Xác định tình trạng alen HLA-B5801 ở bệnh nhân gút (thống phong) bằng real-time PCR

Bài viết trình bày việc hoàn thiện phản ứng real-time PCR và ứng dụng trong việc xác định tình trạng HLA-B5801 ở các bệnh nhân gút trước khi điều trị allopurinol.

Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số * 2016 Nghiên cứu Y học XÁC ĐỊNH TÌNH TRẠNG ALEN HLA-B5801 Ở BỆNH NHÂN GÚT (THỐNG PHONG)BẰNG REAL-TIME PCR Bùi Nguyễn Nhật Minh*, Nguyễn Thị Hà Giang*, Đỗ Thị Thanh Thủy* TÓM TẮT Mở đầu: Bệnh gút (thống phong) bệnh lý viêm khớp xảy acid uric tích tụ nhiều máu, dẫn đến lắng đọng tinh thể muối acid uric urate số tổ chức, đặc biệt màng hoạt dịch khớp, sụn xương, gân, tổ chức da, nhu mô thận đài bể thận khớp Các tinh thể urate gây sỏi thận Allopurinol thuốc điều trị gút phổ biến nhằm làm giảm acid uric máu Tuy nhiên, allopurinol nguyên nhân gây phản ứng mẫn nguy hiểm phát ban tróc vảy, hội chứng Stevens-Johnson (SJS), hoại tử da nhiễm độc (TEN) Các phản ứng dẫn đến tử vong thường gặp bệnh nhân mang alen HLA-B5801 Nghiên cứu xác định tình trạng alen HLA-B5801 bệnh nhân gút trước sử dụng allopurinol nhằm giảm thiểu nguy gặp phải phản ứng mẫn SJS/TEN Mục tiêu: Hoàn thiện phản ứng real-time PCR ứng dụng việc xác định tình trạng HLA-B5801 bệnh nhân gút trước điều trị allopurinol Đối tượng phương pháp: Tiến hành bệnh nhân nghi ngờ bị bệnh gút chẩn đoán dựa vào triệu chứng lâm sàng Thu nhận mẫu máu chứa EDTA, tách chiết DNA từ máu bệnh nhân, thực kỹ thuật real-time PCR, phân tích kết xác định tình trạng HLA-B5801 Kết quả: Trong tổng số 36 mẫu bệnh nhân, bệnh nhân dương tính với HLA-B5801 (5,6%), 34 bệnh nhân lại âm tính (94,4%) Kết luận: Nghiên cứu hồn thiện phản ứng real-time PCR ứng dụng để xác định tình trạng HLA-B5801 Từ khố: Thống phong, Allopurinol, HLA-B5801, real-time PCR ABSTRACT DETERMINATION OF THE HLA-B5801 STATUS IN GOUT PATIENTS BY REAL-TIME PCR Bui Nguyen Nhat Minh, Nguyen Thi Ha Giang, Do Thị Thanh Thuy * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Supplement of Vol 20 - No - 2016: 287 - 290 Introduction: Gout is a monosodium urate crustal deposistion disease Allopurinol is the most common drug used to treat gout However, it might cause the potentially fatal allopurinol hypersensitivity syndrome, which presents with SJS and TEN, to name a few Allopurinol-users with HLA-B5801 tend to have a higher risk of developing SJS/TEN This study focuses on determining HLA-B5801 status in gout patients, which plays an important role in the treatment of gout Objective: To evaluate the determination of HLA-B5801 status in gout patients before treatment with allopurinol using real-time PCR Method: Use Ct values and melting curve analysis of real-time PCR to determine HLA-B5801 status in gout patients Results: Out of the 36 patients tested for HLA-B5801, were positive for HLA-B5801 (5.6%), and 34 were negative (94.4%) * Trung tâm Y sinh học phân tử, Đại học Y Dược Tp HCM Tác giả liên lạc: CN Bùi Nguyễn Nhật Minh ĐT: 01228254201; Tim Mạch Email: minhnnbui@gmail.com 287 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số * 2016 Conclusion: Our research has successfully applied real-time PCR in determining HLA-B5801 status Key words: Gout, Allopurinol, HLA-B5801, real-time PCR ĐẶT VẤN ĐỀ Kháng nguyên bạch cầu người – Human Leukocyte Antigen (HLA) đóng vai trò quan trọng khả nhận diện chất lạ thể hệ miễn dịch(2) Một số HLA nhận dạng có liên quan tới số dạng bệnh phản ứng cụ thể Một số HLA-B5801 phản ứng mẫn nguy hiểm bệnh nhân sử dụng thuốc allopurinol để điều trị bệnh gút(3) Allopurinol loại thuốc ức chế xanthinoxydase, enzyme thối hóa hypoxanthin thành xanthin xanthin thành acid uric làm giảm sinh tổng hợp purine, thuốc sử dụng điều trị tăng acid uric máu cách rộng rãi(3) Tuy nhiên, allopurinol nguyên nhân gây phản ứng mẫn nguy hiểm phát ban tróc vảy, hội chứng Stevens-Johnson (SJS), hoại tử da nhiễm độc (TEN)(9) Nguy tử vong gặp phải phản ứng cao tới 27%(1, 7) Nhiều nghiên cứu cho thấy nguy gặp phải phản ứng mẫn nguy hiểm tăng lên gấp 80-97 lần bệnh nhân mang alen HLA-B5801 so với bệnh nhân khơng có alen này(3, 10) Tần số xuất alen cao nước khu vực Đông Nam Á (68%)(8) Thống kê Đài Loan, Thái Lan, Nhật Bản, Hàn Quốc cho thấy mối liên kết mạnh mẽ bệnh nhân có alen HLA-B5801 tình trạng phản ứng q mẫn, SJS/TEN(3, 5, 6, 11) ĐỐITƯỢNG–PHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU Đối tượng nghiên cứu Bệnh nhân nghi ngờ bị bệnh gút bệnh viện Đại học Y dược từ 1/2015 9/2015 Phương pháp nghiên cứu Nghiên cứu thực Trung tâm Y Sinh học Phân tử - Đại học Y Dược TP.HCM Tách chiết genomic DNA từ mẫu máu: Mẫu máu xử lý vòng 24 Genomic DNA tách chiết Illustra blood genomicPrep Mini Spin kit (GE Healthcare, Anh) theo hướng dẫn nhà sản xuất Quy trình real-time PCR: Thực phản ứng real-time PCR PG5801 Detection Kit (Pharmigene, Inc., Đài Loan) cho mẫu thí nghiệm Một phản ứng khuếch đại alen HLAB5801, phản ứng lại khuếch đại gene chứng nội Phân tích kết real-time PCR Bảng Cách phân tích kết real-time PCR (dựa PG5801 Detection Kit Pharmigene, Inc.) Chứng nội Ct ≤ 27 Chứng nội Ct > 27 Dương tính Ct ≤ Âm tính Ct > Mẫu Ct > 35 Âm tính Phản ứng PCR bị ức chế Chạy lại mẫu Không đủ lượng DNA Mẫu Ct ≤ 35 Kết real-time PCR phân tích sử dụng chương trìnhEppendorf Mastercycler ep realplex (Eppendorf, Đức) dựa vào hai giá trị, chu kỳ ngưỡng (Ct, threshold cycle) nhiệt độ nóng chảy (Tm, melting point) Ct thể số chu kỳ mà sản phẩm khuếch đại phát nhờ thay đổi tín hiệu huỳnh quang Melting point nhiệt độ nóng chảy đoạn DNA 50% lượng DNA bị biến tính Melting point thể độ đặc hiệu phản ứng khuyếch đại dựa vào nhiệt độ nóng chảy đặc hiệu sản phẩm PCR.Mỗi mẫu thí nghiệm cho giá trị Ct, từ alen HLAB5801 từ chứng nội, từ hai giá trị trên, giá trị delta Ct (Ct = CtB5801 – CtChứng nội) Phương pháp phân tích dựa giá trị Ct nêu bảng Thu nhận ml máu chứa chất chống đông EDTA bệnh nhân bị bệnh gút 288 Chuyên Đề Nội Khoa I Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số * 2016 Nghiên cứu Y học KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Đặc