Nghiên cứu xây dựng quy trình phân tích định tính và định lượng clenbuterol trong dịch sinh học động vật

1 mục lục Trang B Đặt vấn đề PhÇn I - Tỉng quan 1.1 Giíi thiƯu vỊ Clenbutrol 1.1.1 CÊu t¹o, tÝnh chÊt Clenbuterol 1.1.2 Tác dụng dược lý, độc tính B 1.1.3 Thực trạng tình hình sử dụng Clenbuterol giới Việt Nam 1.2 Một số phương pháp định tính định lượng Clenbuterol 1.2.1 Sắc ký lớp mỏng 1.2.2 Phân tích miễn dịch (ELISA) 1.2.3 Sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) 1.2.4 Sắc ký khí khối phổ (GC-MS) 1.3 Phương pháp chiết Clenbuterol dịch sinh học 16 1.3.1 Phương pháp chiết lỏng - lỏng 16 1.3.2 Phương pháp chiết pha rắn (SPE) 17 1.3.3 Phương pháp vi chiết pha rắn (SPME) 27 1.4 Xử lý số liệu phân tích 28 Phần II - Đối tượng - Nội dung phương pháp nghiên cứu 29 2.1 Thiết bị, hoá chất 29 2.1.1 Thiết bị 29 2.1.2 Dụng cụ, hoá chất 29 2.2 Đối tượng nghiên cứu 30 2.3 Nội dung phương pháp nghiên cứu 30 2.3.1 Phân tích định tính, định lượng CLB-TMS 30 2.3.2 Xây dựng quy trình chiết pha rắn 31 2.3.3 Thẩm định phương pháp 31 2.3.4 Ph©n tÝch CLB mÉu n­íc tiĨu thá thực nghiệm 32 Phần III - Thực nghiệm kết 33 3.1 Xây dựng chương trình phân tích GC-MS 33 3.2 Phân tích định tính 34 3.3 Điều kiện dẫn xuất hoá 37 3.3.1 Nhiệt độ dẫn xuất ho¸ 37 3.3.2 Thêi gian dÉn xuÊt ho¸ 38 3.3.3 Thể tích chất dẫn xuất 39 B 3.3.4 Đánh giá độ ổn định phản ứng chuyển hoá CLB thành CLB-TMS 41 3.4 Xây dựng quy trình chiết pha rắn 42 3.4.1 Lùa chän cét SPE 42 3.4.2 ChuÈn bÞ cột chiết pha rắn SCX 43 3.4.3 Khảo sát điều kiƯn rưa s¹ch t¹p chÊt 43 3.4.4 ThĨ tÝch dung môi rửa giải 44 3.4.5 Khảo sát hiệu suất chiết cột SCX 46 3.5 Thẩm định phương pháp 48 3.5.1 Khoảng nồng độ tuyến tính 48 3.5.2 Xác định giới hạn phát phương pháp 49 3.5.3 Xác định giới hạn định lượng phương pháp 52 3.6 Phân tích Clenbuterol mẫu nước tiểu thỏ thực nghiệm 54 3.6.1 Phương pháp lấy mẫu 54 3.6.2 Phân tích kết 55 Phần IV - Kết luận đề xuất 58 Tài liệu tham khảo 60 B B Phô lôc B 4 Danh môc bảng Trang Bảng 3.1: ảnh hưởng nhiệt độ ®Õn diƯn tÝch pic cđa CLB - TMS 37 Bảng 3.2: ảnh hưởng nhiệt độ thời gian thực phản ứng đến diện tích pic CLB - TMS 39 B¶ng 3.3: ¶nh h­ëng cđa thĨ tÝch MSTFA ®Õn diƯn tÝch pic cđa CLB - TMS 40 Bảng 3.4 Độ ổn định phản ứng dẫn xuất hoá CLB 41 Bảng 3.5 Sự phụ thuộc lượng dung môi rửa với khả rửa trôi CLB 44 Bảng 3.6 Độ thu hồi CLB theo phân đoạn thể tích dung môi rửa giải 45 Bảng 3.7 Độ thu hồi CLB cột chiết pha rắn SCX 46 Bảng 3.8.Mối quan hệ nồng độ vµ diƯn tÝch pic cđa CLB - TMS 48 Bảng 3.9 Kết khảo sát giới hạn định lượng 52 B¶ng 3.10 Kết phân tích CLB nước tiểu thỏ theo tõng ngµy víi liỊu ng 0,8 µg/kg 55 B¶ng 3.11 Kết phân tích CLB nước tiểu thá theo tõng ngµy víi liỊu ng 3,2 µg/kg 57 Danh mục hình Hình 1.1 Sơ đồ thiết bị sắc kí khí Hình 1.2 Các bước tiến hành trình chiết pha rắn 26 Hình 3.1 Các ion nhận dạng CLB - TMS 34 H×nh 3.2 Sắc kí đồ khối phổi CLB - TMS chuẩn 35 Hình 3.3 Sắc kí đồ khối phổi CLB - TMS, sản phẩm thu từ thực nghiệm 36 Hình 3.4 Mối liên hệ nhiệt độ diện tÝch pic 38 H×nh 3.5 Mối liên hệ thời gian phản ứng diện tÝch