Định lượng sinensetin đóng vai trò quan trọng trong việc nâng cao chất lượng sản phẩm cao chiết từ Râu mèo. Đề tài được thực hiện nhằm mục tiêu xây dựng quy trình định lượng sinensetin trong cao khô sấy phun Râu mèo bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).
Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số * 2018 Nghiên cứu Y học XÂY DỰNG VÀ THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP HPLC ĐỊNH LƯỢNG SINENSETIN TRONG CAO KHÔ SẤY PHUN RÂU MÈO Nguyễn Thị Thu Thùy*, Huỳnh Trần Quốc Dũng**, Nguyễn Đức Hạnh*, Nguyễn Minh Đức***, Nguyễn Phương Dung**** TÓM TẮT Mở đầu - mục tiêu: Râu mèo dược liệu cổ truyền sử dụng nhiều thuốc với cơng dụng lợi tiểu Sinensetin thành phần có tác dụng sinh học quan trọng Râu mèo, Dược điển Anh 2016 sử dụng làm chất đánh dấu Định lượng sinensetin đóng vai trò quan trọng việc nâng cao chất lượng sản phẩm cao chiết từ Râu mèo Đề tài thực nhằm mục tiêu xây dựng quy trình định lượng sinensetin cao khô sấy phun Râu mèo phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) Đối tượng Phương pháp: Phương pháp HPLC định lượng sinensetin cao khô sấy phun Râu mèo thẩm định theo hướng dẫn ICH với tiêu gồm tính tương tích hệ thống, tính đặc hiệu, tính tuyến tính, độ xác độ Kết quả: Điều kiện HPLC định lượng sinensetin cao khô sấy phun Râu mèo gồm: Cột Thermo Syncronis RP18 (250 × 4,6 mm; μm), bước sóng phát 258 nm, nhiệt độ 30oC, tốc độ dòng ml/phút, thể tích tiêm mẫu 20 μl Pha động gồm acetonitril nước với tỷ lệ acetonitril 42%, 65% khoảng thời gian - 20 phút, 21 - 30 phút Quy trình định lượng đạt tính đặc hiệu, tính tương thích hệ thống, tính tuyến tính (ŷ = 50,53x với R2 = 0,9988), độ xác trung gian (% RSD = 1,51%), độ với tỷ lệ hồi phục khoảng 95,98% - 102,43% Kết luận: Phương pháp định lượng sinensetin cao khô sấy phun Râu mèo thẩm định ứng dụng để xây dựng tiêu định lượng sinensetin cao khơ sấy phun Râu mèo Từ khóa: Sinensetin, HPLC, Râu mèo, thẩm định ABSTRACT DEVELOPMENT AND VALIDATION OF AN HPLC METHOD FOR SINENSETIN ANALYSIS FROM ORTHOSIPHON STAMINEUS SPRAY-DRIED EXTRACT Nguyen Thu Thu Thuy, Huynh Tran Quoc Dung, Nguyen Duc Hanh, Nguyen Minh Duc, Nguyen Phuong Dung * Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Vol 22 - No 5- 2018: 123 - 128 Objectives: Orthosiphon stamineus is a traditional herbal medicine with the well-known diuretic activity Sinensetin, a major bioactive compound of O stamineus, is officially used as a biomarker for O stamineus by British Pharmacopoeia 2016 For quality control of O stamineus extract and its products, it is important to determine sinensetin content This study aimed at developing and validating an HPLC method for sinensetin analysis from O stamineus spray-dried extract Methods: HPLC conditions for sinensetin determination from O stamineus spray-dried extract were screened and the best condition was selected The HPLC analytical method was validated according to the ICH guidelines for its system suitability, specificity, linearity, precision and accuracy Results: The best HPLC condition for sinensetin determination