Hội chứng Gardner là bệnh di truyền trội do đột biến gen trên nhiễm sắc thể thường với nhiều polyp ở đại trực tràng, u xương và bất thường răng miệng. Nguyên nhân gây ra hội chứng Gardner là do đột biến dòng mầm gen APC (adenomatous polyposis coli gene). Các đột biến trên gen APC chủ yếu là các đột biến điểm làm cắt ngắn, gây mất chức năng protein APC.
Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số * 2016 NHÂN MỘT TRƯỜNG HỢP MẮC HỘI CHỨNG GARDNER CÓ ĐỘT BIẾN GEN APC Đỗ Thị Thanh Thủy*, Ngô Thị Hồng Phước*, Nguyễn Thị Băng Sương**, Bùi Nguyễn Nhật Minh*, Nguyễn Văn Tròn***, Huỳnh Châu Quang Khải***, Bùi Hữu Lâm*** TĨM TẮT Mở đầu: Hội chứng Gardner bệnh di truyền trội đột biến gen nhiễm sắc thể thường với nhiều polyp đại trực tràng, u xương bất thường miệng Nguyên nhân gây hội chứng Gardner đột biến dòng mầm gen APC (adenomatous polyposis coli gene) Các đột biến gen APC chủ yếu đột biến điểm làm cắt ngắn, gây chức protein APC Mục tiêu: Phát đột biến gen APC bệnh nhân mắc hội chứng Gardner Đối tượng phương pháp nghiên cứu: Một bệnh nhân nữ, 19 tuổi với triệu chứng điển hình hội chứng Gardner bệnh viện RHM Trung Ương gửi đến với yêu cầu phát đột biến gen APC Chúng tơi tiến hành giải trình tự gen APC sử dụng công cụ sinh tin học để phát đột biến gen APC dự đoán tác động đột biến Kết quả: Đã phát đột biến p.Gln1517ArgfsX6 gen APC phân tích tác động đột biến lên chức protein Kết luận: Phát đột biến p.Gln1517ArgfsX6 gen APC bệnh nhân mắc hội chứng Gardner Từ khoá: Hội chứng Gardner, APC, Giải trình tự, p.Gln1517ArgfsX6 ABSTRACT REPORT OF A GARDNER’S SYNDROME CASE WITH AN APC GENE MUTATION Do Thi Thanh Thuy, Ngo Thi Hong Phuoc, Nguyen Thi Bang Suong, Bui Nguyen Nhat Minh, Nguyen Van Tron, Huynh Chau Quang Khai, Bui Huu Lam * Y Hoc TP Ho Chi Minh * Supplement of Vol 20 - No – 2016: 324 - 329 Introduction: Gardner’s syndrome is an autosomal dominant disorder with complete penetrance, caused by mutations in the APC gene (adenomatous polyposis coli gene) Gardner’s syndrome is characterized by intestinal polyposis, osteomas and dental abnormalities APC mutations are mostly point mutations, causing a truncated and dysfunctional APC protein Objective: Detection of mutations in APC gene from a patient with Gardner’s syndrome Subjects and Methods: A19-year-old female patient with typical symptoms of Gardner’s syndrome was sent from the Hospital of Odonto-Stomatology, Hochiminh City for detection of APC gene mutations We performed APC gene sequencing and used bioinformatics tools to detect APC gene mutations and predict the effects of mutations Results: We detected the p.Gln1517ArgfsX6 mutation in APC gene and analyzed the effects of this *Trung tâm Y sinh học phân tử - Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh **Bộ mơn Hóa Sinh - Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh *** Bệnh viện Răng Hàm Mặt Trung Ương TP HCM Tác giả liên lạc: TS BS Đỗ Thị Thanh Thủy ĐT: 0908487425 324 Email: thuyprenatal@gmail.com Chuyên Đề Nội Khoa I Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số * 2016 Nghiên cứu Y học mutation on functions of the APC protein Conclusion: We reported a p.Gln1517ArgfsX6 mutation in APC gene from a patient with