pic 38 H×nh 3.6 Mèi quan hệ thể tích MSTFA diện tích pic 41 H×nh 3.7 Phỉ khèi cđa CLB - TMS d¹ng SIM 42 H×nh 3.8 Quy tr×nh chiÕt CLB tõ n­íc tiểu thỏ cho phân tích GC - MS 47 Hình 3.9 Mối quan hệ nồng độ CLB diƯn tÝch pic CLB - TMS 49 H×nh 3.10 Sắc kí đồ CLB - TMS giới hạn phát 51 Hình 3.11 Sắc kí đồ CLB - TMS giới hạn định lượng 53 Các ký hiệu chữ viết tắt CLB Clenbuterol CLB - TMS Clenbuterol trimetylsily1 FAO Tổ chức Nông nghiệp Lương thực liên hiệp quốc GC Sắc ký khí GC - MS S¾c ký khÝ khèi phỉ HPLC S¾c ký láng hiƯu cao IOC Tổ chức Olympic giới LLE Chiết lỏng - lỏng LOD Giới hạn phát LOQ Giới hạn định lượng MSTFA N - methyl - N - (Trimethylsily1) Trifluoroacetamid RSD Độ lệch chuẩn tương đối SPE Chiết pha r¾n SPME Vi chiÕt pha r¾n WHO Tỉ chøc Y tế giới đặt vấn đề Thể thao mang tính chất lành mạnh, mục đích hoạt động thể thao đem lại hiểu biết lẫn nhau, xích lại gần hơn, cao hợp tác, hoà bình hữu nghị Tuy nhiên, thực tế có việc đáng tiếc xảy ra, số vận động viên chạy theo thành tích bất chấp sức khoẻ thân, bất chấp điều luật cấm thể thao, sử dụng loại chất bị cấm : chất kích thích, giảm đau, thuốc tăng đồng hoá, thuốc lợi tiểu, hocmonpeptid dẫn chất tương tự, gọi chung chất doping Trước tình hình đó, việc tổ chức kiểm tra, kiểm soát phân tích chất doping lạm dụng thể thao phát triển mạnh mẽ toàn giới Tại Việt Nam chưa có công trình công bố nghiên cứu xây dựng qui trình chiết tách xác định chất doping Hiện tại, Việt Nam cần thiết có công trình nghiên cứu để xác định chất doping phục vụ cho hoạt động thể thao C¸c chÊt doping cã rÊt nhiỊu, nh­ng nhãm thc tăng đồng hoá sử dụng nhiều nhất, clenbuterol đại diện điển hình nhóm Không lĩnh vực thể thao mà lĩnh vực chăn nuôi Clenbuterol Tổ chức Nông nghiệp Lương thực Liên Hợp Quốc (FAO) Bộ Nông nghiệp Phát triển Nông thôn Việt Nam cấm đưa clenbuterol vào thức ăn gia súc clenbuterol có tác hại đến sức khoẻ người Theo Phã ViƯn tr­ëng ViƯn Khoa häc Kü tht N«ng NghiƯp Miền nam: Trong 428 mẫu thức ăn gia súc, có ®Õn 47 mÉu d­¬ng tÝnh víi chÊt thc nhãm β – agonist, phỉ biÕn nhÊt lµ Clenbuterol” [5], [8], [13], [29] Xuất phát từ thực tế nói chọn đề tài Nghiên cứu xây dựng quy trình phân tích định tính định lượng clenbuterol dịch sinh học động vật" nhằm bước đầu cung cấp liệu thực nghiệm phục vụ công tác giám định doping kiểm nghiệm thực phẩm Để đạt mục tiêu nội dung luận văn thực gồm: Xây dựng quy trình chiết pha rắn clenbuterol mẫu nước tiểu Xây dựng chương trình phân tích clenbuterol sắc kí khí khối phổ Định l­ỵng clenbuterol n­íc tiĨu thá thùc nghiƯm cho ng clenbuterol PhÇn i Tỉng quan 1.1 Giíi thiƯu Clenbuterol 1.1.1 Cấu tạo, tính chất Clenbuterol - Công thøc cÊu t¹o: CH3 CH – CH2 – NH – C CH3 OH CH3 - Công thức phân tử: C12H18Cl2N2O (277,2) - Tªn khoa häc: Alcol 4- amino – 3,5 dichloro - α - [(tert – butylamino) methyl] benzylic - TÝnh chÊt vËt lý Clenbuterol.HCl: Lµ bét kÕt tinh không màu, nhiệt độ nóng chảy 1740 C175,50C, tan tốt n­íc, methanol, ethanol tan Ýt cloroform hÇu nh­ không tan benzen - Tính chất hoá học : Nhìn vào công thức cấu tạo hoá học clenbuterol thấy