from O stamineus spray-dried extract employed Thermo Syncronis RP18 column (250 × 4.6 mm; μm), a detection wavelength of 258 nm, a column ** Khoa Dược - Đại Học Y Dược TP HCM Bệnh viện Y Học Cổ Truyền TP HCM *** Khoa Dược - Đại Học Tôn Đức Thắng **** Khoa Y Học Cổ Truyền - Đại Học Y Dược TP HCM Tác giả liên lạc: TS Nguyễn Đức Hạnh ĐT: 0913576748 Email: duchanh@ump.edu.vn 123 Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số * 2018 Nghiên cứu Y học temperature of 30oC, a flow rate of ml/min, and an injection volume of 20 μl Mobile phase was mixtures of acetonitrile and water with a gradient program The ratios of acetonitrile were 42% and 65% at – 20 and 21 – 30 min, respectively The specificity and suitability of the analytical method were found to meet the requirement A good correlation between peak areas and sinensetin concentrations was obtained with R2 = 0.9988 The % RSD value of inter-day precision was found to be at 1.51% The HPLC method accuracy met the requirement with recovery percentages of 95.98 – 102.43% Conclusions: An HPLC method for sinensetin determination from O stamineus spray-dried extract successfully developed This method met the requirements of validation and could be useful for improving the quality of O stamineus spray-dried extract and the related products Keywords: Sinensetin, HPLC, Orthosiphon stamineus, Râu mèo, validation ĐẶT VẤN ĐỀ Râu mèo dược liệu cổ truyền sử dụng với tác dụng lợi tiểu Râu mèo sử dụng nhiều thuốc dân gian, đồng thời thành phần quan trọng nhiều chế phẩm Đông dược thị trường dùng điều trị bệnh thận, bàng quang số bệnh khớp(2) Sinensetin (Hình 1) thành phần hóa học quan trọng Râu mèo, Dược điển Anh 2016 sử dụng làm chất đánh dấu để kiểm soát chất lượng cho dược liệu này(1) Việc áp dụng dạng bào chế đại tiêu chuẩn kiểm nghiệm vào sản phẩm từ thiên nhiên xu hướng chung y học cổ truyền nhằm tạo sản phẩm thuận tiện chất lượng phục vụ cho người tiêu dùng Trong đó, cao chiết bán thành phẩm quan trọng trình sản xuất thuốc từ dược liệu, việc đánh giá chất lượng thông qua hàm lượng hoạt chất yếu yếu tố cần thiết, định cho hiệu điều trị sản phẩm cuối OMe OMe MeO O MeO OMe O Hình Công thức cấu tạo sinensetin 124 Nhằm hướng đến mục tiêu bào chế sản phẩm từ Râu mèo với tiêu chuẩn chất lượng đánh giá thông qua hàm lượng hoạt chất sinensetin Nhóm nghiên cứu bước đầu thực đề tài với nội dung “Xây dựng thẩm định quy trình định lượng sinensetin cao khơ sấy phun Râu mèo phương pháp HPLC” ĐỐITƯỢNG-PHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU Đối tượng nguyên liệu Cao khô sấy phun Râu mèo (số lô 0041117) cung cấp PGS.TS Nguyễn Phương Dung Sinensetin chuẩn làm việc (hàm lượng 98,63% tính theo dạng khan) Ban Nghiên Cứu Khoa Học – Thư Viện, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh cung cấp Ethanol (EtOH) đạt tiêu chuẩn phân tích (Merck, Đức) Acetonitril (Scharlau, Tây Ban Nha) nước cất lần đạt tiêu chuẩn dùng cho HPLC Khảo sát điều kiện HPLC định lượng sinensetin cao sấy phun Râu mèo Khảo sát điều kiện HPLC định lượng sinensetin cao sấy phun Râu mèo sử dụng máy