Bài viết trình bày việc ứng dụng kĩ thuật PCR-RFLP (Restriction Fragment Length Polymosphism-PCR) để xác định kiểu gen CYP2C19*2 và CYP2C19*3 của gen CYP2C19.
Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số * 2016 Nghiên cứu Y học PHÁT HIỆN KIỂU GEN CYP2C19 BẰNG PHƯƠNG PHÁP PCR-RFLP TRÊN MẪU SINH THIẾT DẠ DÀY Ở BỆNH NHÂN NHIỄM HELICOBACTER PYLORI Lương Bắc An*, Vũ Diễm My*, Bùi Hữu Hoàng**, Đỗ Thị Thanh Thủy* Mở đầu: Hiện nay, việc điều trị tiệt trừ H.pylori bệnh lý viêm, loét dày tá tràng gặp nhiều khó khăn đối mặt với nguy thất bại cao nhiều nguyên nhân Một nguyên nhân ức chế toan không tốt dùng thuốc PPI không đủ liều lượng chuyển hố thuốc bị ảnh hưởng kiểu gen CYP2C19 Trong nghiên cứu đề cập tới việc xác định kiểu gen CYP2C19*2 CYP2C19*3 với hy vọng giúp nhà lâm sàng sử dụng thuốc PPI đạt hiệu cao nhằm tối ưu hoá việc tiệt trừ H pylori bệnh nhân viêm dày tá tràng H pylori Mục tiêu: Ứng dụng kĩ thuật PCR-RFLP (Restriction Fragment Length Polymosphism-PCR) để xác định kiểu gen CYP2C19*2 CYP2C19*3 gen CYP2C19 Phương pháp: Nghiên cứu mô tả cắt ngang Mẫu mô sinh thiết thông qua nội soi bệnh nhân chẩn đoán viêm loét dày tá tràng lấy từ bệnh viện Đại học Y Dược Tp.HCM Tách chiết DNA toàn bộ, PCR khuếch đại exon gen CYP2C19, sử dụng enzyme SmaI để phát kiểu gen CYP2C19*2 enzyme BamHI để phát kiểu gen CYP2C19*3 Kiểm chứng kết cách giải trình tự exon gen CYP2C19 Kết quả: Trong tổng số 50 mẫu bệnh nhân nghiên cứu, kiểu gen CYP2C19*1 wild-type 50%, kiểu gen đột biến dị hợp tử gen CYP2C19*1/*2 CYP2C19*1/*3 42% kiểu gen đột biến đồng hợp tử CYP2C19*2/*2 8% Kết luận: Nghiên cứu bước đầu cho thấy kĩ thuật PCR-RFLP xác định kiểu gen CYP2C19 cho kết phù hợp với giải trình tự gen Đây phương pháp đơn giản, nhanh có chi phí phù hợp Việt Nam Góp phần cải thiện tỉ lệ điều trị thành công, giảm tỉ lệ điều trị thất bại giảm tỉ lệ tái phát liên quan đến nhiễm H pylori Từ khóa: PCR-RFLP, CYP2C19*1, CYP2C19*2 CYP2C19*3 ABTRACTS IDENTIFICATION OF CYP2C19 GENOTYPE BY PCR-RFLP IN GASTRIC BIOPSIES FROM PATIENTS INFECTED WITH H.PYLORI Luong Bac An, Vu Diem My, Bui Huu Hoang, Do Thi Thanh Thuy * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Supplement of Vol 20 - No – 2016: 301 - 306 Background: Recently, H.Pylori eradication therapies have encountered many difficulties and a high rate of failure due to several reasons One of theses is an insufficient acid inhibition when using PPI standard dose because PPI metabolism is affected by enzyme that was coded by the highly polymorphic CYP2C19 gene In this study, we mention on how the polymorphism of CYP2C19 gene, particularly CYP2C19*2 and CYP2C19*3 genotypes, induces ineffective PPI dosage in hopes of optimizing treatment outcome for patients with previous treatment failure *Trung tâm Y sinh học phân tử, Đại học Y Dược TP HCM **Bệnh viện Đại học Y Dược Tp HCM Tác giả liên lạc: CN