Gardner’s syndrome Key words: Gardner’s syndrome, APC, Sequencing, p.Gln1517ArgfsX6 hay khơng để phòng tránh nguy ung thư ĐẶT VẤN ĐỀ thực tư vấn di truyền nhằm hạn chế Vào năm 1953, Gardner mô tả hội lan truyền gen đột biến cộng đồng chứng bệnh di truyền với nhiều polyp đại trực Chúng tiến hành nghiên cứu đột biến gen tràng, u xương bất thường miệng (6) APC bệnh nhân mắc hội chứng Gardner Hiện nay, hội chứng Gardner xem với mong muốn tìm hiểu mối liên hệ biến biến thể bệnh đa polyp tuyến gia đình (FAP) đổi kiểu gen đặc điểm lâm sàng bệnh với tần suất mắc bệnh dao động từ 1/12000 cho thực tư vấn di truyền cho thân nhân đến 1/4000(7) Hội chứng Gardner bệnh di người bệnh Chúng xin báo cáo trường truyền trội đột biến gen nhiễm sắc thể hợp hội chứng Gardner phát thấy có đột thường với biểu lâm sàng đặc trưng biến gen APC đa polyp đại trực tràng dẫn đến ung thư đại ĐỐITƯỢNG-PHƯƠNGPHÁPNGHIÊNCỨU trực tràng sau này, dư thừa mọc ngầm hàm, u xương hộp sọ, u tuyến giáp, u nang Đối tượng nghiên cứu biểu bì (10) Nguyên nhân chủ yếu gây hội Bệnh nhân nữ, 19 tuổi, nhập viện có triệu chứng Gardner đột biến dòng mầm gen chứng bất thường miệng sưng lợi, u APC (adenomatous polyposis coli gene) - gen ức xương góc bên phải hàm Bệnh nhân chế khối u nằm NST số Gen APC gồm 15 làm xét nghiệm cận lâm sàng bệnh exon, với exon lớn exon 15 chiếm 75% viện Răng Hàm Mặt Trung Ương, đồng thời lấy trình tự mã hóa protein gen Gen APC mã mẫu máu phân tích gen APC Trung tâm Y hóa cho protein APC gồm 2843 amino axit có vai sinh học phân tử, trường Đại học Y dược, trò điều hòa đường tín hiệu WNT, ngăn TP.HCM chặn tế bào tăng trưởng phân chia mức(12) Các nghiên cứu gen APC tìm 1000 đột biến cơng bố sở liệu Leiden Open Variations Database (http://www.LOVD.nl) Các đột biến gen APC chủ yếu đột biến vô nghĩa đột biến lệch khung tạo thành stop codon làm cắt ngắn protein APC gây chức protein Hầu hết đột biến đột biến điểm nằm rải rác khắp gen nên giải trình tự phương pháp hiệu để phát hiệu đột biến gen APC Việc phát đột biến gen APC cần thiết để phát điều trị phòng ngừa sớm ung thư đại trực tràng hội chứng Gardner gây Bên cạnh đó, đột biến gen APC đột biến gen trội di truyền nên người nhà bệnh nhân bị hội chứng Gardner cần xét nghiệm kiểm tra có bị đột biến gen Tiêu Hóa Phương pháp nghiên cứu Chẩn đốn cận lâm sàng Chụp X-quang vùng miệng Nội soi đại trực tràng Phân tích gen APC Tách chiết DNA genome từ mẫu máu Mẫu máu chống đông EDTA, tách chiết DNA 24 Quy trình tách chiết DNA genome từ 200 µl máu ngoại vi tiến hành với thuốc thử Qiagen Đo nồng độ độ tinh DNA tách chiết, mẫu có tỷ lệ giá trị mật độ quang bước sóng 260/280 nm đạt từ 1,8 – 2,0 dùng để tiến hành phản ứng PCR giải trình tự gen Kĩ thuật giải trình tự gen Tiến hành phản ứng PCR khuếch đại toàn 325 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số * 2016 15 exon 29 cặp mồi - Các thành phần phản ứng bao gồm: Mồi xi 0,2 µM, mồi ngược 0,2 µM, đệm PCR 1X, MgCl2 1,5 mM, dNTP 0,2 mM, TakaraTaq 0,5U, DNA genome mẫu µl tổng thể tích 15 µl - Chu trình nhiệt: Biến tính 98oC phút, sau 30 chu kỳ gồm 98oC 10 giây; 58oC 30 giây; 72oC phút, giai đoạn kết thúc gồm 72oC phút Tinh sản phẩm PCR giải trình tự đoạn sản phẩm khuếch đại Phân tích kết