Trong nghiên cứu này, chủng chủ Bacillus subtilis và gen chỉ thị celB được sử dụng để đánh giá ảnh hưởng của số lượng Histidine trong đuôi dung hợp ở đầu C lên sự biểu hiện tiết Endoglucanase B.
TẠP CHÍ KHOA HỌC TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP HỒ CHÍ MINH HO CHI MINH CITY UNIVERSITY OF EDUCATION JOURNAL OF SCIENCE Tập 16, Số (2019): 323-334 ISSN: 1859-3100 Vol 16, No (2019): 323-334 Website: http://journal.hcmue.edu.vn Bài báo nghiên cứu KHẢO SÁT SỰ ẢNH HƯỞNG CỦA SỐ LƯỢNG HISTIDINE TRONG ĐUÔI DUNG HỢP Ở ĐẦU C LÊN SỰ BIỂU HIỆN TIẾT ENDOGLUCANASE B TRONG BACILLUS SUBTILIS* Lê Dương Vương1,2, Đặng Thị Kim Ngân1, Trương Thông1, Phan Thị Phượng Trang1, Nguyễn Đức Hoàng1* Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – ĐHQG TPHCM Trường Đại học Cơng nghệ Thành phố Hồ Chí Minh * Tác giả liên hệ: Nguyễn Đức Hoàng – Email: ndhoang@hcmus.edu.vn Ngày nhận bài: 29-5-2019; ngày nhận sửa: 22-6-2019; ngày duyệt đăng: 11-7-2019 TÓM TẮT Trong nghiên cứu này, chủng chủ Bacillus subtilis gen thị celB sử dụng để đánh giá ảnh hưởng số lượng Histidine đuôi dung hợp đầu C lên biểu tiết Endoglucanase B Kết nghiên cứu cho thấy chủng B subtilis 1012 phù hợp cho biểu CelB so với chủng B subtilis WB800N Đi 6His có ảnh hưởng làm giảm biểu tiết CelB nhiều hai đuôi 5His 4His Ngược lại, CelB-6His cho khả bám hạt Ni-NTA tốt hơn, thất (4,78%) CelB-4His lại có rò rỉ tinh chế hạt Ni-NTA mức cao (16,1%) Từ khóa: Bacillus subtilis, Histidine, Endoglucanse B, Pgrac212, dung hợp Giới thiệu Việc sử dụng đuôi dung hợp trở nên phổ biến với nhiều ứng dụng phong phú công nghệ sản xuất protein tái tổ hợp (Terpe, 2003) Đuôi dung hợp giúp làm đơn giản hóa quy trình phát tinh protein Cùng với phát triển công nghệ sinh học, giá trị sử dụng đuôi dung hợp ngày tăng khả bảo vệ protein mục tiêu khỏi phân cắt protease, giúp protein mục tiêu tan tốt hơn, tăng hiệu tổng hợp protein hỗ trợ tốt trình gấp cuộn Hiện nay, His-tag (polyhistidine) lên công cụ phổ biến để thu nhận protein nhận Đây công vụ có nhiều ưu điểm như: (i) kích thước dung hợp nhỏ (kích thước khoảng 0,84 kDa 6His), hạn chế tính miễn dịch so với tinh chế khác có kích thước lớn khơng cần loại bỏ trình sử dụng protein sau tinh sạch, (ii) số lượng lớn vector thương mại thiết kế cho biểu Cite this article as: Le Duong Vuong, Dang Thi Kim Ngan, Truong Thong, Phan Thi Phuong Trang, & Nguyen Duc Hoang (2019) The impact of the amount of Histidine in C-terminal fusion-tag on the secretion of Endoglucanase B in Bacillus subtilis Ho Chi Minh City University of Education Journal of Science, 16(9), 323-334 323 Tạp chí Khoa học Trường ĐHSP TPHCM Tập 16, Số (2019): 323-334 protein có gắn His-tag nhà nghiên cứu sử dụng (iii) tương tác Histag không phụ thuộc vào cấu trúc dung hợp, protein tái tổ hợp có His-tag tinh chế điều kiện biến tính (Goel et al., 2000), (Waugh, 2005) Cấu trúc dung hợp polyhistidine (bao gồm vị trí, trình tự, độ dài) ảnh