Lương Bắc An ĐT: 0933908241 Email: luongbacan1991@gmail.com hố Hồ Chí Minh, ** Bệnh viện Chợ Rẫy Tiêu Hóa 301 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số * 2016 Objective: Use PCR-RFLP to identify single-nucleotide polymorphism (SNP) of CYP2C19 gene, particularly CYP2C19*2*3 genotypes Method: A cross-sectional study Tissue biopsy samples were obtained from patients with diagnosis of H pylori infection (University Medical Center, Ho Chi Minh City, Vietnam DNA was extracted, PCR was carried out to amplify exon and of CYP2C19 gene, and finally using enzyme SmaI to detect the CYP2C19*2 and another enzyme BamHI to detect the CYP2C19*3 Results: In this study, the frequencies of CYP2C19 is as follow: homozygous CYP2C19*1 wild-type was 50%, mutation heterozygous of CYP2C19*1/*2 and CYP2C19*1/*3 genotypes was 42% and finally, homozygous mutant CYP2C19*2/*2 was 8% Conclusion: Preliminary studies showed that PCR-RFLP in determining the CYP2C19 genotype is matching to sequencing method However, this method is simple, fast and affordable in Vietnam Improving success rate treated, reduce the rate of treatment failure and relapse related to H.pylori infection Key words: PCR-RFLP, CYP2C19*1, CYP2C19*2 and CYP2C19*3 không tuân thủ tốt dùng thuốc không ĐẶT VẤN ĐỀ cách, ức chế toan không tốt dùng thuốc PPI Helicobacter pylori xoắn khuẩn Gram âm, không đủ liều lượng mà ngun hiếu khí, có dạng hình cánh én, có kích thước từ nhân chuyển hố thuốc bị ảnh hưởng kiểu 0,2 đến 0,5µm, di động vi khuẩn sinh gen CYP2C19… PPI thuốc ức chế bơm proton enzyme urease, catalase, protease và thành phần quan trọng điều trị H phospholipase Nhiễm H pylori pylori Ngoài tác dụng giảm tiết acid, PPI làm nhiễm khuẩn mạn tính thường gặp tăng hiệu tác động kháng sinh cách người Ước tính có khoảng 50% dân số giảm phân hủy kháng sinh môi trường giới bị nhiễm H pylori (4), chủ yếu nước dịch vị Enzym quan trọng liên quan đến phát triển chẳng hạn Việt Nam, với tỉ chuyển hóa PPI (ngoại trừ rabeprazole) enzym lệ nhiễm H pylori khoảng 70% người trưởng CYP2C19 Enzyme liên quan đến thành, khoảng 10% bị viêm loét dày tá chuyển hóa nhiều loại thuốc khác thuốc tràng H pylori gây Nhiễm H pylori chông tạo cục máu đông, thuốc chống co giật biết nguyên nhân gây viêm, loét dày Enzym CYP2C19 gen CYP2C19 mã hóa tá tràng ung thư dày Nhiều nghiên cứu Tác động PPI bị ảnh hưởng tính đa hình cho thấy 90% số người bị viêm dày có gen CYP2C19 Trên nhãn thuốc diện vi khuẩn H pylori Tương tự, tỷ lệ esomeprazole (Nexium) FAD công nhận chiếm từ 75 - 85% bệnh loét dày; 95 nêu rõ isoenzym gen CYP2C19 mã hóa thể - 100% bệnh loét tá tràng; biến chứng tính đa hình chuyển hóa thủng loét dày tá tràng diện esomeprazole “ở trạng thái ổn định, tỷ lệ diện loại vi khuẩn chiếm từ 80 - 95% trường hợp tích đường cong (AUC) người có Hiện nay, phác đồ điều trị tiệt trừ H pylori kiểu chuyển hóa