HPLC Azura (Knauer, Đức), detector UVD 2,1L (Đức), cột sắc ký Thermo Syncronis RP18 (250 x 4,6 mm; µm) tiền ct HQ 105 C18 (10ì4,6 mm; àm) (Thermo Scientific, Mỹ), nhiệt độ 30oC, bước sóng phát 258 nm, thể tích tiêm mẫu 20 µl Thăm dò số chương trình pha động gồm: chương trình gradient sử dụng hỗn hợp acetonitril - nước làm dung môi Chọn Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số * 2018 điều kiện HPLC cho pic sinensetin tách khỏi pic tạp thông số sắc ký đạt yêu cầu Quy trình định lượng Nghiên cứu Y học a (%): Hàm lượng sinensetin chuẩn Thẩm định quy trình định lượng sinensetin cao khơ sấy phun Râu mèo Mẫu thử Cân xác khoảng 263 mg cao khô sấy phun Râu mèo, cho vào bình định mức ml, thêm khoảng ml EtOH 30%, siêu âm 15 phút, để nguội, bổ sung EtOH 30% đến vạch, lắc đều, lọc qua màng lọc 0,2 µm Thẩm định quy trình định lượng sinensetin cao khô sấy phun Râu mèo theo hướng dẫn ICH(3) tính tương thích hệ thống, tính đặc hiệu, tính tuyến tính, độ xác độ Mẫu chuẩn Dung dịch chuẩn gốc: Cân xác khoảng 1,9 mg chuẩn sinensetin cho vào bình định mức 10 ml, thêm ml ethanol, siêu âm 15 phút, để nguội thêm ethanol đến vạch, lắc Khảo sát điều kiện HPLC định lượng sinensetin cao sấy phun Râu mèo Dung dịch chuẩn (nồng độ sinensetin khoảng 13,6 µg/ml): Cho xác 360 µl dung dịch chuẩn gốc vào bình định mức ml, thêm ethanol đến vạch, lắc lọc qua màng lọc 0,2 µm Bảng Các điều kiện pha động HPLC định lượng sinensetin Điều kiện HPLC Hệ thống HPLC: Knauer Azura đầu dò UV D 2.1L (Đức) Cột sắc ký: Thermo Syncronis RP18 (250 x 4,6 mm; µm) Bước sóng phát hiện: UV 258 nm Chương trình pha động: Dựa kết khảo sát điều kiện Tốc độ dòng: ml/phút Nhiệt độ cột 30oC Thể tích tiêm mẫu: 20 µl Hàm lượng sinensetin (X, µg/g) cao khơ sấy phun Râu mèo tính theo cơng thức: St, Sc: Diện tích pic sinensetin mẫu thử mẫu chuẩn C: Nồng độ dung dịch sinensetin chuẩn (µg/ml) mt: Khối lượng cân cao khô sấy phun Râu mèo KẾT QUẢ Khảo sát điều kiện pha động với tỷ lệ dung mơi acetonitril – nước khác trình bày Bảng Chương trình I II III Thời gian (phút) – 15 16 – 25 – 20 21 – 30 – 20 21 – 30 Tỷ lệ dung môi pha động CH3CN-H2O (tt/tt) 50:50 65:35 46:54 65:35 42-58 65:35 Kết khảo sát điều kiện pha động trình bày Hình Chọn điều kiện pha động III để thẩm định quy trình định lượng Thẩm định quy trình định lượng sinensetin cao sấy phun Râu mèo Tính tương thích hệ thống Bảng Tính tương thích hệ thống phương pháp HPLC định lượng sinensetin mẫu thử (n=6) STT TB SD %RSD tR (phút) S (mAU.s) As Rs 14,7 790,2 1,12 3,5 14,8 786,0 1,10 3,7 14,7 792,5 1,08 3,5 14,7 778,3 1,08 3,3 14,6 800,3 1,12 3,5 14,7 793,9 1,03 3,6 14,7 790,2 1,09 3,5 0,063 7,487 0,8 ≤ As≤ Rs ≥ 1,2 1,5 0,39% 0,60% N 60387 58392 59983 60377 61837 57268 59707 - Kết khảo sát tính tương thích hệ thống phương pháp HPLC định lượng sinensetin 125 Nghiên cứu Y học cao khô sấy phun Râu mèo theo điều kiện sắc ký pha động III trình bày Bảng Thời gian lưu (tR), diện tích pic (S) pic sinensetin nhỏ 2% Hệ số bất đối 0,8 ≤ As ≤ 1,2 Độ phân giải lớn 1,5 Vì vậy, phương pháp HPLC định lượng sinensetin cao khơ sấy phun Râu mèo