hưởng đến việc biểu protein nhiều mức độ khác gồm: khả biểu hiện, khả tiết, khả bám vào ion kim loại cố định, cấu trúc bậc ba protein, cấu trúc tinh thể, khả tan hoạt tính protein (Block et al., 2009) Nếu số lượng Histidine dung hợp q lực protein mục tiêu với ion kim loại giảm làm khả gắn chọn lọc chịu cạnh tranh protein tạp có chứa Histidine Trong số trường hợp, việc gia tăng số lượng Histidine đuôi dung hợp làm tăng độ tinh protein mục tiêu Tuy nhiên, khuyến cáo sử dụng dung hợp polyhistidine với Histidine để làm giảm tối thiểu ảnh hưởng đuôi dung hợp lên chức protein (Bornhorst, & Falke, 2000) Ngồi ra, biểu tiết, điện tích dương Histidine dung hợp gây trở ngại cho trình dung hợp protein qua màng Trong nghiên cứu này, đuôi dung hợp polyhistidine gắn vào đầu C protein tiết để giảm can thiệp dung hợp lên màng q trình vận chuyển (Block et al., 2009) Trong nghiên cứu này, ảnh hưởng số lượng Histidine đuôi dung hợp lên biểu tiết trình tinh chế tiến hành B subtilis cách sử dụng gen thị celB Gen thị celB mã hóa cho protein Endoglucanase B (CelB), thành phần chủ yếu phức hệ Cellulosome có nguồn gốc từ C thermocellum Trong nghiên cứu công bố, CelB sử dụng làm thị để khảo sát khả biểu tiết plasmid pHT43 mang promoter Pgrac212 B subtilis (Phan, 2007) Bên cạnh đó, chủng chủ B subtilis sử dụng là chủng vi sinh vật mơ hình cho biểu ngoại bào, FDA công nhận GRAS (Generally Regarded As Safe), khơng sinh nội độc tố có khả biểu tiết lên đếm 20-25 g/l dịch lên men (Schallmey, Singh, & Ward, 2004) Vật liệu & Phương pháp 2.1 Vật liệu Chủng E coli OmniMAX (InvitrogenTM), Chủng B subtilis 1012 tự nhiên, chủng B subtilis WB800N (Bảng 1); plasmid pHT1253, pHT1254, pHT1255, pHT43, pNDH37celB (Bảng 2), mồi đặc hiệu (Bảng 3) cung cấp Trung tâm Khoa học Công nghệ Sinh học 324 Tạp chí Khoa học Trường ĐHSP TPHCM Lê Dương Vương tgk Bảng Các chủng chủ để tạo dòng biểu Chủng chủ Đặc điểm gen (F′ {proAB+ lacIq lacZΔM15 Tn10(TetR) Δ(ccdAB)} mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) E coli OmniMAX φ80(lacZ)ΔM15 Δ(lacZYA-argF) U169 endA1 recA1supE44 thi-1 gyrA96 relA1 tonA panD) B subtilis 1012 leuA8 metB5 trpC2 hsdRM1 nprE aprE epr bpr mpr :: ble nprB :: bsr vpr wprA B subtilis ::hyg cm :: neo; NeoR) bị đột biến protease WB800N ngoại bào Sử dụng Tạo dòng Biểu protein Biểu protein Mơi trường Luria Broth (LB) sử dụng để nuôi cấy chủng với kháng sinh thích hợp Ampicillin (Amp) nồng độ cuối 100 µg/ml Chloramphenicol (Cm) nồng độ cuối 10 µg/ml Bảng Các plasmid dùng nghiên cứu Plasmid pHT1283 pHT1284 pHT1285 pHT43 pNDH37celB pHT1253 pHT1254 pHT1255 Cấu trúc Pgrac-ssAmyQ-celB-GSHGHHHHH Pgrac-ssAmyQ-celB-GSHGHSHHH Pgrac-ssAmyQ-celB-GSHGHSHGH Pgrac-ssAmyQ Pgrac-ssAmyQ-MCS-GSHGHHHHH Pgrac-ssAmyQ-MCS-GSHGHSHHH Pgrac-ssAmyQ-MCS-GSHGHSHGH Mục tiêu sử dụng Nghiên cứu Nghiên cứu Nghiên cứu Chứng âm Thu gen celB (T T P Phan, Nguyen, & Schumann, 2006) Tạo pHT1283 Tạo pHT1284 Tạo pHT1285 Bảng Các Primer (trình tự mồi) dùng nghiên cứu Tên Primer Cấu trúc Primer Mục tiêu sử dụng ON917 AGCATCAGCAGGATCCGAAGGGTCA TATGCTGATTTGG ON918B TGTCCATGTGATCCGCTTTTATACGG CAACTCACTTATGCTACGC ON653 ON707 ON314 ACCGGAATTAGCTTGGTACCAGCTAT TG AAAGGAGGAAGGATCAATGAGAGG AAGCA TGTTTCAACCATTTGTTCCAGGT 325 Thu gen celB Thu gen celB PCR kiểm tra cho pHT1284, pHT1285 PCR kiểm tra cho pHT1284, pHT1285 Giải trình tự cho pHT1284, pHT1285 Giải trình tự cho pHT1284, pHT1285 pHT1283, pHT1283, pHT1283, pHT1283, Tạp chí Khoa học Trường ĐHSP TPHCM Tập 16, Số (2019): 323-334 2.2 Phương pháp 2.2.1 Thiết kế vector biểu CelB với đuôi dung hợp His-tag Đầu tiên, gen celB thu nhận phản ứng PCR từ plasmid pNDH37-celB với cặp mồi ON917/ON918B (Bảng 3) Pfu polymerase Sản phẩm PCR cắt đồng thời với ba plasmid khn pHT1253, pHT1254, pHT1255 (có sẵn trình tự tín hiệu tiết sSamyQ nằm đầu N vùng MCS chứa trình tự mã hóa dung hợp có từ đến Histidine) (Bảng 2) enzyme cắt giới hạn BamHI/AatII Các sản phẩm cắt plasmid khuôn nối với gen celB T4 DNA ligase để tạo plasmid mục tiêu pHT1283, pHT1284, pHT1285 (có cấu trúc Bảng 2) Các sản phẩm nối biến nạp vào E coli OmniMAX phương pháp hóa biến nạp (Phan, Huynh, Truong, & Nguyen, 2017) sàng lọc mơi trường LB-Agar có Amp (100 µg/ml) Các dòng E coli OmniMAX chứa plasmid mục tiêu kiểm tra phương pháp PCR khuẩn lạc với cặp mồi ON653/ON918B (Bảng 3) Taq polymerase Các plasmid mục tiêu thu nhận, tách chiết từ dòng E coli OmniMAX có kết PCR dương tính gửi giải trình tự với cặp mồi ON707/ ON314 (Bảng 3) Cơng ti Macrogen.Inc (Hàn Quốc) Các plasmid cho trình tự tương đồng với kết lí thuyết 100 % biến nạp vào chủng biểu B subtilis 1012 B subtilis WB800N (Bảng 1) theo quy trình biến nạp tự nhiên B subtilis (Phan et al., 2017) 2.2.2 Kiểm tra biểu tiết CelB mơi trường rắn Các dòng B subtilis 1012 B subtilis WB800N chứa plasmid mục tiêu pHT1283, pHT1284, pHT1285 chứng âm pHT43 cấy sang đĩa thạch LB-CmAgar chứa CMC 0,5% có nồng độ cảm ứng IPTG khác (0 mM; 0,001 mM; 0,01 mM; 0,1 mM; 0,5 mM mM) Các đĩa khảo sát ủ 30°C 36 Sau đó, sử dụng thuốc thử Congo Red 1% để kiểm tra hoạt tính endoglucanase B dựa vòng phân giải CMC vùng đĩa thạch có chất CMC bị phân hủy CelB không bắt màu với dung dịch Congo Red 1% 2.2.3 Kiểm tra biểu tiết CelB môi trường lỏng Các chủng dùng khảo sát tiến hành nuôi elern chứa 20 ml môi trường LB-Cm đến OD600 nm đạt giá trị từ 0,8-1 tiến hành cảm ứng biểu protein IPTG Mẫu protein CelB thu nhận dịch sau li tâm 13000 xg 10 phút Các thông số tiến hành khảo sát bao gồm: (i) nhiệt độ nuôi cấy 30oC & 37oC; (ii) Nồng độ chất cảm ứng IPTG: 0; 0,01; 0,1;1 mM; (iii) Thời gian thu mẫu sau cảm ứng: 2, 4, 6, 8, 10 Sự biểu tiểt CelB đánh giá phương pháp đo hoạt tính DNS (dinitrosalicylic acid assay) Phương pháp đo hoạt tính DNS Hoạt tính endoglucanase CelB đo theo quy trình biến đổi từ quy trình chuẩn IUPAC dựa lượng đường khử tạo so sánh với đường chuẩn 326 Tạp chí Khoa học Trường ĐHSP