly Hương 1Khoa Y Dược, Đ ại học Quốc gia Hà Nọi 2Đ a i h o c D c H N i TĨM TẤT Đặt vấn đề: Đa hình di truyền gen CRHR1 FCER2 có ảnh hưởng đáng kể đến đáp ứng thuốc corticoid điều trị hen phế quản Tuy nhiên chưa có nghiên cứu mô tà mối liên hệ kiểu gen khả đáp ứng thuốc corticóid bệnh nhân nhi hen phế quản Việt Nam Mục tiêu: Xây dựng quy trình phân tích kiểu gèn đa hình rs242941 gen CRHR1 đa hình rs28364072 gen FCER2 bệnh nhân nhi hen phế quản Phương pháp: tách DNA từ máu ngoại vi, khuếch đại gen PCR, xác định kiểu gen bệnh nhân phương pháp giài trình tự PCR-RFLP Kết quả: 40 bệnh nhân nhi hen phế quàn xấc định kiều gen CRHR1 FCER2 Tần số alen đột biến đa hình rs242941 rs28364072 0,10 0,33 Kết luận: chúng tơi xây dựng quy trình xấc định đa hình gen FCER2 sử dụng phương pháp giải trình tự xốc đinh đa hình gen CRHR1 với hai phương pháp song song phương phấp PCR-RFLP va giải trình tự Từ khóa: CRHR1, FCER2, hen phế quản SUMMARY CONSTRUCTION PROCESS TO GENOTYPE THE CRHR1 AND FCER2 GENE VARIATIONS OF PEDIATRIC ASTHMA PATIENTS Pham Thi Hong Nhung1, Vu Thi Thom\ Dau The Huy1, Nguyen Thi Thu Hang2, Dinh Doan Long\ Duong Thi Ly Huong1 School o f Medicine and Pharmacy - Vietnam National University, Hanoi Hanoi University o f Phamacy Background: The genetic variations o f CRHR1 and FCER2 gene have significant influences in response to corticosteroid drugs in the treatment o f asthma However, no study about the relationship between this genotypes and the response to corticosteroid in pediatric asthma Vietnamese Objectives: construction genotyping tests of CRHR1 (rs242941) and FCER2 (rs28364072) polymorphisms on asthma pediatric patients Materials and method: DNA extraction from blood samples, polymerase chain reaction (PCR) amplification o f target genes, Sanger sequencing and PCR-RFLP Results: we have identified the FCER2 and CRHR1 genotype o f 40 patients The fr&quencies o f mutated alleles o f rs242941 and r$28364072 were 0.10 and 0.33, respectively Conclusion: We have established successfully process to identified FCER2 polymorphisms using sequencing and CRHR1 polymorphisms using P C R - RFLP and sequencing Keywords: CRHR1, FCER2, asthma ĐẶT VÁN ĐỀ VÀ MỤC TIÊU Hen phế quản ià bệnh hơ hấp mãn tính, đa nhân tố phổ biến nước ta giới với tĩ íệ gia tăng liên tục trẻ em thời gian qua [3], [4] Corticoid nhóm thuốc sử dụng phổ biến điều trị hen phế quản, nhiên đến 40% bệnh nhân khơng có đáp ứng điều trị với corticosteroid dạng hít [7Ị CRHR1 !à gen mã cho thụ thể kết cặp G-protein liên kết với neuropeptide thuộc họ hormon giải phóng corticotropin CRHR1 liên quan đến việc sản xuất corticosteroid nội sinh dự báo ảnh hưởng đến đáp ứng corticosteroid ngoại sinh Đa hình rs242941 (G> T) gen CRHR1 chứng minh íàm ỉăng đáp ứng với điều trị corticoid dạng hít [6] 537 FCER2 gen mã hóa cho thụ thề gắn với IgE Xác ứịnh kiểu gen CRHR1 FCER2 lực thấp (FcsRII/CD23) có mặt nhiều dịng tế bào Sản phẩm PCR gửi tinh giải trình tự tế bào B, bạch cầu ổơn nhân, đại thực bào [5] Đa - chiều hãng First Base (Malaysia) Tần sổ alen hình rs28364072 (A>G) gen FCER2 SNP tính toán so sánh với tần sổ lý chửng minh có liên quan với việc tăng nguy đợt thuyết theo định luật Hardy-Weinberg sử dụng chikịch phát với bệnh nhân dử dụng corticosteroid square test dạng hít [2] Cảc alen G có liên quan với nồng độ IgE Kiều gen rs242941 phát triển thêm quy tăng cao bệnh nhân hen suyễn trình xác định PCR - RFLP với enzyme giới hạn Trong nghiền cứu này, tiến hành xây SsiỊ (ER1791, Thermo Scientific), đựng quy trình phân tích đa hình CRHR1 KẾT QUẢ FCER2 bệnh nhân nhi hen phế quản, cung cẩp công 1- Tách chiết DNA tổng số từ máu ngoại ví cụ giúp phân tích mối liên quan kiểu gen đáp Tất 40 mẫu máu tách DNA tổng sổ đù ứng thuốc corticosteroid chắt lượng cho thí nghiệm DNA thu ĐÓI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u cho băng sáng rõ điện có nồng độ từ 81 Đối tượng nghiên u 176ụg/ml Mâu máu cua 40 bệnh nhân nhi hen phế quản có Khuếch đại vùng gen quan tâm PCR độ tuổi íừ 6-16 điều trị Bệnh viện Nhi Trung Thành phần phản ứng tổỉ ưu nhân dòng đoạn gen ương Quá trinh thu thập mẫu máu cháp CRHR1 chứa rs242941 gồm mM dNTP, mM thuận gia đỉnh bệnh nhân Hội đồng đạo MgS04, 0.3 pM mồi, 0.05 uỉụỉ Pfu DNA đức thông qua põiymerase Nhiệt độ gắn mồi tối ưu ià 640C Quy Phương pháp nghiên cứu trình đảm bảo độ nhạy với nồng độ DNA khn từ 2.1 Tách ch iế t DNA tổ n g số từ máu toàn phần 500 ụg/pi phản ứng Kết thí nghiệm tối ưu PCR E.Z.N.A blood DNA Mini kit (Omega-Biotek) đưực trình bày hinh sử dụng theo quy írình khuyến cáo hãng Thành phần phản ứng tối ưu nhân dòng đoạn Tối ưu hóa điều kỉện khuếch đại gen PCR gen FCER2 chứa rs28364072 gồm mM dNTP, Sử dụng cặp mồi tự thiết kế, tiến hành tối MgS04, 0.3 mM mòi, 0.05 u/ụl Pfu DNA ưu yeu tố: nhiệt độ gắn mồi, nồng độ mồi, nồng độ polymerase Nhiệt độ gắn mồi tối ưu 560C Quy MgS04 Các thí nghiệm tiến hành mẫu cổ trình đảm bảo độ nhạy với nồng độ DNA khuôn từ nong ổộ DNA khâc nhau: niẫu 17 (nồng độ DNA 177 - 100 pg/pl phản ứng PCR với nồng độ mẫu ng/yí), mẫu 29 (nồng độ DNA 90 ng/pi), mẫu 49 (nồng cao (như mẫu 17) ức chế phàn ứng khuếch đại độ DNA 46 ng/ụí) Đánh giá độ nhạy cua phương pháp gen Kết thỉ nghiệm tối ưu PCR trình bày với dải nồng độ DNA từ - 5Ó0 ng/ụl Sản phẩm PCR Ờ hinh2 điện di gel agarose %, N h iệ t đô g ắ n m i (°C ) A M 62 59 63 64 64.5 B 65 N ô n g đ ộ m ô i (fiM ) 0.9 0.3 0.1 0.9 0.3 0.1 0.9 0.3 M 0.1 i H - bp M ầu 29 M ẫ u 17 N n g độ M g S ( n ỉ ) c M Mẩ u 17 Mầ u 29 N ồn g đ ô D N A (ng/jil) (-) 500 100 50 10 s M ầ u 49 D 01 02 03 (-) M Mầ u 49 Hình Ảnh điện di thí nghiệm tối ưu PCR nhân vùng chứa rs242941 (CRHR1) gel agarose 1% Ảnh A: PCR tối ưu nhiệt độ gắn mồi (Làn M: thang chuẩn DNA100 bp) Ảnh B: PCR tối ưu nồng độ mồi Ảnh C: PCR tối ưu nồng độ MgS04 DNA Ảnh D: PCR với điều kiện tốl ưu với mẫu baỉ kì 538 A B N hiệt độ gắn m ồi (°C) 52 54 5Ố Nồng độ mồi (juM) M 58 59 (-) 0.9 0.3 SiS bp —► M ầu 17 Nồng độ DNA (ng/|il) (-) 500 100 50 10 01 mm M ầu 29 M ẩu 49 Nồng độ M g S (mM) M _ M ầu 17 M lu 29 M ầu 49 Hình Ảnh điện di thí nghiệm tối ưu PCR nhân vùng chứa rs28364072 (FCER2) gel agarose 1%, thang chuẩn DNA 100 bp (iàn M) Ảnh A: PCR tối tru nhiệt độ gắn Ành B: PCR ưu nong độ mồi Ảnh C: PCR tối ưu nông độ MgS04 nồng độ DNA Ành D: PCR VỚI điều kiện tối ưu với mẫu Xác định kiểu gen CRHR1 FCER2 40 bệnh nhân nhí Hình ảnh kết giải trình tự kiểu gen trình bày hình 3-4 sổ tần số alien đột biền CRHR1 FCER2 trình bày bảng Giải trinh tự phân vùng gen FCER2, ngồi rs28364072 chúng tơi xác định thêm 16 SNP khác là: rs 2277994, rs76013233, rs77121754, rs78283814, rs75584211, rs74927160, rs2277995, rs4996972, rs4996973, rs2228138, rs4996975, rs4996976, rs4996977, rs4996978, rs4996979, rs4996980 I-.Z _ A -I -À _ X* 4.1 4.2 4.3 1.1 1.2 1,3 •• — bi’ : = ĩliĩ r „ " r c o c oo ÕI 3Q q ItO oG cG qG gQ g C c II " " ■“ ~ 2J0 ~ĩỉõ cO C q C c ó G ỉ íG G rG G G G G C A SNP Tần sô alien đột biên P-vaỉue M CA) rs242941 0,10 0,49 0,48 rs28364072 0,33 0,03 0,87 RFLP vớí xử lý Ssil 1u ừong 37°c (hình 3) Alen G điện di cho băng kích thừớc 156 225 bp; alen T cho băng kích thước 381 bp Kết phân tích PCR-RFLP với cho kết tương đồng 100% với kết giải trình tự ft m ề ỊẬ m ầ Hỉnh Kết phân tích kiểu gen rs242941 (CRHR1) bệnh nhân mã sổ 01 04 Ảnh A: ảnh điện di sản phẩm PCR-RFLP gel agarose 1.5%, íàn M: 100 bp DNA Ladder, 1-4: san phẩm PCR, 1.1 -1.3 4.1 - 4.3: sàn phẩm cắt với mẫu PCR từ bệnh nhân số 01 (kiểu gen GT) 04 (kiểu gen GG) thời gian ủ tương ứng giờ, Ảnh B: Kết quà gỉài trình tự tương ứng Hình Kết giải trình tự đa hình rs28364072 cùa bệnh nhân có kiều gen AA (hình A), kiểu gen AG (hình B), kiểu gen GG (hỉnh C) 539 BÀN LUẬN Chúng tối xây dựng quy trình xác định kiểu gen CRHR1 FCER2 dựa kĩ thuật PCR-RFLP giải trình tự Sanger Ưu điểm phương pháp giải trinh tự biết tồn trình tự phân đoạn DNA nhân !ên Chính vậy, chúng tơi lựa chọn giải trình tự để xác định đống thời 17 SNP FCER2 Với phương pháp PCR-RFLP, phương pháp đơn giản, nhanh có giá thành rẻ so giải trình tự nên ỉriển khai phòng xét nghiệm, nghiên cứu bàn Với tập hợp mẫu n=40, kiểm định chi-square cho thấy tần số alen phân bố theo định luật Hardy-Weinberg, nhóm mẫu nghiên cứu có tính đại diện cho quần thể bệnh nhân nhi hen phé quàn So sánh với nghiên cứu khác giới, thấy tần số cùa alen đột biến nghiên cứu tương đồng với tần số quần thể khu vực Đơng Á (hình 5) Điều cho thấy gần Châu Phi Châu Mỹ Châu Âu ỊìIìIÌkÉ kìS ị Ị I Đơng Á I Nam Á ị Ị pẩiii&ĩPìị (U ỉ Châu Phi Chân Mỹ Châu Âu Đông Á ViệtNam I Ị Ị j OA 03 gũi khoảng cách địa lý chủng tộc phản ánh tương đổi rõ qua tương đồng mặt di truyền, quần thể thuộc khu vực địa lý có tần số ãlen xắp xỉ Điều đáng ý alen T rs242941 aìen G rs28364072 quần thể người Châu Phi gốc Phi có tỷ lệ cao vượt trội Trong Chương trinh quản íý hen trẻ em, nghiên cứu Kelan cộng cho thấy tăng tần số đa hỉnh di truyền FCER2 giúp iỷ giải tăng tỷ lệ nhập viện liên quan đến hen trẻ em Mỹ gốc Phi [1], Tính đa hinh FCER2 cao cho thấy nghiên cứu di truyền học dược lý liên