điểm nhóm nghiên cứu: Bảng Đặc điểm bệnh nhân nghiên cứu Đặc điểm Tuổi trung bình (phạm vi giao động) Giới Nam/nữ (% nam) HLA-B5801 (+) Tổng (n=36) 45,5(23-78) 35/1 (97,2%) (nam) Kết real-time PCR Để xác định tình trạng HLA-B5801 bệnh nhân, tiến hành real-time PCR sử dụng thuốc nhuộm SYBR Green I Hình cho thấy kết real-time PCR bệnh nhân dương tính HLA-B5801 Hình cho thấy kết melting curve chứng nội mẫu HLA-B5801 dương tính Hình Real-time PCR mẫu HLA-B5801 (+) BÀN LUẬN Bệnh gút bệnh lý viêm khớp xảy acid uric tích tụ nhiều máu Việc dẫn đến lắng đọng tinh thể urat natri số tổ chức, đặc biệt màng hoạt dịch khớp, sụn xương, gân, tổ chức da, nhu mô thận đài bể thận khớp Bệnh thường xuất nhiều nam so với nữ(12) Phương pháp chữa trị gút chủ yếu tập trung vào việc làm giảm trì lượng acid uric mức nguy hiểm, giúp cho tinh thể muối urat phân huỷ Ngoài việc dùng thuốc làm tăng đào thải acid uric niệu, người ta dùng allopurinol để ức chế sinh tổng hợp acid uric Tim Mạch Hình Kết melting curve mẫu HLA-B5801 (+) Ngày nay, khoa học thừa nhận HLAB5801 dấu ấn di truyền dự báo tác hại nghiêm trọng da sử dụng allopurinol đưa khuyến cáo việc xác định tình trạng alen HLA-B5801 trước tiến hành điều trị với allopurinol (4) Chính vậy, xét nghiệm HLA-B5801 cần phải thực trước dùng allopurinol, đặc biệt bệnh nhân Đơng Nam Á(3) Nếu bệnh nhân có alen HLA-B5801 bác sĩ tư vấn sử dụng thuốc thay theo dõi chặt chẽ thay đổi liều lượng thuốc allopurinol phù hợp nhằm giảm thiểu nguy xảy phản ứng mẫn nguy hiểm Phương pháp real-time PCR để xác định HLA-B5801 sử dụng thuốc nhuộm SYBR Green I phân tích melting curve phương pháp đơn giản không cần sử dụng đoạn dò đặc hiệu Melting curve sử dụng melting point, nhiệt độ nóng chảy đoạn DNAkhi 50% lượng DNA bị biến tính Nhiệt độ nóng chảy thể độ đặc hiệu phản ứng khuếch đại dựa vào nhiệt độ nóng chảy đặc hiệu sản phẩm PCR Vì thế, việc phân tích melting curve bước để khẳng định kết realtime PCR HLA-B5801 thể nhiệt độ nóng chảy đặc hiệu sản phẩm khuếch đại HLA-B5801 nhiệt độ nóng chảy chứng nội, giúp cho việc khẳng định kết dương tính âm tính chắn Ngồi ra, phương pháp hữu dụng việc phòng ngừa 289 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số * 2016 khả ngoại nhiễm sản phẩm PCR khuếch đại Dựa vào giá trị Ct phân tích đường cong nóng chảy cho sản phẩm PCR đặc hiệu với gen HLA-B5801 sản phẩm khuếch đại chứng nội, mẫu HLA-B5801 dương tính có melting point 88,85±0,35°C, mẫu chứng nội có melting point 81,60±0,34°C Các kết cho thấy độ đặc hiệu kit với alen HLAB5801 chứng nội Bộ kít cho kết mẫu HLA-B5801 dương (5,6%), 34 mẫu HLAB5801 âm (94,4%) Thực xét nghiệm HLA-B5801 giúp bác sĩ đề phương hướng điều trị bệnh gút hiệu cho bệnh nhân tránh phản ứng phụ thuốc KẾT LUẬN Nghiên cứu thành công việc sử dụng phương pháp real-time PCR việc xác định HLA-B5801 bệnh nhân bịgút Ứng dụng kỹ thuật trước cho bệnh nhân sử dụng alluporinol tránh giảm nhẹ phản ứng mẫn nguy hiểm, đồng thời giúp đưa phương pháp liều lượng thuốc điều trị phù hợp cho bệnh nhân TÀI LIỆU THAM KHẢO Arellano F, Sacristan J (1993) Allopurinol hypersensitivity syndrome: a review Ann Pharmacother, 27: 337-343 Fan W, Huang L, Zhou Z, Zeng X, Li G, Deo P, Hu L, Li Y (2012) Rapid and reliable genotyping of HLA-B*27 in the Chinese Han population using a duplex real-time TaqMan PCR assay Clin Biochem, 45: 106-111 290 Hershfield MS, Callaghan JT, Tassaneeyakul W, Mushiroda T, Thorn CF, Klein TE, Lee MTM (2012) Clinical pharmacogenetics implementation consortium guidelines for human leucocyte antigen-B genotype and Allopurinol dosing Clin Phaarmacol Ther, 93: 153-158 Hung SI, Chung WH, Liou LB, Chu CC, et al (2005) HLAB*5801 allele as a genetic marker for severe cutaneous adverse reactions caused by allopurinol Proc Natl Acad Sci U.S.A, 102: 4134-4139 Kang HR, Jee YK, Kim YS, Lee CH, Jung JW, et al (2011) Positive and negative associations of HLA class I alleles with allopurinol-induced SCARS in Koreans Pharmacogenet Genomics, 21: 303-307 Kaniwa N, Saito Y, Aihara M, Matsunaga K, et al (2008) HLA-B locus in Japanese patients with anti-epileptics and allopurinolrelated Stevens-Johnson syndrome and toxic epidermal necrolysis Pharmacogenomics, 9: 1617-1622 McInnes GT, Lawson DH, Jick H (1981) Acute adverse reactions attributed to allopurinol in hospitalised patients Ann Rheum Dis, 40: 245-249 Middleton D, Menchaca L, Rood H, Komerofsky R (2003) New allele frequency database Tissue Antigens, 61: 403-407 Mockenhaupt M, Viboud C, Dunant A, et al (2008) StevensJohnson syndrome and toxic epidermal necrolysis: assessment of medication risks with emphasis on recently marketed drugs The EuroSCAR-study J Invest Dematol, 128: 35-44 10 Somkrua R, Eickman EE< Saokaew S, Lohitnavy M, Chaiyakunapruk N (2011) Association of HLA-B*5801 allele and allopurinol induced stevens johnson syndrome and toxic epidermal necrolysis: a systematic review and metaanalysis BMC Med Genet, 12: 118 11 Tassaneeyakul W, Jantararoungtong T, Chen P, Lin PY, et al (2009) Strong association between HLA-B*5801 and allopurinolinduced Stevens—Johnson syndrome and toxic epidermal necrolysis in a Thai population Pharmacogenet Genomics, 19: 704709 12 Yeo SI (2013) HLA-B*5801: utility and cost-effectiveness in the Asia-Pacific Region Int J Rheum Dis, 16: 254-257 Ngày nhận báo: 20/11/2015 Ngày phản biện nhận xét báo: 27/11/2015 Ngày báo đăng: 15/02/2016 Chuyên Đề Nội Khoa I ... động) Giới Nam/nữ (% nam) HLA-B5801 (+) Tổng (n=36) 45,5(23-78) 35/1 (97,2%) (nam) Kết real-time PCR Để xác định tình trạng HLA-B5801 bệnh nhân, chúng tơi tiến hành real-time PCR sử dụng thuốc nhuộm... cho thấy kết real-time PCR bệnh nhân dương tính HLA-B5801 Hình cho thấy kết melting curve chứng nội mẫu HLA-B5801 dương tính Hình Real-time PCR mẫu HLA-B5801 (+) BÀN LUẬN Bệnh gút bệnh lý viêm... mối liên kết mạnh mẽ bệnh nhân có alen HLA-B5801 tình trạng phản ứng mẫn, SJS/TEN(3, 5, 6, 11) ĐỐITƯỢNG–PHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU Đối tượng nghiên cứu Bệnh nhân nghi ngờ bị bệnh gút bệnh viện Đại học