TPHCM Lê Dương Vương tgk glucose (Mandels, Andreotti, & Roche, 1976) 250 µl chất CMC pha đệm phosphate ủ với 250 µl dịch enzyme 55oC, eppendorf Sau đó, 500 µl DNS 1% thêm vào eppendorf, tiếp tục ủ nhiệt 95oC phút để ngừng phản ứng cắt enzyme xác định giá trị OD540 nm (giá trị thể số gốc đường khử sau phản ứng thủy phân CelB) Số gốc đường khử trước phản ứng thủy phân (trong môi trường nuôi cấy hay chất CMC) xác định phương pháp tương tự sử dụng với mẫu Blank tương ứng (dịch enzyme bất hoạt cách ủ 950C 10 phút) Số lượng glucose tương ứng với số gốc đường khử tạo phản ứng thủy phân CelB với chất CMC xác định tính tốn dựa hiệu OD540 nm giá trị ODBlank tương ứng đường chuẩn đường khử xây dựng dựa giá trị OD540 nm nồng độ glucose khác theo phương pháp DNS Lượng đường khử (mg/ml) thu nhận quy đổi đơn vị hoạt tính enzyme (IU) theo định nghĩa: lượng enzyme cần thiết để tạo 0,18 µg (ứng với nmol) đường khử glucose tương đương phút IU = μmol glucose/min = 0,18 mg/min Do tỉ lệ enzyme: CMC 1: nên áp dụng công thức ta có: mg glucose/ml = 0,0925 IU (do ủ 60 phút) = 92,5 mIU (Mandels et al., 1976), (Eveleigh, Mandels, Andreotti, & Roche, 2009) 2.2.4 Tinh chế với hạt Ni-NTA Áp dụng kết khảo sát, enzyme CelB dung hợp đuôi Histidine biểu với điều kiện tối ưu tiến hành tinh chế với hạt Ni-NTA để khẳng định khả tinh chế đuôi His dung hợp, đồng thời để kiểm tra tính số lượng His đuôi dung hợp plasmid Protein CelB gắn lên hạt Ni-NTA dựa lực đuôi Histidine với Ni2+ Dịch protein (1 ml) thêm vào eppendorf có chứa 200 µl hạt Ni-NTA lắ c tốc độ 100 vòng/phút 30 phút Sau đó, mẫu li tâm 7000 xg phút để loại dịch Các protein tạp khơng có Histidine (khơng có khả gắn vào hạt Ni-NTA) sót lại đươc loại bỏ phương pháp rửa mẫu với ml dung dịch EBW (30 mM Tris-HCl pH 8,0; 500 mM NaCl) Lắc nhẹ tốc độ 100 vòng/phút 30 phút Li tâm 7000 xg phút, loại dịch Công đoạn rửa thực lần Protein CelB có gắn đuôi Histidine đươc thu nhận cách sử dụng buffer dung li 500 µl dung dịch EBW có nồng độ imidazole mM, 10 mM, 20 mM, 40 mM, 80 mM 250 mM Lắc tốc độ 100 vòng/phút 30 phút Li tâm 7000 xg phút, thu dịch Phân tích mẫu protein dung li phân đoạn phương pháp đo hoạt tính DNS 2.2.5 Xử lí số liệu Các thí nghiệm đo hoạt tính lặp lại lần Các kiểm định ANOVA chiều thực phần mềm Minitab17 327 Tạp chí Khoa học Trường ĐHSP TPHCM Tập 16, Số (2019): 323-334 Kết biện luận 3.1 Tạo dòng vector chủng B subtilis biểu CelB có dung hợp Histidine Sau sàng lọc môi trường LB có kháng sinh, dòng tế bào E coli OmniMax mang plasmid pHT1283, pHT1284, pHT1285 kiểm tra phương pháp PCR khuẩn lạc với cặp mồi ON653 ON918B Kết điện di gel Agarose sản phẩm PCR (Hình 2) cho thấy plasmid chọn khuẩn lạc có vạch tương đồng với kích thước lí thuyết 1769 bp Hình Kết PCR sàng lọc dòng E coli OmniMAX mang pHT1283, pHT1284, pHT1285 cặp mồi đặc hiệu ON653/ ON918B Các dòng E coli OmniMAX có kết PCR dương tính nuôi tăng sinh để tách chiết plasmid giải trình