Đang tải... (xem toàn văn)
Bài báo trình bày kết quả đánh giá các giống lúa cạn được sưu tập ở hai tỉnh Cao Bằng và Bắc Kạn và sử dụng kỹ thuật RAPD để phân tích tính đa dạng di truyền của các giống lúa cạn này ở mức phân tử, tiến tới xác định một số chỉ thị phân tử của cây lúa cạn.
28(2): 50-56 6-2006 Tạp chí Sinh học thành phần hóa sinh hạt đa dạng di truyền số giống lúa cạn địa phơng hai tỉnh Cao Bằng Bắc kạn Chu Hoàng Mậu, Phạm Thị Thu Nga Đại học Thái Nguyên Cây lúa cạn nguồn cung cấp lơng thực quan trọng chỗ ngời dân miền núi Tính đến nay, diện tích trồng lúa cạn chiếm 7,5% diện tích trồng lúa nớc đợc phân bố chủ yếu tỉnh miền núi phía Bắc, vùng Tây Nguyên, vùng Duyên hải Trung Lúa cạn cho suất không cao nhng có nhiều đặc tính u việt nh có khả chống chịu hạn tốt, kháng sâu bệnh; cứng không bị lốp đổ, gieo trồng nhiều địa hình khác nhau; hạt gạo ngon, cơm thơm, dẻo Hiện nay, phát triển sản xuất nông lâm nghiệp miền núi, tập đoàn giống lúa cạn có nguy bị thoái hóa dần, nhu cầu xã hội xuất lại cần có nhiều giống lúa có chất lợng cao Điều kiện thời tiết diễn biến theo hớng bất lợi cho trồng nói chung lúa cạn nói riêng; đất bị thoái hóa sói mòn; hạn hán xảy vùng nào, vào thời điểm năm Do vậy, đòi hỏi phải có giống lúa cạn thích hợp với địa hình hạn hán xảy vùng núi Việc nghiên cứu, khai thác đặc tính chịu hạn lúa hớng đợc nhiều tác giả đề cập tới khía cạnh khác nh chất hóa sinh, sinh học phân tử tính chịu hạn, xác định thị phân tử cho đặc tính [8, 9] Trong công bố trớc, trình bày kết su tập, đánh giá nghiên cứu giống lúa cạn mục tiêu bảo tồn khai thác nguồn gien giống lúa cạn miền núi [4] Bài báo tiếp tục trình bày kết đánh giá giống lúa cạn đợc su tập hai tỉnh Cao Bằng Bắc Kạn sử dụng kỹ thuật RAPD (Random Amplified Polymorphic ADN) để phân tích tính đa dạng di truyền giống lúa cạn mức phân tử, tiến tới xác định số thị phân tử lúa cạn 50 I phơng pháp nghiên cứu Sử dụng 18 giống lúa cạn đợc su tập hai tỉnh Cao Bằng Bắc Kạn làm vật liệu nghiên cứu Xác định hàm lợng protein theo phơng pháp Lowry, định lợng lipit theo phơng pháp chiết ête dầu hỏa 4oC; xác định hoạt độ enzim -amylaza theo phơng pháp Heilken [1]; đơn vị hoạt ®é cđa enzim ®ù¬c tÝnh b»ng sè mg tinh bét bị phân giải sau 30 phút nhiệt độ 30oC (ĐVHĐ/mg) Tách chiết ADN tổng số theo phơng pháp Foolad cs (1995) [3] từ mầm, từ mầm nuôi môi trờng MS Nguyên liệu đợc nghiền nhanh nitơ lỏng, sử dụng đệm chiết CTAB 1,5% (1,5% CTAB + 100 mµ tris-HCl pH 8,0 + 20 mµ EDTA) Phản ứng RAPD với mồi ngẫu nhiên RA31, RA36, RA45, RA46 RA142 đợc sử dụng để phân tích genom 12 giống lúa cạn Phản ứng RAPD đợc thực 25 àl dung dịch chứa 1X ®Ưm PCR; 2,5 mM MgCl2; 100 µl dNTP; 200 mM đoạn mồi; 0,125 đơn vị Taq polymeraza 5-10 ng ADN mẫu Tiến hành nhân máy PCRThermal cycler PTC 100 theo chu tr×nh: b−íc 1: 94oC phót; b−íc 2: 92oC phót; b−íc 3: 36oC phót; b−íc 4: 72oC phót; b−íc 5: 72oC phót; b−íc 6: gi÷ ë 4oC Từ bớc đến bớc 4, lặp lại 45 chu kỳ Sản phẩm phản ứng RAPD đợc phân tích điện di gel agaroza 1,8% đệm TAE 1X, sau ®ã nhuém gel b»ng ethidium bromit 0,5 mg/ml chụp ảnh dới ánh sáng đèn cực tím Phân tÝch sè liƯu RAPD dùa trªn sù xt hiƯn hay biến phân đoạn ADN điện di sản phẩm RAPD Các số liệu đợc xử lý máy vi tính theo chơng trình NTSYSpc Version 2.0 (Applied biostatisticsInc., USA, 1998) để so sánh khác mức phân tử xác định mối quan hệ di truyền giống lúa cạn II Kết nghiên cứu Kết su tập giống lúa cạn hai tỉnh Cao Bằng Bắc Kạn Công tác thu thập giống lúa cạn đợc thực từ tháng 8/2003 đến tháng 12/2003 hai tỉnh Cao Bằng Bắc Kạn Kết phân tích đánh giá đợc trình bày bảng Chúng su tập đợc 18 giống lúa cạn, có giống lúa nếp, 11 giống lúa tẻ Các giống lúa cạn đợc tiến hành phân loại theo tiêu chuẩn IRRI [5, 6] xác định đợc giống thc loµi phơ japonica, 13 gièng thc loµi phơ indica Kết bảng cho thấy trọng lợng 1000 hạt 18 giống lúa cạn dao động khoảng 21,49 ± 0,09 g - 31,54 ± 0,16 g B¶ng Phân loại trọng lợng hạt 18 giống lúa cạn Cao Bằng Bắc Kạn STT 10 11 12 13 14 15 16 17 18 MÉu h¹t Cb1 Cb2 Cb3 Cb4 Cb5 Cb6 Cb7 Cb8 Bc9 Bc10 Bc11 Bc12 Cb13 Cb14 BC15 BC16 Bc17 Bc18 Tên loài phụ indica indica indica indica japonica indica indica indica japonica indica indica japonica japonica japonica indica jndica indica indica Tên địa phơng Khẩu Chét Khẩu Chất Khẩu Muvai Khẩu Văn Khẩu Chăn Vảu Khẩu Cằn Cứu Khẩu Lùm Phua Khẩu Tùm Doàng Nếp vàng Mố Hái Khẩu Phết Mố Tạ Khẩu Pét Nếp nơng Tẻ Cẩm Nếp Cẩm Khẩu Nua Han Khẩu Càng Cua Thành phần hóa sinh hạt giống lúa cạn nghiên cứu Kết phân tích hàm lợng protein lipit hạt 18 giống lúa cạn (bảng 2) cho thấy hàm lợng protein chúng dao động khoảng 4,83 0,02% - 8,91 ± 0,01% Hai gièng lóa nÕp vµng vµ Muvai có hàm lợng protein cao (8,91 0,01% vµ 8,67 ± 0,04%), thÊp nhÊt lµ gièng khÈu Tùm Doàng (4,83 0,02%) Theo Lê Doãn Diên cs [2] hàm lợng protein hạt gạo nếp cao hạt gạo Nơi lấy mẫu Cao Bằng Cao B»ng Cao B»ng Cao B»ng Cao B»ng Cao B»ng