Bài viết trình bày đánh giá tác dụng của cao chiết nước Sâm linh bạch truật (SLBT) trong điều trị Viêm loét đại tràng gây bởi dextran sodium sulfat (DSS) trên chuột nhắt trắng.
Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 20 * Số * 2016 Nghiên cứu Y học ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG ĐIỀU TRỊ VIÊM LOÉT ĐẠI TRÀNG CỦA CAO CHIẾT NƯỚC SÂM LINH BẠCH TRUẬT TRÊN MƠ HÌNH THỰC NGHIỆM Nguyễn Thị Cẩm Vân*, Lê Hoàng Minh Quân*, Bùi Tiến Thành*, Lê Thị Lan Phương* TÓM TẮT Mở đầu: Viêm loét đại tràng (VLĐT) tình trạng viêm loét mạn tính đại tràng, thường điều trị nội khoa ngoại khoa Việc dùng thuốc làm giảmtriệu chứng ngăn ngừa tái phát kèm nhiều tác dụng khơng mong muốn Từ thực tế đó, việc nghiên cứu thuốc Đơng y với tác dụng có hại, cải thiện tình trạng bệnh tật cần thiết Một số nghiên cứu giới cho thấy thuốc Sâm linh bạch truật có hiệu điều trị VLĐT Tuy nhiên, Việt Nam chưa có cơng trình nghiên cứu mơ hình thực nghiệm chứng minh tác dụng điều trị SLBT Mục tiêu: Đánh giá tác dụng cao chiết nước Sâm linh bạch truật (SLBT) điều trị Viêm loét đại tràng gây dextran sodium sulfat (DSS) chuột nhắt trắng Phương pháp: Đánh giá tác dụng điều trị VLĐT SLBT với liều 6,67g cao/kg (1/4 Dmax) mơ hình gây VLĐT dextran sodium sulfat 3% 10 ngày 15 ngày, đường uống, điều trị ngày Thuốc đối chiếu sulfasalazin 100mg/kg Chỉ tiêu đánh giá bao gồm tiêu chuẩn VLĐT theo bảng điểm Monika Schneider (mức độ giảm cân, tính chất phân, máu phân, cân nặng trung bình) tỉ lệ chết Kết quả: Xác định Dmax=26,67g/kg chuột Ở lô gây bệnh dextran sodium sulfat 3% 10 ngày, liều 6,67g cao SLBT/kg (1/4 Dmax) giúp giảm 4,84 điểm chuột bệnh (p=0,07), phục hồi cân nặng (p=0,01), giảm tỉ lệ phân lỏng máu phân Ở lô gây bệnh dextran sodium sulfat 3% 15 ngày, liều 6,67g cao SLBT/kg (1/4 Dmax) giúp giảm 2,23 điểm chuột bệnh (p=0,11), giảm tỉ lệ phân lỏng, máu phân giảm 50% số chuột chết so với lô bệnh Kết luận: Cao chiết nước Sâm linh bạch truật thể tác dụng điều trị Viêm loét đại tràng gây dextran sodium sulfat thông qua việc giảm tỉ lệ sống chết, cải thiện tính chất phân cân nặng chuột với liều 6,67g cao/kg chuột sử dụng ngày Từ khóa: Viêm loét đại tràng, sâm linh bạch truật, dextran sodium sulfat, sulfasalazin ABSTRACT EVALUATING EFFECT OF SHEN LING BAI ZHU EXTRACT ON ULCERATIVE COLITIS MODELINDUCED BY DEXTRAN SODIUM SULFATE IN MICE Nguyen Thi Cam Van, Le Hoang Minh Quan, Bui Tien Thanh, Le Thi Lan Phuong * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Vol 20 - No - 2016: 25 - 30 Background: Ulcerative colitis (UC) is a long-lasting inflammation and ulceration in the large intestine (colon) It is treated by internal medicine or surgery The main goals of UC management are symptomatic treatment and relapsed prevention However, it is accompanied by many side effects of drugs From this fact, the study of traditional medicine with fewer unwanted effect and improvement of disease is essential Many studies have demonstrated that Shen-Ling-Bai-Zhu (SLBZ) was effective in treating UC However, in Vietnam, there are no studies on experimental models that show the effect of SLBZ * Khoa Y học cổ truyền – Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: BS Nguyễn Thị Cẩm Vân ĐT: 0126722113 Email: qlnguyenthicamvan@gmail.com 25 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 20 * Số * 2016 Aims of study: Evaluate the effect of SLBZ extract on the ulcerative colitis model induced by dextran sodium sulfate 3% in mice during 10 days and 15 days Method: Evaluate the effect of SLBZ dose 6.67g / kg (1/4 Dmax) on the ulcerative colitis model induced by dextran sodium sulfate 3% in mice, orally, during 10 days and 15 days The compared group used sulfasalazin 100 mg/kg Parameters for UC evaluation of Monika Schneider include clinical score (weight loss, stool consistency, blood in stool, average weight) and mortality Results: Determined Dmax =26.67g/kg In the UC model induced by dextran sodium sulfate 3% for10 days, the dose 6.67 mg /kg (1/4 Dmax) showed significant reduction in clinical score parameters about 4.48 points (p=0.07), weight recovery (p = 0.01), decreased liquid stool and blood in stool In the UC model induced by dextran sodium sulfate 3% for15 days, the dose 6.67 mg /kg reduced clinical score parameters about 2.23 points (p=0.11), decreased liquid stool, blood in stool and reduced the death rate Conclusion: The results indicate that SLBZ extract exhibits the effective treatment on the UC model induced by dextran sodium sulfate 3% at dose investigated Key words: Ulcerative colitis, Shen-Ling-Bai-Zhu, dextran sodium sulfate, sulfasalazin MỞ ĐẦU Y học cổ truyền sử dụng lâm sàng hàng ngàn năm để điều trị nhiều bệnh tật Trong đó, thuốc Sâm linh bạch truật (SLBT) cơng thức cổ phương tiếng, có xuất xứ từ Thái Bình Huệ Dân Hòa Tễ Cục Phương, biết đến với công dụng hữu hiệu đường tiêu hóa Một số nghiên cứu khảo sát lâm sàng giới chứng minh SLBT có tác dụng điều trị viêm loét đại tràng nhờ khả ức chế phản ứng viêm(2,3,7) Tuy nhiên,hiện chưa có nghiên cứu mơ hình thực nghiệm kiểm chứng tài liệu y khoa Việt Nam Đề tài thực nhằm khảo sát tính an tồn đánh giá tác dụng điều trị viêm loét đại tràng cao chiết nước thuốc SLBT mơ hình thực nghiệm cụ thể, qua đó, góp phần củng cố tính khoa học cho tác dụng thuốc làm sở điều trị VLĐTtrên lâm sàng thuốc Đông y Điều phù hợp với định hướng kế thừa phát huy Y học cổ truyền (YHCT), kết hợp YHCT Y học đại WHO(1) Bên cạnh đó, thuốc SLBT sử dụng nghiên cứu thay Nhân sâm Đảng sâm với liều gấp lần(5) Thành phần thuốc sau: 26 Đảng sâm Bạch linh Bạch truật Bạch biển đậu Cát cánh 36g 12g 12g 9g 6g Hoài sơn Sa nhân Ý dĩ Liên nhục Cam thảo 12g 6g 6g 6g 12g Mơ hìnhgây VLĐT sử dụng nghiên cứu mơ hình gây bệnh dextran sodium sulfat mơ hình phổ biến, cách thực đơn giản với thời gian gây mơ hình ngắn kiểm sốt mức độ nghiêm trọng tình trạng viêm, chi phí tương đối thấp(4).Hơn nữa, mơ hình kiểm chứng Phòng thí nghiệm Y Dược cổ truyền, khoa Y học cổ truyền, Đại học Y dược TP Hồ Chí Minh PHƯƠNGTIỆN-PHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU Nguyên liệu nghiên cứu Các dược liệu sử dụng nghiên cứu mua cửa hàng Dược liệu, Quận 5, TP.Hồ Chí Minh Dược liệu đạt tiêu chuẩn sở bào chế theo quy định Bộ Y tế Quy trình bào chế cao SLBT: Dược liệu sau bào chế chiết xuất với dung môi nước lần, 60 phút 30 phút Tỷ lệ dung môi: dược liệu khô 10:1 5:1 Tập hợp dịch chiết, cô cách thủy đến dạng cao đặc Hiệu suất chiết đạt 