tự Kết giải trình tự (dữ liệu khơng trình bày) tương đồng 100% với trình tự lí thuyết, chứng tỏ tạo dòng plasmid pHT1283, pHT1284, pHT1285 với vùng trình tự celB có gắn trình tự tinh chế Histidine Các plasmid biến nạp vào chủng B subtilis 1012 WB800N để tiến hành thí nghiệm 3.2 Kết kiểm tra biểu tiết CelB mơi trường rắn Phương pháp tạo vòng phân giải CMC với thuốc nhuộm Congo Red phương pháp đơn giản để phát khả tiết protein thuộc nhóm cellulase chủng vi sinh vật Vòng phân giải lớn cho thấy chủng tiết protein có hoạt tính glucanse mơi trường nhiều Kết thí nghiệm cho thấy (Hình 3), so với chứng âm, hai chủng khảo sát với tất plasmid tái tổ hợp cho vòng phân giải CMC lớn Vòng phân giải nhỏ xung quanh chứng âm giải thích có tồn lượng nhỏ enzyme có hoạt tính glucanase hệ protein chủng B subtilis tự nhiên 328 Tạp chí Khoa học Trường ĐHSP TPHCM Lê Dương Vương tgk Hình Kết khảo sát khả biểu tiết CelB môi trường rắn hai chủng chủ B subtilis 1012 WB800N chứa plasmid pHT1283, pHT1284, pHT1285, pHT43 (chứng âm) Bên cạnh đó, đường kính vòng phân giải khuẩn lạc mang ba plasmid mục tiêu pHT1283, pHT1284, pHT1285 đạt tối đa nồng độ 0,001 mM 0,01 mM Ở nồng độ lại, đường kính khuẩn lạc vòng phân giải giảm dần, ngược chiều với gia tăng nồng độ IPTG Đối với chủng B subtilis chứa plasmid mục tiêu, nồng độ từ 0,1 mM trở lên, quan sát khuẩn lạc nhỏ không tồn khuẩn lạc Điều cho thấy, gia tăng tiết CelB tăng nồng độ IPTG ảnh hưởng mạnh đến phát triển tế bào B subtilis 3.3 Kết kiểm tra biểu tiết CelB môi trường lỏng Các kết đo hoạt tính CelB xác định phương pháp DNS với tất điều kiện nhiệt độ (30oC 37oC), nồng độ IPTG cảm ứng (0; 0,01; 0,1; mM), thời gian thu mẫu (2, 4, 6, 8, 10 sau cảm ứng) (dữ liệu khơng trình bày) dùng để xác định điều kiện tối ưu để biểu CelB chủng B subtilis 1012 B subtilis WB800N mang ba plasmid mục tiêu: pHT1283, pHT1284, pHT1285 Hình Hoạt tính cellulase từ dịch chiết môi trường nuôi cấy chủng chủ B subtilis 1012 WB800N chứa plasmid pHT1283, pHT1284, pHT1285, pHT43 (-) 329 Tạp chí Khoa học Trường ĐHSP TPHCM Tập 16, Số (2019): 323-334 Kết hoạt tính mẫu enzyme (Hình Bảng 4) mức chấp nhận (hơn hẳn chứng âm chứa pHT43) cho thấy có biểu CelB B subtilis 1012 so với B subtilis WB800N Sử dụng kiểm định ANOVA chiều chương trình Minitab17 với Ho: khơng có khác biệt B subtilis 1012 B subtilis WB800N (nghĩa chủng chủ không ảnh hưởng đến khả biểu tiết CelB), H: biểu CelB B subtilis 1012 lớn B subtilis WB800N nhận giá trị P= 0,000 < 0,05 (tức sai số 5%), tức bác bỏ giả thuyết Ho Điều có nghĩa mặt thống kê độ tin cậy 95% biểu CelB B subtilis 1012 có khác biệt mạnh B subtilis WB800N Bảng Kết hoạt tính CelB tiến hành khảo sát môi trường lỏng hai chủng chủ B subtilis 1012 WB800N chứa plasmid pHT1283, pHT1284, pHT1285, pHT43 (chứng âm) Chủng chủ Plasmid pHT1283 B subtilis pHT1284 1012 pHT1285 pHT43 pHT1283 pHT1284 B subtilis WB800N pHT1285 pHT43 Nhiệt độ 37oC 37oC 37oC 37oC 37oC 37oC 