quan đến SNP người Việt Nam mang lại nhiều ý nghĩa khoa học thực tiễn Việc mở rộng nghiên cứu với số lượng mẫu lởn hơn, đánh giá khả đáp ứng thuốc nhóm kiểu gen cung cấp liệu có giá trị cho nghiên cứu mối liên hệ kiểu gen khả đáp ứng thuốc cá thể, có thề hỗ trợ xây dựng mơ hình tiên iượng đáp ứng corticoid điều trị hen : I o is i 0.9 I Nam Á A Tần sốalen T rs24294Ị-(CRHR!) B Tần số alen G rs28364072 ựCER2) Hình Tần sơ"các alen thuộc gen CRHR1 FCER2 người lìhiếu quân thê’ khác thê giới: Châu Phi, Châu Mỹ, Châu Âu, Đông A, Nam Á [8] Koster s E et al (2011), “FCER2 T2206C variant associated with chronic symptoms and exacerbations in steroid-treated asthmatic children", Allergy, 66, pp 15461552 Masoli M et (2004), “The global burden of asthma: executive summary of the G!NA dissemination committee report”, Allergy, 59, pp 469 - 478 Matthew M et al (2004), "Globa! Burden of Asthma”, Medical Research institute of New Zealand, University of Southampton Tantisira K et al (2007), “FCER2: A pharmacogenetic basis for severe exacerbations in children with asthma”, J Allergy Clinlmmunol, 120, pp 1285-1291 LỜI CẤM ƠN Tantisira K et al (2004), “Corticosteroid Chúng trân trọng cảm ơn tài trợ Đại học pharmacogenetics: association of sequence variants in Quốc gia Hà Nội cho đề tài mã sổ QG.Ĩ4.59 để thực CRHRIwith improved lung function in asthmatics treated nghiên cứu Chúng chân thành cám ơn with inhaled corticosteroids”, Human Molecular Genetics, nhóm nghiên cứu bệnh viện Nhi Trung ương 13(13), pp 1353-1359 cung cấp mẫu máu để thực nghiên cứu Tantisira K.G et al (2011), “Genomewide association between GLCCI1 and response to TÀI LIỆU THAM KHẨO Kelan G et al (2007), “FCER2: A pharmacogeneticglucocorticoid therapy in asthma”, N Engl J Med 365(13), pp 1173-1183 basis for severe exacerbations in children with asthma”, http://www.ensembl.org/Homo_sapiens/ 120, pp 1285-1291 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Chúng xây dựng thành cơng quy trình xác định kiểu gen FCER2 CRHR1 đảm bảo tính xác, độ nhạy độ lặp lại cao Với quy trình này, chúng tơi thu số liệu ban đầu ve phân bố tần số cốc alen kiểu gen thuộc gen CRHR1 FCER2 nhóm bệnh nhân nhi hen phế quản người Việt Nam Chúng tơi kiến nghị sử dụng quy trình phân tích cho nghiên tiếp phân tfch mối liên quan kiểu gen khả đáp ứng thuốc corticoid điều trị hpn trẻ em Việt NarrChỗ trợ nâng cao hiệu điều trị 540 ... cốc alen kiểu gen thuộc gen CRHR1 FCER2 nhóm bệnh nhân nhi hen phế quản người Việt Nam Chúng tơi kiến nghị sử dụng quy trình phân tích cho nghiên tiếp phân tfch mối liên quan kiểu gen khả đáp ứng... Xác định kiểu gen CRHR1 FCER2 40 bệnh nhân nhí Hình ảnh kết giải trình tự kiểu gen trình bày hình 3-4 sổ tần số alien đột biền CRHR1 FCER2 trình bày bảng Giải trinh tự phân vùng gen FCER2, ngồi... Scientific), đựng quy trình phân tích đa hình CRHR1 KẾT QUẢ FCER2 bệnh nhân nhi hen phế quản, cung cẩp công 1- Tách chiết DNA tổng số từ máu ngoại ví cụ giúp phân tích mối liên quan kiểu gen đáp Tất 40 mẫu