34,34% Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 20 * Số * 2016 Cao SLBT có có màu đen, mùi thơm nhẹ, vị ngọt, thể chất đặc quánh, độ ẩm 17,43% ± 0,32, độ tro toàn phần 5,31% ± 0,09, độ tan 1g/20ml theo quy định DĐVN IV Trong cao SLBT có diện dược liệu Đảng sâm, Bạch truật, Cam thảo (định tính sắc ký lớp mỏng) Nghiên cứu Y học giống đực, trọng lượng trung bình 25 ± g, cung cấp Viện Pasteur TP Hồ Chí Minh Chuột ni nhiệt độ phòng với chu kỳ 12 sáng/tối, sử dụng thức ăn cám viên với thành phần bột gạo, bột bắp, carbohydrat vitamin cung cấp Viện Pasteur TP Hồ Chí Minh suốt thử nghiệm Khảo sát độc tính cấp(8) Thử nghiệm thực qua giai đoạn: Giai đoạn thăm dò: Khởi đầu từ liều cao bơm qua kim đầu tù cho uống Xác định liều LD0 (liều tối đa không gây chết) liều LD100 (liều tối thiểu gây chết 100%) Giai đoạn xác định: Chuột chia lô cho sử dụng thuốc liều khoảng LD0 LD100 chia theo cấp số nhân Theo dõi biểu hành vi vận động chuột vòng 72 tuần sau dùng thuốc Ghi nhận số chuột chết lô Xác định LD50 (nếu có) theo phương pháp Karber-Behrens Đánh giá tác dụng điều trị viêm loét đại tràng(6) Hình Quy trình chiết cao Phương tiện Hóa chất Thuốc dextran sodium sulfat (DSS) trọng lượng phân tử từ 30-50 kDa, cung cấp công ty TdB Consultancy AB, Thụy Sỹ Thuốc đối chứng Salazopyrin (5-ASA) cung cấp công ty Pfizer, Mỹ, khối lượng 500 mg/ viên Acid acetic 10%, hydrogen peroxide 10%, cồn ethylic 95o, aminopyrine Thiết bị dụng cụ Cân phân tích Sartorius CP 224S (Đức), máy ly tâm, lồng chuyển hóa kiểm chứng độ xác Chuột ni ổn định tuần Khi tiến hành chọn chuột vào thử nghiệm, tất chuột có số cân nặng đồng Quan sát chuột phải khơng có biểu bất thường phân (phân phải có màu đen, khơ) Một lô chứng uống nước cất nuôi song song để theo dõi cân nặng tình trạng chuột điều kiện bình thường ni riêng biệt lồng chuyển hóa Nhóm chuột gây mơ hình thực bước sau: Nhốt chuột riêng biệt vào lồng chuyển hóa Hòa tan DSS nước máy với nồng độ 3% (khoảng 20 mL/lồng/ngày) Từ ngày đến ngày 10, cho chuột uống nước có 3% DSS Động vật thử nghiệm Cân chuột ngày lưu ý tính chất phân, tình trạng chảy máu phân hay hậu mơn Chuột nhắt trắng, chủng Albino Swiss, trưởng thành (7-10 tuần tuổi), khỏe mạnh, Từ ngày 11, ngưng DSS, cho chuột uống nước máy 27 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 20 * Số * 2016 Ngày 13, đánh giá mức độ bệnh thang điểm Monika Schneider (Bảng 1), sử dụng thông số sau: tính chất phân, máu phân cân nặng Bảng 1: Bảng điểm đánh giá tình trạng chuột sau gây bệnh Chỉ tiêu Giảm trọng lượng Tính chất phân Máu phân Mức độ Không giảm/ Tăng Giảm 1-5% Giảm 6-10% Giảm 11-20% Giảm 20% Thành viên Phân sệt Phân lỏng Khơng có máu Hồng cầu/phân (+) Chảy máu Điểm 4 Chọn chuột bệnh đạt từ 5-10 điểm phân thành hai nhóm, nhóm có lô (n=6), lô chia với số điểm Tất chuột so sánh với lơ chứng âm (lơ uống nước cất hồn tồn) Nhóm 1: Ngưng sử dụng DSS 3% Đổ phần nước vào ống nghiệm, sau nhỏ từ từ vào thành ống nghiệm chất sau đây: 10 giọt dung dịch acid acetic 5ml dung dịch aminopyrine 10 giọt hydrogen peroxide Chú ý: Không trộn lẫn chất với Đọc kết Kết dương tính màu đỏ/tím xuất lớp dung dịch: Đỏ/tím nhạt = phản ứng dương tính (+) Khơng có màu = phản ứng âm tính (–) Phương pháp thống kê-xử lý số liệu Số liệu trình bày dạng trung bình ± sai số chuẩn (M ± SD) Phân tích số liệu phép kiểm t-test Anova chiều, yếu tố.