37oC 37oC IPTG (mM) 0,1 0,01 0,01 0,1 0,1 0,01 0,1 0,1 Thời gian cảm ứng (giờ) 10 8 10 Hoạt tính (mIU) Mức xếp hạng Turkey ‘s * 61,36 ± 1,17 66,33 ± 0,33 67,51 ± 2,17 14,12 ± 2,5 47,57 ± 0,97 54,3 ± 1,5 58,06 ± 0,66 11,15 ± 0,28 B A A E D C BC** E *: dựa phân tích ANOVA chiều **BC: nghĩa vừa thuộc mức B vừa thuộc mức C Bên cạnh đó, dựa vào kết thu (Hình Bảng 4), ta phân tích mức độ ảnh hưởng số lượng Histidine đuôi dung hợp lên khả biểu CelB B subtilis Tiến hành phân tích ANOVA chiều với kiểm định Turkey sai số thiết lập α = % Giả thiết thiết lập với Ho: khác biệt hoạt tính mẫu protein dung hợp, H1: có khác biệt hoạt tính mẫu protein dung hợp, Ho bị bác bỏ giá trị P < α=0,05; * giá trị trung bình nằm khoảng biến thiên giá trị hoạt tính đo Kết phân tích cho thấy P=0,000 nhỏ 0,01 chứng tỏ giả thuyết H1 chấp nhận Điều có nghĩa có khác biệt hoạt tính mẫu protein dung hợp, chứng tỏ ảnh hưởng số lượng Histidine (từ đến 6) đuôi dung hợp lên tiết CelB khác Theo kiểm định Tukey HSD, biến lớn xếp khoảng giá trị A, nhỏ với B, C, D… Kiểm định xây dựng cách so sánh giá trị trung bình biến với Hai biến nằm khoảng giá trị khác trị tuyệt đối hiệu giá trị trung bình biến lớn 330 Tạp chí Khoa học Trường ĐHSP TPHCM Lê Dương Vương tgk giá trị qcrit MSw/n với MSw phương sai trung bình biến, n số giá trị biến, qcrit xác định bảng phân phối Student Giá trị qcrit phụ thuộc vào giá trị sai số α, số biến phân tích k, giá trị n (do bậc tự bảng phân phối Student df = n-k) Kết phân tích (Bảng 4) cho thấy, với sai số 5%, mẫu CelB-4His biểu pHT1285 mẫu CelB-5His biểu pHT1284 cho biểu vượt trội mức A (ở B subtilis 1012) mức C (ở B subtilis WB800N) Còn mẫu CelB-6His, kết hoạt tính thu đạt mức thấp ba loại mẫu chứa protein dung hợp (loại B với B subtilis 1012 loại D B subtilis WB800N) Điều chứng tỏ ảnh hưởng số lượng Histidine (từ 4-5) lên biểu tiết Endoglucanase B tương đương 6His có tác động làm giảm tiết CelB nhiều ba loại dung hợp Trong đó, chủng chứng âm chứa pHT43 xếp bậc nhỏ loại E chủng chủ 3.4 Kết tinh chế với hạt Ni-NTA Quá trình tinh chế cho thấy protein tái tổ hợp CelB có gắn Histidine có khả gắn hạt Ni-NTA, chứng tỏ sử dụng liên kết Ni2+ Histidine để thu CelB tinh Các kết đo hoạt tính (tính theo % dịch ban đầu) phân đoạn trình tinh chế CelB hạt Ni-NTA biểu thị Hình Trong phân đoạn gắn CelBHis với hạt Ni-NTA, kết cho thấy hoạt tính endoglucanse dịch (phân đoạn Flowrough) mẫu protein có 4His (từ pHT1285) lớn mẫu protein có 5His (pHT1284), mẫu có dung hợp 6His (pHT1283) cho hoạt tính thấp chứng tỏ mẫu CelB-6His cho khả bám hạt Ni-NTA lớn mẫu CelB-5His, thấp mẫu CelB4His Kết phù hợp với kết lí thuyết dung hợp có số lượng His khả bám hạt kém, hoạt tính enzyme dịch Flowthrough cao Kết cho thấy thất thoát khả bám protein dung hợp đuôi 4His > 5His> 6His Trong đó, mẫu CelB-6His cho thất thấp 5% mẫu CelB-5His cho thất thoát lớn 10% lớn 15% mẫu CelB-4His, Trong phân đoạn li giải với nồng độ imidazole khác mẫu CelB có dung hợp 4His (biểu bới pHT1285) tập trung li giải nồng độ 20 mM 40 mM Mẫu CelB có dung hợp 5His (biểu pHT1284) dung li chủ yếu nồng độ 40 60 mM Protein CelB có dung hợp 6His (biểu bới pHT1283) dung li chủ yếu nồng độ 60 80 mM Các kết giúp khẳng định thêm tính liên kết tăng dần mẫu protein với hạt Ni-NTA tăng số lượng Histidine (từ 4-6) đuôi dung hợp polyhistidine 331 Tạp chí Khoa học Trường ĐHSP TPHCM Tập 16, Số (2019): 323-334 Hình Kết hoạt tính CelB thu phân đoạn trình tinh chế protein dung hợp Ni-NTA Kết luận Kết nghiên cứu cho thấy: để biểu CelB ngoại bào B subtilis, chủng B subtilis 1012 phù hợp chủng WB800N Đi dung hợp 4His có ảnh hưởng tốt (mức A) lên biểu CelB so sánh với dung hợp lại Ngược lại, kết tinh chế CelB với hạt Ni-NTA cho thấy đuôi 6His cho liên kết tốt đuôi 5His, 4His có liên kết Cho nên, kết luận tùy vào đặc điểm protein mục tiêu ta có lựa chọn khác dung hợp: protein khó biểu nên sử dụng 4His, 5His để có biểu tiết cao; protein dễ biểu hiện, nên sử dụng 6His để có liên kết tốt với Ni-NTA, giảm rủi ro bị lẫn với protein tạp chứa trình tự nhiều Histinde tế bào chủng chủ giảm thất thoát tinh chế Nghiên cứu cung cấp cách tiếp cận tảng cho việc nghiên cứu ảnh hưởng số lượng Histidine lên biểu protein tái tổ hợp Trong tương lai, nhóm chúng tơi tiếp tục tiến hành khảo sát ảnh hưởng số lượng Histidine đuôi dung hợp lên biểu tiết Cellulase khác CelS, CelD… hay biểu nội bào với protein thị GFP, BgaB… Tuyên bố quyền lợi: Các tác giả xác nhận hồn tồn khơng có xung đột quyền lợi Lời cảm ơn: Cảm ơn Trung tâm Khoa học Công nghệ sinh học – Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – ĐHQG TPHCM tạo điều kiện cho nhóm tác giả hồn thành đề tài 332 Tạp chí Khoa học Trường ĐHSP TPHCM Lê Dương Vương tgk TÀI LIỆU THAM KHẢO Block, H., Maertens, B., Spriestersbach, A., Brinker, N., Kubicek, J., Fabis, R.,… & Schäfer, F (2009) Immobilized-metal affinity chromatography (IMAC): a review Methods in Enzymology, 463, 439-473 https://doi.org/10.1016/S0076-6879(09)63027-5 Bornhorst, J A., & Falke, J J (2000) Purification of proteins using polyhistidine affinity tags Methods in Enzymology, 326, 245-254 Eveleigh, D E., Mandels, M., Andreotti, R., & Roche, C (2009) Measurement of saccharifying cellulase Biotechnology for Biofuels, 2, 21 https://doi.org/10.1186/1754-6834-2-21 Goel, A., Colcher, D., Koo, J S., Booth, B J., Pavlinkova, G., & Batra, S K (2000) Relative position of the hexahistidine tag effects binding properties of a tumor-associated single-chain Fv construct Biochimica Et Biophysica Acta, 1523(1), 13-20 Mandels, H., Andreotti, M R., & Roche, C (1976) Measurement of saccharifying cellulase Biotechnology and Bioengineering Symposium, 16, 21-33 Phan, T., Huynh, P., Truong, T., & Nguyen, H (2017) A Generic Protocol for Intracellular Expression of Recombinant Proteins in Bacillus subtilis Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J.), 