giải trình tự dự đốn tác động đột biến Xác định đột biến, phân tích khả gây bệnh đột biến phần mềm chuyên dụng Hình 2.Kết chụp X-quang vùng miệng Kết giải trình tự gen APC bệnh nhân Sản phẩm PCR sau tinh tiến hành xác định trình tự theo hai chiều (chiều xi - F chiều ngược - R) gen APC KẾT QUẢ Đặc điểm cận lâm sàng bệnh nhân Hình Kết giải trình tự exon 15F Hình 1.Kết nội soi đại trực tràng Nhận xét: Kết nội soi đại trực tràng bệnh nhân phát nhiều polyp đường kính từ 3-6mm vùng trực tràng sigma Vùng đại tràng P đại tràng T niêm mạc trơn láng, mềm mại, không phát u, loét Đại tràng ngang trống, van ruột thấy rõ Vùng góc lách, góc gan manh tràng bình thường Kết chụp X-quang vùng miệng cho thấy rõ u xương mọc vùng góc phải hàm Răng cửa hàm mọc xô lệch bị chèn ép nhiều mọc ngầm xương hàm (Hình 2) 326 Nhận xét: So sánh với trình tự tham chiếu ngân hàng gen (GenBank), phát đột biến điểm nucleotide A vị trí 132640 gen APC, tương ứng với vị trí c.4550 c.DNA Đột biến nucleotide A làm cho khung đọc mã phía sau vị trí đột biến bị lệch, nên trình tự acid amin bị thay đổi so với trình tự gốc protein APC Ở phạm vi protein, đột biến có tên gọi p.Gln1517ArgfsX6 15F (Glutamine vị trí 1517 chuyển thành Arginine, chiều dài đoạn lệch khung (fsframeshift) codon codon kết thúc (X) exon 15F (vì exon 15 dài, nên chia làm nhiều đoạn tương ứng A, B, C, D để thực phản ứng PCR giải trình tự) Chuyên Đề Nội Khoa I Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số * 2016 Dự đoán tác động đột biến lên protein APC Nghiên cứu Y học Đột biến p.Gln1517ArgfsX6 15F tác động đến chuỗi polypeptide protein APC sau: Hình Kết tác động đột biến lên chuỗi polypeptide p.Gln1517ArgfsX6 phân tích ảnh hưởng Nhận xét: Khi đột biến nucleotide đột biến lên cấu trúc protein (A) xảy chuỗi polypeptide protein APC thay đổi từ Q K D V E L chuyển thành R K M W N Stop, protein APC bị cắt ngắn từ 2843 amino acid xuống 1521 amino acid ảnh hưởng nhiều đến chức protein APC Dự đoán tác động đột biến lên protein APC phương pháp in silico gặp nhiều khó khăn cấu trúc 3D protein APC chưa nghiên cứu hoàn thiện cấu trúc lớn phức tạp Hiện cấu trúc 3D protein APC giải phần nằm phức hợp protein APC với Beta catenin Asef Đột biến p.Gln1517ArgfsX6 nằm vùng tập trung đột biến (mutation cluster region MCR) protein APC từ acid amin 1286 đến 1580 (4) Vùng MCR nằm vùng gắn beta-catenin Chúng dự đoán tác động đột biến dựa vào cấu trúc phức hợp protein Beta-catenin liên kết vùng lặp lại 20 acid amin protein APC Ha Nc cộng công bố (8) Đây vùng chứa vị trí đột biến có vai trò gắn với beta-catenin nhằm kích thích phân hủy beta-catenin Phần mềm Pymol sử dụng để mô protein APC bị đột biến Tiêu Hóa Hình 5: So sánh cấu trúc 3D protein A: Protein APC (bình thường) tương tác với Beta catein B: Protein APC (đột biến) tương tác với Beta catenin Nhận xét: Ở protein APC bình thường thấy acid amin tạo thành liên kết hydro với Beta-catein 327 Nghiên cứu Y học Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số * 2016 protein APC bị đột biến liên kết hydro đồng thời cấu trúc xoắn alpha bị cắt bỏ đột biến tạo thành codon stop nên cắt ngắn cấu trúc protein APC BÀN LUẬN Hội chứng Gardner biến thể bệnh FAP với biểu đặc trưng polyp đại trực