Cao Bằng Cao Bằng Bắc Kạn Bắc Kạn Bắc Kạn Bắc Kạn Cao Bằng Cao Bằng Bắc Kạn Bắc Kạn Bắc Kạn Bắc Kạn Nếp/tẻ Nếp Tẻ Nếp Tẻ Tẻ Nếp TỴ TỴ NÕp TỴ TỴ TỴ TỴ NÕp TỴ NÕp Nếp Tẻ Trọng lợng 1000 hạt (g) 29,05 0,09 27,69 ± 0,40 24,37 ± 0,17 27,63 ± 0,26 28,27 ± 0,40 25,74 ± 0,22 28,37 ± 0,13 25,18 ± 0,33 31,54 ± 0,16 30,85 ± 0,09 29,09 ± 0,29 21,49 ± 0,09 28,31 ± 0,20 29,99 ± 0,25 24,97 ± 0,04 26,37 ± 0,12 30,87 ± 0,20 23,29 ± 0,19 tẻ, hàm lợng protein hạt gạo lúa cạn cao hạt gạo lúa nớc; hàm lợng protein chủ yếu khoảng 5,29-12,84% Đối chiếu với kết nghiên cứu giống lúa cạn hai tỉnh Cao Bằng Bắc Kạn có hàm lợng protein nằm khoảng dao động giống lúa Việt Nam, hàm lợng protein hạt gạo nếp cao hạt gạo tẻ Protein gạo không cao nhng có tỷ lệ axit amin cân đối có giá trị mặt đinh dỡng Tùy theo giống lúa, hàm lợng protein dao động khoảng 4,83-8,91% trọng lợng khô 51 Lợng protein tích lũy hạt đợc kết hợp với phôi mầm phôi nhũ có vai trò quan trọng trình phát triển phôi giai đoạn nảy mầm non [7] Hàm lợng lipit liên quan đến chất lợng hạt gạo hai phơng diện giá trị dinh STT 10 11 12 13 14 15 16 17 18 dỡng chất lợng bảo quản hạt thóc, hàm lợng lipit cao sử dụng cơm có độ dẻo lớn, nhng bảo quản khó, để lâu chất lợng giảm, hàm lợng lipit hạt 18 giống lúa cạn chiếm tỷ lệ 1,82-3,91 (% trọng lợng khô) [4] Bảng Hàm lợng protein lipit hạt 18 giống lúa cạn Cao Bằng Bắc Kạn (% trọng lợng hạt khô) Mẫu hạt Hàm lợng lipit (%) Hàm l−ỵng protein (%) Cb1 4,43 ± 0,16 7,97 ± 0,24 Cb2 1,82 ± 0,03 6,93 ± 0,10 Cb3 3,59 ± 0,09 8,67 ± 0,04 Cb4 3,57 ± 0,20 5,52 ± 0,20 Cb5 2,40 ± 0,01 5,12 ± 0,01 Cb6 4,53 ± 0,17 8,10 ± 0,07 Cb7 3,58 ± 0,09 6,25 ± 0,02 Cb8 3,74 ± 0,11 4,83 ± 0,02 Bc9 3,91 ± 0,11 8,91 ± 0,01 Bc10 3,44 ± 0,16 5,33 ± 0,02 Bc11 2,59 ± 0,11 6,65 ± 0,02 Bc12 3,24 ± 0,06 7,01 ± 0,06 Cb13 2,69 ± 0,21 6,02 ± 0,12 Cb14 3,85 ± 0,03 8,23 ± 0,19 Bc15 2,09 ± 0,08 6,63 ± 0,19 Bc16 3,47 ± 0,18 8,29 ± 0,26 Bc17 2,29 ± 0,18 7,67 ± 0,24 Bc18 2,33 ± 0,19 5,10 ± 0,12 B¶ng Hoạt độ -amylaza 12 giống lúa cạn Cao Bằng Bắc Kạn giai đoạn hạt nảy mầm STT 10 11 12 52 MÉu h¹t Cb2 Cb3 Cb5 Cb6 Cb7 Cb8 Bc9 Bc10 Bc11 Bc12 Bc17 Bc18 Tỷ lệ nảy mầm hạt (%) 98,33 97,00 98,00 96,33 98,67 96,00 96,67 97,33 96,67 98,00 97,67 98,33 Ho¹t ®é cđa enzim α-amylaz (§VH§/mg) 0,13 ± 0,012 0,12 ± 0,018 0,14 ± 0,024 0,11 ± 0,013 0,16 ± 0,010 0,05 ± 0,014 0,10 ± 0,008 0,12 ± 0,026 0,06 ± 0,022 0,13 ± 0,012 0,12 ± 0,008 0,14 ± 0,036 Ngoài chất lợng gạo, lúa cạn có đặc điểm