thuốc chậm so với người đầu tay bệnh lý viêm, loét dày tá có kiểu chuyển hóa thuốc nhanh 2” tràng bao gồm thuốc ức chế bơm proton (PPI), Những người mang gen CYP2C19 không đột clarithromycin (CAM), amoxicillin (AMX) biến (kiểu gen CYP2C19*1/*1), sản phẩm enzym hay metronidazole Tuy nhiên tỉ lệ thất bại tạo dư thừa chuyển hóa thuốc PPI dùng phác đồ ba thuốc ngày gia mức độ cao (EM = Extensive metabolizers), làm tăng Các yếu tố nguy thất bại biết giảm hiệu kháng tiết acid PPI giới vi khuẩn đề kháng kháng sinh, bệnh nhân hạn hoạt tính sinh học kháng sinh Còn 302 Chuyên Đề Nội Khoa I Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số * 2016 gen CYP2C19 bị đột biến điểm theo kiểu đồng hợp tử hay dị hợp tử kép hai exon (kiểu gen CYP2C19 *2/*2, *3/*3 *2/*3), sản phẩm enzym tạo giảm sút hay khơng có hoạt tính sinh học, làm cho tốc độ chuyển hóa PPI chậm (PM = Poor metabolizers), tăng hiệu kháng tiết acid thuốc, tăng hoạt tính sinh học kháng sinh Nếu gen CYP2C19 bị đột biến điểm theo kiểu dị hợp tử (kiểu gen CYP2C19 *1/*2 *1/*3), lượng enzym sản xuất mức trung bình (IM = Intermediate metabolozers), làm cho chuyển hóa thuốc mức độ trung bình (1) Như vậy, việc điều trị dựa dược di truyền học cho cá thể phụ thuộc vào tính đa hình gen CYP2C19 làm cải thiện tỉ lệ điều trị thành cơng H pylori Chính vậy, biết biến thể gen CYP2C19 trước điều trị H pylori, liệu pháp lựa chọn thuốc PPI liều lượng dùng tiệt trừ H pylori cải thiện giảm tỉ lệ điều trị thất bại giảm tỉ lệ tái phát liên quan đến nhiễm H pylori ĐỐITƯỢNG-PHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU Thiết kế nghiên cứu Mô tả cắt ngang Đối tượng nghiên cứu Khảo sát kiểu gen CYP2C19 50 mẫu sinh thiết qua nội soi từ bệnh nhân chẩn đoán viêm loét dày tá tràng H pylori từ tháng 9-2014 đến tháng 3-2015 bệnh viện Đại học Y Dược Phương pháp nghiên cứu: Ly trích DNA từ mẫu mơ sinh thiết Mẫu mơ thu nhận nghiền nát hồn tồn chày sứ dung dịch PBS Thu 360 ul dung dịch nghiền thêm vào 40ul proteinase K (PK) ủ 56oC qua đêm Tiến hành tách chiết DNA toàn phần kit BOOM theo qui trình nhà sản xuất Tiêu Hóa Nghiên cứu Y học Mồi cho phản ứng Bao gồm hai cặp mồi với độ dài sản phẩm khuếch đại khác nhau, thiết kế nhằm khuếch đại hai exon gen CYP2C19 Trình tự mồi viết theo chiều 5’- 3’ Bảng 1: Mồi sử dụng cho phản ứng PCR-RFLP SNP Primer Trình tự mồi (5’=>3’) CYP2/5F AAATTGTTTCCAATCATTTAGCT CYP2C19*3 CYP2/5R ACTTCAGGGCTTGGTCAATA CYP2/4F CAGAGCTTGGCATATTGTATC CYP2C19*2 CYP2/4R GTAAACACACAACTAGTCAATG PCR khuếch đại exon gen CYP2C19 Sử dụng kit Hot Start Taq Polymerase Takara Tiến hành phản ứng PCR cặp mồi nhằm khuếch đại exon gen CYP2C19 (bảng 1) Chương trình PCR sau: chu kỳ 98oC phút, 40 chu kỳ với chu kỳ gồm bước: 98oC/10 giây, 53oC/20 giây, 72oC/30 giây chu kỳ 72oC phút Sau đó, điện di gel agarose 2% 100V 30 phút để kiểm tra sản phẩm khuếch đại Cắt enzyme xác định SNP CYP2C19*2 