clenbuterol có phản ứng hoá học đặc trưng : Phản ứng diazo hoá nhóm amin thơm (-NH2), phản ứng tạo este với axit hữu nhóm OH alcol phản ứng -Cl gắn vào nhân thơm Nhóm clor sau vô hoá, tạo tủa AgCl tác dụng víi AgNO3 m«i tr­êng HNO3[4], [21] 10 1.1.2 Tác dụng dược lý, độc tính Clenbuterol loại chÊt thuéc nhãm thuèc kÝch thÝch β – agonist, t¸c dụng tương tự ephedrin mạnh kéo dài hơn, có tác dụng giãn phế quản, tăng hô hấp CLB đươc định dùng cho bệnh: Hen phế quản, viêm phế quản dạng hen mạn, viêm phế quản tràn dịch Trước Việt Nam có lưu hành hai chế phẩm là: Clenasth (Shinpoong) Viên nén thành phần gồm: Ambroxol.HCl 30 mg Clenbuterol.HCl 20àg Siro: 100mL có: Ambroxol.HCl 150 mg Clenbuterol.HCl 100 àg Roxobronic (Hawon Pharm) Dạng viên nén thành phần gồm: Ambroxol.HCl 30 mg Clenbuterol.HCl 20àg Do tác dụng phụ nên Clenbuterol bị cấm sử dụng y học Trong thú y, CLB sử dụng phổ biến để điều trị rối loạn hô hấp dị ứng cho ngựa Thương hiệu Ventifulmin Ingelheime (Đức) sản xuất có mặt khắp nơi Tuy nhiên CLB bị lạm dụng hoạt động thể thao, chăn nuôi Clenbuterol làm tăng khả chuyển hoá tổng hợp protein, giảm tích mỡ (nạc hoá chăn nuôi lợn, bò, gà ) Song clenbuterol lại có tác dụng phụ hại cho sức khoẻ người sau sử dụng ăn phải thực phẩm tồn dư clenbuterol gây tổn hại chức gan, gây rối loạn nhịp tim, tăng huyết áp, phù nề, tuỳ theo thể trạng ng­êi [11], [22] 68 12 Ph¹m Hïng ViƯt (2003) Cơ sở phương pháp sắc ký khí, Nhà xuất khoa học kỹ thuật, Hà Nội 13 Sức khỏe (bản hàng ngày) (2006/06) Phát độc chất thịt heo TiÕng Anh: 14 Adam.A., Gervais, N., Panoyan A., Ong H., Beliveau.L., Ayotte C., Delahaut Ph (1994), “Analyst Detection of Clenbuterol Residues in Hair”, Anal Chem, 119, pp 2663 – 2666 15 Alltech – ViƯn KiĨm nghiƯm – Passco Co.LTD (2002), Solid – Phase Extraction Clean up and Preconcentration 16 Amendola L, Colamonici C, Rossi F (2002), “Determination of clenbuterol in human urine by GC-MS confirmation analysis in antidoping control”, J chromatograr B Analyst Technol Biomed life sci, 773(1), pp 7-16 17 Anthony C Moffat, M David Osselton, Brian Widdop (2004), Cla rke’s Analysis of Drugs and Poisons, Pharmaceutical Press, pp 817 – 819 18 Bidlingmaier M., Wu Z., Strasburger C.J (2002), Doping in Sport – Achallenge to endocrinology, Medical Univerrsity Hospital, Munich 19 Brian A.B (1992), Pratical HPLC methodology and applications, A Wiley – Interscience Publication, John Wiley & Sons, New York 20 Buiarelli F., Cartoni G.P., Amendola L., Botre F (2001),“Sereening and confirmation analyis of anabolic agents in human urine by gas chromatography hybrid mass spectrometry”,Analytica Chimica Acta, 447, pp.75 – 88 69 21 Clarke E.G (1986), Clarke’s Isolation and Indentification of Drugs - 2nd, Edition, The pharaceutical press, pp 817-818 22 Daniel Zalko, Laurent D., Georges B And Jacquues T (1998), "Metabolism of Clenbuterol”, Forensic Sci, 47, pp 211 – 218 23 David W Boulton, J Paul Fawcett (1995), “Determination of salbutamol enantiomers in human plasma and urine by highperformance liquid chromatography”, Journal of Chromatography