1586, 325-334 https://doi.org/10.1007/978-1-4939-6887-9_21 Phan, T P T (2007) Construction and analysis of novel controllable expression vectors for Bacillus subtilis (Doctoral thesis) Retrieved from https://epub.uni-bayreuth.de/728/ Phan, T T P., Nguyen, H D., & Schumann, W (2006) Novel plasmid-based expression vectors for intra- and extracellular production of recombinant proteins in Bacillus subtilis Protein Expression and Purification, 46(2), 189-195 https://doi.org/10.1016/j.pep.2005.07.005 Schallmey, M., Singh, A., & Ward, O P (2004) Developments in the use of Bacillus species for industrial production Canadian Journal of Microbiology, 50(1), 1-17 https://doi.org/10.1139/w03-076 Terpe, K (2003) Overview of tag protein fusions: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems Applied Microbiology and Biotechnology, 60(5), 523-533 https://doi.org/10.1007/s00253-002-1158-6 Waugh, D S (2005) Making the most of affinity tags Trends in Biotechnology, 23(6), 316-320 https://doi.org/10.1016/j.tibtech.2005.03.012 333 Tạp chí Khoa học Trường ĐHSP TPHCM Tập 16, Số (2019): 323-334 THE IMPACT OF THE AMOUNT OF HISTIDINE IN C-TERMINAL FUSIONTAG ON THE SECRETION OF ENDOGLUCANASE B IN BACILLUS SUBTILIS Le Duong Vuong1,2, Dang Thi Kim Ngan1 Truong Thong1, Phan Thi Phuong Trang1, Nguyen Duc Hoang1* University of Science – Vietnam National University in Ho Chi Minh City Industrial University of Ho Chi Minh City * Corresponding author: Nguyen Duc Hoang – Email: ndhoang@hcmus.edu.vn Received: May 29, 2019; Revised: June 22, 2019; Accepted: July 11, 2019 ABSTRACT In this research, the host cell Bacillus subtilis and the reporter gene celB were used for evaluating the impact of the amount of histidine in C-terminal fusion tag on the secretion of Endogucanase B The results show that B subtilis 1012 is more appropriate for secreting CelB than B subtilis WB800N Among three kinds of His tag (4His, 5His, 6His), 6His tag has the most impacts on decreasing the secretion of CelB In contrast, the surveying of binding capacity of these proteins demonstrates that CelB-6His has the best binding capacity and the fewest leakage (4.78%) while CelB-4His has the most leakage (16.1%) in purifying process by Ni-NTA Keywords: Bacillus subtilis, Histidine, Endoglucanse B, Pgrac212, fusion tag 334 ... thấy: để biểu CelB ngoại b o B subtilis, chủng B subtilis 1012 phù hợp chủng WB800N Đi dung hợp 4His c ảnh hưởng tốt (m c A) lên biểu CelB so sánh với dung hợp lại Ngư c lại, kết tinh chế CelB với... nghiên c u Tên Primer C u tr c Primer M c tiêu sử dụng ON917 AGCATCAGCAGGATCCGAAGGGTCA TATGCTGATTTGG ON91 8B TGTCCATGTGATCCGCTTTTATACGG CAACTCACTTATGCTACGC ON653 ON707 ON314 ACCGGAATTAGCTTGGTACCAGCTAT... Trong nghiên c u này, ảnh hưởng số lượng Histidine đuôi dung hợp lên biểu tiết trình tinh chế tiến hành B subtilis c ch sử dụng gen thị celB Gen thị celB mã hóa cho protein Endoglucanase B (CelB),