Đồ thị vẽ phần mềm MS.EXCEL 2007 Lô 1: Uống nước cất (bệnh) KẾT QUẢ Lô 2: Điều trị thuốc 5-ASA 100 mg/kg Độc tính cấp Lơ 3: Điều trị cao SLBT Dmaxcủa cao SLBT 26,67 g cao/kg chuột (tương đương 340,43 g dược liệu khô) gấp 2,9 lần liều thường sử dụng ngày (khoảng 117 g/ngày), khơng có chuột chết vòng 72 đầu tuần sau đó.Dođó,chưa xác định liều LD50 Nhóm 2: Tiếp tục sử dụng DSS 3% Lô 4: Uống nước cất (bệnh) Lô 5: Điều trị thuốc 5-ASA 100 mg/kg Lô 6: Điều trị cao SLBT Điều trị ngày,sau nghỉ hai ngày đánh giá thang điểm (Bảng 1) Phương pháp tìm huyết sắc tố phân Aminopyrine Nguyên tắc Khi huyết sắc tố tiếp xúc với hydrogen peroxide oxygen phóng thích, oxygen phản ứng với chất Aminopyrine (Aminophenazone) làm màu Quy trình kỹ thuật 0,5 g phân + ml nước cất cho vào ống ly 28 tâm đánh tan phân ly tâm 1000 vòng/phút/5 phút Theo “Phương pháp xác định độc tính cấp” Đỗ Trung Đàm liều tác dụng cao dược liệu khơng tìm LD50 thường vào khoảng 1/3 – 1/5 Dmax(8) Do đó, chúng tơi định chọn liều thử nghiệm liều trung gian:1/4 Dmax tương đương 6,67 g cao/kg chuột Tác dụng điều trị viêm loét đại tràng Trước điều trị, điểm số đánh giá cân nặng lô khác khơng có ý nghĩa thống kê (p>0,05) Sau điều trị, Nhóm 1: Lơ uống SLBT giảm 4,84 điểm (p= Y Học TP Hồ Chí Minh * Tập 20 * Số * 2016 0,07), phục hồi cân nặng (p=0,4) so với lô không điều trị.Lô uống sulfasalazine giảm 5,5 điểm (p=0,03), phục hồi cân nặng (p=0,04) so với lô không điều trị Lô uống SLBT lô uống sulfasalazine khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê Bảng Bảng điểm trung bình nhóm ngày 13 ngày 19 N=6 N13 N19 Bệnh 6,67 ± 1,21 4,83 ± 2,71 Sulf 7,00 ± 0,89 1,50 ± 1,22 SLBT 6,67 ± 1,63 1,83 ± 2,31 Nghiên cứu Y học Bảng Tỷ lệ chuột chết nhóm ngày 19 N=6 N13 N19 Bệnh 3/6 Sulf 1/6 SLBT 1/6 Nhóm 2: Lơ uống SLBT giảm 2,23 điểm (p=0,11), phục hồi cân nặng (p=0,53) so với lô không điều trị Lô sulfasalazine giảm 2,57 điểm (p=0,02), phục hồi cân nặng (p=0,65) so với lô không điều trị, tỷ lệ tử vong hai lô 16,67% Tỷ lệ tử vong lô không điều trị 50% Lô uống SLBT lô uống sulfasalazine khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê BÀN LUẬN Qua nghiên cứu, cao chiết nước SLBT thể khả điều trị viêm loét đại tràng DSS gây chuột nhắt thông qua việc giảm tỷ lệ tử vong, giảm tình trạng chảy máu niêm mạc đại tràng, giảm tình trạng phân lỏng giúp hồi phục cân nặng Trong nhóm sử dụng DSS 3% 15 ngày, SLBT giúp cải thiện tỷ lệ tử vong từ 50% xuống 16,7% Hình Biểu đồ cân nặng trung bình nhóm ngày 1, ngày 13 ngày 19 (##): p=0,04 so với lô bệnh Bảng Bảng điểm trung bình nhóm ngày 13 ngày 19 N=6 N13 N19 Bệnh 6,67 ± 1,50 6,00 ± 1,73 Sulf 7,17 ± 1,72 4,6 ± 1,14 SLBT 6,83 ± 2,14 4,60 ± 2,07 g Phân tích thành phần hóa học thuốc, có chứa chủ yếu saponin (có Đảng sâm, Bạch linh, Cát cánh, Liên nhục), giúp hấp thu chất dinh dưỡng, kháng viêm Hiệu điều trị SLBT nghiên cứu hoàn toàn phù hợp với nghiên cứu trước chế bảo vệ niêm mạc đại tràng SLBT cách ức chế tạo thành yếu tố viêm (TNF-α, IL-1β, IL-6), thu giữ gốc oxy hóa tự do, giảm dấu ấn sinh học tạo q trình stress oxy hóa(7) KẾT LUẬN Hình Biểu đồ cân nặng trung bình Nhóm ngày 1, ngày 13 ngày 19 (*): p