B, 672, pp 103-109 24.Fernado R., Pilar G., Anabela O., Alexandra A (2001), “Optimization of diphasic dialysis procedure for Clenbuterol residues extracstion in bovine retina and hair” J.Liq Chrom And Rel Technol., 24 (2), pp 251 – 263 25.Haasnoot W., Stouten P., Schilt R, and Hooijerink D (1998), “A fast immuno assay for the screening of β-agonists in hair” Analyst, 123, pp 2707-2710 26.Larry D Brwers (1997), “Analytical advances in detection of performance-enhacing compounds”, Clinical Chemistry, 43, pp 1299-1304 27.Lehnert A F, Harkins J D, Woods W E (2001), “Clenbuterol in horse: Confirmation and quantitation of serum clenbuterol by HPLCMS-MS after oral and intratracheal administration” Journal of analytical toxicology, Volume 25(4), pp 280-287 28.Lin L.A, Tomlinson J.A., Satzger R.D (2003), Detection of clenbuterol in bovine retinal tissue by HPLC with eletrochemical detection J, Chromatogr A, 762, pp 275-280 70 29.Medical and Doping Control Sub – Committee (2003), Doping Control Standard Operating Procedures, SeaGames, Viet Nam 30 Ramos, F.J (2002), "β2-agonists Extraction Procedure for Chromatographies", Analysis J Chromatogr A, 880, pp 69 -83 31 Supelco (1987), The Supelco guide to solid phase extraction, Second Edition, Supelco, Chromatography product 32 Thurman E.M., Mills M.S (1998), Solid phase extraction, Interscience Publication, New York 33 Tihomira Gojmeral, Jelra Plendin et al (2002), “Determination of clenbuterol in pig liver following prolonged administration of growth-promoting dose”, Food Technol Biotechnol 40 (4), pp 343-346 34 Vyncht G, Preece.S, Gaspar P (1996), "Gas and liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry for the multiresidue analysis of β-agonists in biological matrices" Journal of Chromatography A, 750 pp 43 - 49 71 Phụ lục Sắc ký đồ phân tích CLB nông độ 1ng/mL Sắc ký đồ phân tích CLB nông độ 10ng/mL Sắc ký đồ phân tích CLB nông độ 0,1àg/mL Sắc ký đồ phân tích CLB nông độ 0,5àg/mL Sắc ký đồ phân tích CLB nông độ 1àg/mL Sắc ký đồ phân tích nước tiểu thỏ ngày thứ ba dùng CLB liều 0,8àg/kg Sắc ký đồ phân tích nước tiểu thỏ ngày thứ dùng CLB liều 0,8àg/kg Sắc ký đồ phân tích nước tiểu thỏ ngày thứ hai dùng CLB liều 0,8àg/kg Sắc ký đồ phân tích nước tiểu thỏ ngày thứ ba dùng CLB liều 3,2àg/kg 10 Sắc ký đồ phân tích n­íc tiĨu thá ngµy thø nhÊt dïng CLB liỊu 3,2µg/kg 11 Sắc ký đồ phân tích nước tiểu thỏ ngày thø hai dïng CLB liỊu 3,2µg/kg 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 ...2 2.2 Đối tượng nghiên cứu 30 2.3 Nội dung phương pháp nghiên cứu 30 2.3.1 Phân tích định tính, định lượng CLB-TMS 30 2.3.2 Xây dựng quy trình chiết pha rắn 31 2.3.3 Thẩm định phương pháp 31... đề tài Nghiên cứu xây dựng quy trình phân tích định tính định lượng clenbuterol dịch sinh học động vật" nhằm bước đầu cung cấp liệu thực nghiệm phục vụ công tác giám định doping kiểm nghiệm thực... gồm: Xây dựng quy trình chiết pha rắn clenbuterol mẫu nước tiểu Xây dựng chương trình phân tích clenbuterol sắc kí khí khối phổ Định lượng clenbuterol n­íc tiĨu thá thùc nghiƯm cho ng clenbuterol