CYP2C19*3 gen CYP2C19 Thực phản ứng cắt sản phẩm PCR enzym hạn chế RE (Thermo Scientific) gồm SmaI cho kiểu gen CYP2C19*2 BamHI cho kiểu gen CYP2C19*3 Phản ứng cắt sản phẩm PCR enzyme SmaI 30oC enzyme BamHI 37oC Điện di sản phẩm cắt gel agarose 3% 70V 45 phút để kiểm tra sản phẩm cắt RE Giải trình tự exon gen CYP2C19 Tinh sản phẩm PCR với kit Illustra GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit (GE healthcare), bảo quản sản phẩm tinh nhiệt độ 4oC Giải trình tự exon mồi CYP2/4F exon mồi CYP2/5R hệ thống điện di mao quản 3130 xl với thuốc thử ABI PRISM Big Dye Terminator V3.1 Cycle Sequencing Ready reaction (AB, USA) 303 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số * 2016 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN CYP2C19*2 Sản phẩm PCR có kích thước sau khuếch đại kiểu gen CYP2C19*2 321 bp Trong trường hợp khơng có đột biến c.681 exon 5, CYP2C19 dạng Wt, sản phẩm điện di sau phản ứng cắt SmaI có băng sáng có kích thước 212bp 109bp (CYP2C19*1/*1) Trong trường hợp có đột biến c.681tại exon 5, đột biến CYP2C19*2 G>A, làm vị trí cắt enzym SmaI Do có hai dạng đột biến đột biến dị hợp tử (CYP2C19*1/*2) với sản phẩm điện di sau phản ứng cắt SmaI có băng sáng kích thước 321bp, 212bp 109bp, đột biến đồng hợp tử (CYP2C19*2/*2) sản phẩm điện di sau phản ứng cắt SmaI có băng sáng kích thước 321 bp Hình 1: Sản phẩm sau cắt enzyme phân tách gel Agarose 3% Giếng 1: Thang 1Kb; Giếng 2: CYP2C19*1/*2; Giếng 3: CYP2C19*1/*1; Giếng 4: CYP2C19*2/*2; Giếng 5: CYP2C19*1/*3; Giếng 6: CYP2C19*1/*1 CYP2C19*3 Sản phẩm PCR có kích thước sau khuếch đại kiểu gen CYP2C19*3 271 bp Trong trường hợp đột biến c.636 exon 4, CYP2C19 dạng Wt, sản phẩm điện di sau phản ứng cắt BamHI có băng sáng có kích thước 175bp 96bp (CYP2C19*1/*1) Trong trường hợp có đột biến c.636 exon 4, đột biến CYP2C19*3 G>A, làm vị trí cắt enzym BamHI Do có hai dạng đột biến đột biến dị hợp tử (CYP2C19*1/*3) với sản phẩm điện di sau phản ứng cắt SmaI có băng 304 sáng kích thước 271bp, 175bp 96 bp, đột biến đồng hợp tử (CYP2C19*3/*3) sản phẩm điện di sau phản ứng cắt SmaI có băng sáng kích thước 271bp Tần suất người mang alen CYP2C19 khác chủng tộc người khác CYP2C19*1 dạng wild-type, người mang kiểu alen đồng hợp tử dạng biết người có kiểu gen "chuyển hóa thuốc nhanh" với tần suất người châu Á khoảng 50% CYP2C19*2 CYP2C19*3 kiểu alen đột biến tạo enzym giảm chức hay hoàn toàn chức năng, làm cho thuốc chuyển hóa enzym xảy chậm hay chậm, tần suất alen người châu Á cao so với người châu Âu Người có kiểu alen chức CYP2C19*2 (c.681G>A), chiếm tỉ lệ ~15% người da trắng 29–35% người châu Á (2) Người có kiểu alen chức CYP2C19*3 chiếm tỉ 0,7% người da trắng 10-11% người châu Á Kết nghiên cứu với 50 mẫu sinh thiết cho thấy kiểu alen dạng CYP2C19*1, CYP2C19*2 CYP2C19*3 50%, 48% 2% (bảng 2), cho thấy tần suất kiểu alen dân tộc khác khác Bảng 2: Tỉ lệ % kiểu alen CYP2C19*2*3 Variant allen CYP2C19*1 CYP2C19*2 CYP2C19*3 N 25 24 Tần suất (%) 50 48 Xét exon (bảng 3), tần suất dạng đồng hợp tử (Wt) CYP2C19*2 CYP2C19*3 nghiên cứu 52% 98%, dạng đột biến dị hợp tử gen CYP2C19*1/*2 CYP2C19*1/*3 40% (20/50) 2% (1/50), dạng đột biến đồng hợp tử CYP2C19*2/*2 chiếm 8% (4/40) không thấy xuất đột biến đồng hợp tử CYP2C19*3/*3 Bảng 3: Kết kiểu gen CYP2C19*2*3 (n=50) Kiểu gen Số ca Tỉ lệ (%) CHYP2C19*2 *1/*1 *1/*2 *2/*2 26 20 52 40 CYP2C19*3 *1/*1 *1/*3 *3/*3 49 98 Chuyên Đề Nội Khoa I Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số * 2016 Theo báo cáo tác giả Trần Hòa (Đại học Y Dược TP HCM-2012) nghiên cứu kiểu gen CYP2C19 bệnh nhân bị bệnh mạch vành có điều trị Clopidogrel cho thấy kiểu gen CYP2C19*2 có dạng Wt 45%, đột biến dị hợp tử 46% dạng đột biến đồng hợp tử 9%, Nghiên cứu Y học với CYP2C19*3 có dạng Wt 93%, đột biến dị hợp tử 7% dạng đột biến đồng hợp tử 0% Kết nghiên cứu tương đồng với kết nghiên cứu chúng tôi, thực người Việt Nam Hình 2: Dị hợp đột biến CYP2C19*2 Hình 3: Dị hợp đột biến CYP2C19*3 Hình 4: Đồng hợp đột biến CYP2C19*2 Để khẳng định kết PCR-RFLP, chúng tơi tiến hành giải trình tự trực tiếp 25 trường hợp vùng exon gen CYP2C19 có chứa đột biến quan tâm nhằm kiểm tra độ xác hiệu enzym cắt Kết hiển thị CLC Main Workbench (hình 2, 4) cho thấy tín hiệu nucleotide thể qua đỉnh sóng đều, tín hiệu khơng bị nhiễu có ít, đảm bảo kết phân tích xác, khách quan có độ tin cậy cao Điều Tiêu Hóa chứng tỏ sản phẩm phản ứng PCR giải trình tự có độ tinh cao, khơng bị tạp nhiễm Kết 20 mẫu giải trình exon gen CYP2C19 tương đồng với kết phản ứng PCR-RFLP Điều cho thấy phương pháp PCR-RFLP có độ tin cậy tương đương với giải trình tự gen, nhiên phương pháp đơn giản, thực nhanh chóng chi phí phù hợp Việt Nam Kết từ bảng cho thấy tần suất kiểu gen mã hóa cho enzym CYP2C19 chuyển hóa thuốc nhanh chiếm 50%, chuyển hóa thuốc mức độ 305 Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số * 2016 Nghiên cứu Y học trung bình 42% chuyển hóa thuốc mức độ chậm 8% Tuy kiểu gen chịu trách nhiệm cho chuyển hóa thuốc chậm, gặp CYP2C19 *2/*2, không gặp kiểu gen khác Bảng 3: Tỉ lệ % kiểu gen CYP2C19*2*3 tương ứng với kiểu chuyển hóa thuốc Khả chuyển hóa thuốc Kiểu gen CYP2C19*2*3 Số ca (n=50) Tỷ lệ (%) EM *1/*1 25 50 *1/*2 20 *1/*3 *2/*2 *2/*3 *3/*3 IM PM 42 Kết tương đồngvới nghiên cứu kiểu gen CYP2C19 người Thái nghiên cứu đáp ứng lâm sàng dùng thuốc clopidogrel bệnh nhân có yếu tố nguy huyết khối xơ vữa mạch máu Theo nghiên cứu này, tỉ lệ bệnh nhân có kiểu gen chuyển hóa thuốc nhanh (CYP2C19*1/*1) chiếm 40,72%, kiểu gen chuyển hóa thuốc mức độ trung gian (CYP2C19 *1/*2, *1/*3) 41,95% 13,13% có kiểu gen chuyển hóa thuốc chậm (CYP2C19 *2/*2, *2/*3, *3/*3), kiểu CYP2C19 *2/*2 chiếm 77-83% (3) Tính đa hình gen CYP2C19 cho thấy khác biệt phân bố kiểu chuyển hóa thuốc dân tộc khác