tràng, polyp có nguy ác tính cao không can thiệp điều trị sớm (3) Các triệu chứng bên ruột hội chứng Gardner thường phát trước polyp đại trực tràng, đặc biệt bất thường xuất u xương triệu chứng điển hình hội chứng Gardner (11) Bệnh nhân có đầy đủ triệu chứng hội chứng Gardner đồng thời giải trình tự gen APC phát đột biến p.Gln1517ArgfsX6 làm cắt ngắn, gây chức protein APC Protein APC chất ức chế protein Beta-catein Bình thường, protein APC ức chế đường tín hiệu Wnt cách gắn với Beta-catenin, GSK3β Axin để kích thích phosphoryl hóa phân hủy Beta-catenin protein APC bị đột biến Betacatenin khơng bị phân hủy tích tụ tế bào chất vào nhân kích hoạt phiên mã nhiều gen myc cyclin D1 gây ung thư(5) MCR) protein APC, vùng MCR nằm vùng gắn beta-catenin nên đóng vai trò quan trọng chức điều hòa đường Wnt protein APC Con đường Wnt kích hoạt họ protein Wnt Trong suốt trình phát triển bào thai, protein Wnt có chức làm phát triển tạo hình thái cho nhiều quan khác nhau, đặc biệt cấu trúc biểu mô hình ống (tubular), vi nhung mao (ductular) thận ruột Con đường Wnt điều hòa phức hợp APC có vai trò phân hủy beta-catenin ngăn chặn đường truyền tín hiệu đường vào nhân tế bào (5) Khi đột biến xảy protein APC bị cắt ngắn từ 2843 amino acid xuống 1521 amino acid, làm thay đổi cấu trúc ban đầu, dẫn đến protein APC khả liên kết với Beta-catenin, đồng thời cấu trúc xoắn alpha cấu trúc đảm nhận chức phosphoryl hóa Beta-catenin bị làm protein APC khơng chức phosphoryl hóa Beta-catenin nhằm kích thích phân hủy Beta-catenin, điều hòa đường tín hiệu Wnt Để phân tích sâu nguyên nhân gây ung thư đột biến ta cần tìm hiểu cấu trúc chức vùng protein APC tác động đột biến lên protein APC bị cắt ngắn Đột biến p.Gln1517ArgfsX6 nằm vùng tập trung đột biến (mutation cluster region - Hình 5: Các vùng chức protein APC A: Protein APC (bình thường) B: Protein APC (đột biến) bị cắt ngắn Cấu trúc protein APC gồm vùng vùng Armadildo (Arm), vùng gắn Beta-catenin, vùng gắn Axin, vùng vùng gắn EB1 có 328 khả liên kết với nhiều protein khác nhau, thực nhiều chức đa dạng (5) Đột biến p.Gln1517ArgfsX6 làm protein APC bị cắt ngắn Chuyên Đề Nội Khoa I Y Học TP Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 20 * Số * 2016 lại vùng Armadildo Vùng Armadildo có khả tương tác tăng cường hoạt tính GEF (guanine-nucleotide exchange factor) protein Asef làm kích hoạt khả di cư tế bào đồng thời làm giảm bám dính tế bào thơng qua E-cadherin làm suy giảm lượng Ecadherin Tuy nhiên kích hoạt protein Asef tìm thấy tế bào có protein APC đột biến bị cắt ngắn khơng phải protein bình thường chứng tỏ protein APC bị cắt ngắn thúc đẩy xâm lấn di khối u (9) Bên cạnh vùng gắn Beta-catenin vùng gắn Axin bị khiến protein APC khơng chức phosphoryl hóa thúc đẩy phân hủy Beta-catenin Beta-catenin tích tụ vào nhân tế bào, gắn vào DNA hoạt hóa nhiều gen đích đường tín hiệu Wnt, kích thích tăng sinh kiểm sốt tế bào dẫn đến hình thành polyp ung thư đại trực tràng(2) Không thế, protein APC đóng vai trò quan trọng phân chia tế bào Vùng (basic) protein APC vị trí gắn vi ống, làm cho protein APC có tác dụng điều hòa chức tâm động giúp phân ly nhiễm sắc thể diễn bình thường Đồng thời, protein APC có vùng gắn EB1 tạo điều kiện dễ dàng