đạt tính tương thích hệ thống Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số * 2018 Tính đặc hiệu Chuẩn bị mẫu khảo sát tính đặc hiệu gồm: Mẫu trắng (EtOH 30%), mẫu chuẩn (như trên), mẫu thử (như trên), mẫu thử thêm chuẩn (thêm sinensetin chuẩn vào dung dịch mẫu thử) Tiến hành: Sắc ký mẫu theo phương pháp HPLC chọn, kết trình bày Hình Hình Sắc ký đồ HPLC phân tích mẫu thử với điều kiện pha động khác Hình Sắc ký đồ HPLC khảo sát tính đặc hiệu phương pháp định lượng sinensetin cao khô sấy phun Râu mèo: (a) mẫu trắng, (b) mẫu chuẩn, (c) mẫu thử (d) mẫu thử thêm chuẩn 126 Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số * 2018 Mẫu trắng (Hình 3a) không cho pic trùng với thời gian lưu sinensetin mẫu chuẩn (Hình 3b) mẫu thử (Hình 3c) Sắc ký đồ mẫu thử (Hình 3c) cho pic có thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu sinensetin mẫu chuẩn (Hình 3b) Pic sinensetin tách hồn tồn pic khác mẫu chuẩn (Hình 3b) mẫu thử (Hình 3c) Sắc ký đồ mẫu thử thêm chuẩn (Hình 3d) có chiều cao diện tích pic sinensetin tăng lên so với mẫu thử (Hình 3c) Nghiên cứu Y học Kết xử lý thống kê cho thấy giá trị F thực nghiệm lớn giá trị F0,05 nên phương trình hồi quy tương thích Giá trị t hệ số B lớn t0,05 nên hệ số B có ý nghĩa Giá trị t hệ số B0 nhỏ t0,05 nên hệ số B0 khơng có ý nghĩa Vậy, phương trình hồi quy tuyến tính là: ŷ = 50,53x với (R2 = 0,9988) Bảng Kết xử lý thống kê khảo sát tính tuyến tính phương pháp HPLC định sinensetin cao khơ sấy phun Râu mèo R Phương trình hồi quy ŷ = Bx + B0 Hệ số B Giá trị t hệ số B Hệ số B0 Giá trị t hệ số B0 Giá trị F Giá trị F0,05 Giá trị t0,05 Khoảng nồng độ khảo sát (μg/ml) Phổ UV – Vis thời gian lưu sinensetin mẫu thử trùng với phổ UV – Vis thời gian lưu pic tương ứng mẫu chuẩn (Hình 4) 0,9988 ŷ = 50,535x 50,535 57,21 0,1236 0,0034 3273,9 7,71 2,74 3,22 – 66,40 Hình Phổ UV – Vis (a) sinensetin chuẩn (b) sinensetin mẫu thử Sử dụng chức kiểm tra độ tinh khiết pic với đầu dò PDA hệ thống HPLC Water cho thấy pic sinensetin mẫu chuẩn mẫu thử đạt yêu cầu độ tinh khiết pic Vậy, phương pháp HPLC định lượng sinensetin cao khô sấy phun Râu mèo đạt tính đặc hiệu Tính tuyến tính Kết khảo sát tính tuyến tính phương pháp HPLC định lượng sinensetin cao khô sấy phun Râu mèo trình bày Hình Kết khảo sát tính tuyến tính sinensetin xử lý phần mềm Ms – Excel 2010 trắc nghiệm thống kê cho thấy có tương quan tuyến tính diện tích đỉnh nồng độ sinensetin Kết xử lý thống kê trình bày Bảng Hình Tương quan diện tích pic nồng độ sinensetin (n=6) Độ xác Bảng Độ lặp lại độ lặp lại trung gian phương pháp HPLC định lượng sinensetin cao khô sấy phun Râu mèo Hàm lượng sinensetin (μg/g) Giá trị thống kê ngày Ngày Ngày Ngày 297,26 294,49 295,36 289,85 286,62 294,79 295,97 298,02 300,00 301,67 296,31 293,21 TB: 296,88 (μg/g) 300,19 302,09 304,12 SD: 4,49 RSD: 1,51% 294,49 297,03 302,42 TB 296,57 295,76 296,12 SD 4,23 5,15 4,49 RSD 1,43% 1,74% 1,51% STT 127 Nghiên cứu Y học Kết khảo sát độ lặp lại độ lặp lại trung gian phương pháp HPLC định lượng sinensetin cao khô sấy phun Râu mèo trình bày Bảng RSD % ứng với độ lặp lại