nhau, đặc biệt kiểu hình chuyển hóa thuốc chậm Tần suất mang kiểu gen CYP2C19 chuyển hóa thuốc chậm ước tính 2%–5% người da trắng, 4%–8% người châu Phi, 11%–23% người châu Á Nhiều nghiên cứu độc lập cho thấy tần suất kiểu gen CYP2C19 chuyển hóa thuốc chậm cao dân tộc châu Á 18%– 23% Nhật Bản, 15%–17% Trung Quốc 12%–16% Hàn Quốc (3) Trong nghiên cứu chúng tôi, kết kiểu gen CYP2C19 chịu trách nhiệm chuyển hóa thuốc chậm có 8%, số lượng mẫu q ít, nghiên cứu quốc gia khác thường đạt 1000 Biểu gen CYP2C19 ảnh 306 hưởng nhiều tới q trình chuyển hóa thuốc Vì vậy, hiểu rõ yếu tố di truyền ảnh hưởng hoạt động CYP2C19 cần thiết (5,6) KẾT LUẬN Trong nghiên cứu này, thực thành công kĩ thuật PCR-RFLP việc xác định kiểu gen CYP2C19 Ngoài ra, nghiên cứu cho số liệu thông kê ban đầu tỉ lệ kiểu gen CYP2C19 Việt Nam Từ đó, việc điều trị dựa di truyền học cho cá thể phụ thuộc vào tính đa hình gen CYP2C19 làm cải thiện tỉ lệ điều trị thành công, giảm tỉ lệ điều trị thất bại giảm tỉ lệ tái phát liên quan đến nhiễm H pylori Tuy nhiên, với số lượng mẫu ít, nên ý nghĩa thơng kê tỉ lệ kiểu gen CYP2C19 hạn chế, cần mở rộng mơ hình nghiên cứu số lượng mẫu lớn để có tỉ lệ kiểu gen CYP2C19 xác TÀI LIỆU THAM KHẢO Altay C, et al, (2009) “The prevalence of CYP2C19 mutation in Turkish patients with dyspepsia”, Turk J Gastroenterol, 20(3):161 - 164 Burhan M, et al, (2010) “Influence of CYP2C19 functional polymorphism on Helicobacter pylori eradication”, Turk J Gastroenterol, 21(1): 23 - 28 Chonlaphat S, et al, (2013) “CYP2C19 polymorphisms in the Thai population and the clinical response to clopidogrel in patients with atherothrombotic risk factors”, Pharmacogenomics and Personalized Medicine, 6: 85–9 Hunt RH, et al, (2010) “Helicobacter pylori in developing countries”, World Gastroenterology Organisation Global Guidelines, - Lee SJ, (2013) “Clinical application of CYP2C19 pharmacogenetics toward more personalized medicine”, Pharmacogenetics and Pharmacogenomics Volume 3, Article, 318 Ming Fock K, et al, (2009) “Second Asia–Pacific Consensus Guidelines for Helicobacter pylori infection”, Journal of Gastroenterology and Hepatology, 24: 1587–1600 Ngày nhận báo: 27/11/2015 Ngày phản biện nhận xét báo: 30/11/2015 Ngày báo đăng: 15/02/2016: Chuyên Đề Nội Khoa I ... 50 mẫu sinh thiết qua nội soi từ bệnh nhân chẩn đoán viêm loét dày tá tràng H pylori từ tháng 9-2014 đến tháng 3-2015 bệnh viện Đại học Y Dược Phương pháp nghiên cứu: Ly trích DNA từ mẫu mơ sinh. .. nguyên nhân gây viêm, loét dày Enzym CYP2C19 gen CYP2C19 mã hóa tá tràng ung thư dày Nhiều nghiên cứu Tác động PPI bị ảnh hưởng tính đa hình cho thấy 90% số người bị viêm dày có gen CYP2C19 Trên. .. bị tạp nhiễm Kết 20 mẫu giải trình exon gen CYP2C19 tương đồng với kết phản ứng PCR-RFLP Điều cho thấy phương pháp PCR-RFLP có độ tin cậy tương đương với giải trình tự gen, nhiên phương pháp đơn