cho hoạt động Rho mDia, làm ổn định polymer hóa vi ống, giúp cho việc phân chia nhiễm sắc thể xác (1) Chính protein APC bị cắt ngắn làm chức tâm động, gây ổn định nhiễm sắc thể trình phân chia tế bào dẫn đến biến đổi cấu trúc số lượng nhiễm sắc thể gây ung thư Như vậy, đột biến p.Gln1517ArgfsX6 đột biến nằm vùng hotspot gen APC, phát bệnh nhân có biểu lâm sàng điển hình hội chứng Gardner Tuy nhiên, đột biến chưa công bố y văn nên tiến hành nghiên cứu để khẳng định đột biến phân tích RNA bệnh Tiêu Hóa Nghiên cứu Y học nhân giải trình tự gen APC phả hệ gia đình bệnh nhân KẾT LUẬN Nghiên cứu phát đột biến p.Gln1517ArgfsX6 gen APC bệnh nhân mắc hội chứng Gardner với triệu chứng lâm sàng kết chẩn đoán cận lâm sàng đặc trưng TÀI LIỆU THAM KHẢO 10 11 12 Aoki K, Taketo MM (2007), “Adenomatous polyposis coli (APC): a multi-functional tumor suppressor gene”, Journal of Cell Science, 120: 3327-3335 Barker N, Clevers H (2006), “Mining the Wnt pathway for cancer therapeutics”, Na Rev Drug Disco, 5:997-1014 Bilkay U, Erdem O, Ozek C, Helvaci E, Kilik K, Ertan Y, Gurler T (2004), “Benign osteoma with Gardner syndrome: review of the literature and report of a case”, J Craniofac Surg ,15:506–9 De Rosa M, Scarano M, Panariello L, et al (2003), “The mutation of the APC gene in FAP patients from southern Italy: Detection of known and four novel mutations”, Hum Mutat, 21:655-656 Fearnhead NS, Britton MP, and Bodmer WF, (2001), “The ABC of APC”, Human Molecular Genetics, 10 (7): 721-733 Gardner EJ, Richard RC (1953), “Multiple cutaneous and subcutaneous lesions occurring simultaneously with hereditary polyposis and osteomatosis”, Am J Hum Genet, 5:139–47 Gorlin RJ, Cohen MM, Levin LS (1990), “Gardner syndrome in syndromes of the head and neck”, 3rd ed Oxford University Press Ha NC, Tonozuka T, Stamos JL, Choi HJ, Weis WI (2004), “Mechanism of phosphorylation-dependent binding of APC to beta-catenin and its role in beta-catenin degradation”, Mol Cell, 27;15(4):511-21 Kawasaki Y, Sato R, Akiyama T (2003), “Mutated APC and Asef are involved in the migration of colorectal tumour cells”, Nat Cell Biol, 5: 211–215 Luba MC, Bangs SA, Mohler AM, Stulberg DL (2003), “Common benign skin tumors”, Am Fam Physician, 67 (4): 729–38 Newman CA, Reuther WL, Wakabayashi MN, Payette MM, Plavsic BM (1999), “Gastrointestinal case of the day Gardner Syndrome”, Radiogr,19:546–8 Su LK, Vogelstein B, Kinzler KW (1993), “Association of the APC tumor suppressor protein with catenins”, Science, 6(5140):1734–1737 Ngày nhận báo: 27/11/2015 Ngày phản biện nhận xét báo: 30/11/2015 Ngày báo đăng: 15/02/2016 329 ... đại trực tràng hội chứng Gardner gây Bên cạnh đó, đột biến gen APC đột biến gen trội di truyền nên người nhà bệnh nhân bị hội chứng Gardner cần xét nghiệm kiểm tra có bị đột biến gen Tiêu Hóa Phương... điển hình hội chứng Gardner (11) Bệnh nhân có đầy đủ triệu chứng hội chứng Gardner đồng thời giải trình tự gen APC phát đột biến p.Gln1517ArgfsX6 làm cắt ngắn, gây chức protein APC Protein APC chất... di truyền cho thân nhân đến 1/4000(7) Hội chứng Gardner bệnh di người bệnh Chúng xin báo cáo trường truyền trội đột biến gen nhiễm sắc thể hợp hội chứng Gardner phát thấy có đột thường với biểu