độ lặp lại trung gian sinensetin 2% Vậy, phương pháp HPLC định lượng sinensetin cao khô Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 22 * Số * 2018 sấy phun Râu mèo đạt yêu cầu độ lặp lại độ lặp lại trung gian Độ Kết khảo sát độ phương pháp HPLC định lượng sinensetin cao khô sấy phun Râu mèo trình bày Bảng Bảng Độ phương pháp định lượng sinensetin cao khô sấy phun Râu mèo (n=9) STT Tỉ lệ chuẩn thêm vào (%) 80 100 120 Lượng sinensetin Lượng Lượng sinensetin mẫu thử sinensetin tìm chuẩn cho vào (μg) (μg) thấy (μg) 78,20 62,48 61,60 78,80 62,48 62,30 76,15 62,48 60,75 78,25 78,10 78,80 77,25 78,10 79,35 76,20 78,10 80,00 78,35 93,72 89,95 76,70 93,72 90,65 77,45 93,72 92,15 TB Tỉ lệ hồi phục (%) Tỉ lệ hồi phục trung bình (%) %RSD 98,51 1,26 101,64 0,76 97,01 1,24 99,05 1,08 98,59 99,71 97,23 100,90 101,60 102,43 95,98 96,72 98,32 BÀN LUẬN KẾT LUẬN Trong thử nghiệm khảo sát điều kiện HPLC định lượng sinensetin cao sấy phun Râu mèo, điều kiện I II, pic sinensetin dính với tạp phân cực, không đạt độ tinh khiết pic Ở điều kiện III, pic sinensetin tách hoàn toàn với tạp khác, thông số pic đạt yêu cầu Do vậy, điều kiện III chọn để tiến hành định lượng sinensetin cao sấy phun Râu mèo Phương pháp HPLC định lượng sinensetin cao khô sấy phun Râu mèo thẩm định tiêu chí theo hướng dẫn ICH Kết thẩm định đạt yêu cầu tính tương thích hệ thống, tính tuyến tính, độ đặc hiệu, độ xác cao (RSD% độ lặp lại trung gian 1,51%), độ với độ phục hồi khoảng 95,98% - 102,43% Vì vậy, phương pháp ứng dụng để định lượng sinensetin mẫu cao sấy phun Râu mèo, hướng tới tiêu chuẩn hóa kiểm nghiệm chất lượng cao Theo yêu cầu ICH, phương pháp HPLC định lượng sinensetin ứng với nồng độ khảo sát đạt yêu cầu độ phục hồi khoảng 90 107%(3) % RSD ≤ 5,3% Kết thẩm định cho thấy, phương pháp kiểm nghiệm đạt yêu cầu độ Như vậy, phương pháp HPLC định lượng sinensetin cao khô sấy phun Râu mèo đạt yêu cầu độ đặc hiệu, tính tuyến tính, độ xác độ ứng dụng để định lượng sinensetin cao khô sấy phun Râu mèo 128 TÀI LIỆU THAM KHẢO Bristish Pharmacopoeia Commisssion (2016) Bristish Pharmacopoeia 2016 The Stationery Office, pp 237-238 Đỗ Huy Bích (2006) Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam tập II NXB Khoa Học Kỹ Thuật, Hà Nội, tr 623-625 International Conference on Hamonization (1997) “Guideline on Validation of Analytical Procedures: Methodology” Fed Regist; 62:27464-27467 Ngày nhận báo: 25/04/2017 Ngày phản biện nhận xét báo: 20/06/2018 Ngày báo đăng: 20/09/2018 ... chọn để tiến hành định lượng sinensetin cao sấy phun Râu mèo Phương pháp HPLC định lượng sinensetin cao khô sấy phun Râu mèo thẩm định tiêu chí theo hướng dẫn ICH Kết thẩm định đạt yêu cầu tính... độ Như vậy, phương pháp HPLC định lượng sinensetin cao khô sấy phun Râu mèo đạt yêu cầu độ đặc hiệu, tính tuyến tính, độ xác độ ứng dụng để định lượng sinensetin cao khô sấy phun Râu mèo 128 TÀI... gian phương pháp HPLC định lượng sinensetin cao khơ sấy phun Râu mèo trình bày Bảng RSD % ứng với độ lặp lại độ lặp lại trung gian sinensetin 2% Vậy, phương pháp HPLC định lượng sinensetin cao khô