u việt có khả chịu hạn cao Tiếp cận với hớng nghiên cứu này, tiến hành phân tích hoạt độ enzim amylaza giai đoạn hạt nảy mầm ngày tuổi Enzim -amylaza có chức phân giải tinh bột, tạo thành đờng mantoza; hoạt độ -amylaza cao làm tăng hàm lợng đờng tế bào chất chuyển hóa khác; yếu tố làm tăng khả giữ nớc tế bào, chống đợc hạn cực đoan giai đoạn Kết phân tích hoạt độ enzim -amylaza 12 giống lúa cạn đợc trình bày bảng Bảng cho thấy hoạt độ enzim amylaza 12 giống lúa cạn giai đoạn hạt nảy mầm ngày tuổi dao động khoảng 0,05 đến 0,16 (ĐVHĐ/mg) Giống có tỷ lệ nảy mầm cao giống có hoạt độ -amylaza lớn Kết phân tích RAPD Cây lúa cạn có chất lợng gạo cao có khả chịu hạn tốt, việc nghiên cứu tìm kiếm chất sinh học phân tử đặc tính vấn đề đặt chơng trình nghiên cứu lúa cạn Một đặc tính quý lúa cạn mà quan tâm nghiên cứu nhóm gien chịu hạn lúa cạn kết sản phẩm ADN tổng số có phân tử lợng đủ lớn độ tinh đảm bảo Kết tách chiết ADN tổng số từ lúa mầm đợc thể hình Hình Điện di ADN gel agaroza 0,8% 12 giống lúa cạn Cao Bằng Bắc Kạn Kết tách chiết ADN từ tơi, mầm để khô thu đợc sản phẩm ADN Tuy nhiên, dung dịch ADN tách từ mầm tơi có hàm lợng cao từ khô Sản phẩm ADN tách từ mầm đợc nuôi cấy môi trờng MS có độ tinh cao nhÊt M 10 11 12 M 10 11 12 (a) (b) H×nh Kết điện di sản phẩm PCR-RAPD với måi RA31 (a), RA36 (b) Ghi chó: M thang ADN chuÈn; gièng CB2; gièng CB3; gièng CB5; gièng CB6; gièng CB7; gièng CB8; gièng BC9; gièng BC10; gièng BC11; 10 gièng BC12; 11 giống BC17; 12 giống CB18 Chúng sư dơng måi ngÉu nhiªn (RA31, RA36, RA45, RA46 RA142) để tiến hành phản ứng RAPD sản phẩm RAPD đợc điện di gel agaroza Kết thu đợc 285 phân đoạn ADN đợc nhân Bình quân giống, xuất 23,75 phân đoạn, giống CB7 có số phân đoạn ADN đợc nhân nhiều (28 phân đoạn), giống BC12 có số phân đoạn ADN đợc nhân (15 phân đoạn) Trong số mồi ngẫu nhiên sử dụng cho phản ứng RAPD, hai mồi RA31 RA36 có số phân đoạn ADN đợc nhân nhiều (10 53 phân đoạn) Mồi RA45 có số phân đoạn ADN đợc nhân (2 phân đoạn) Nh việc sử dụng mồi ngẫu nhiên có chiều dài 10 nucleotit cho thấy sai khác giống lúa cạn mức độ phân tử Dựa vào xuất hay không xuất phân đoạn ADN giống điện di sản phẩm RAPD, thiết lập mối liên quan giống mức độ phân tử Số liệu nhận đợc, đợc tính toán phân tích theo chơng trình NTSYSpc Kết đợc trình bày bảng hình Bảng cho thấy giống lúa cạn có hệ số tơng đồng di truyền cặp nằm khoảng 0,38-0,88, hệ số tơng đồng di truyền thấp 0,379 so sánh giống BC12 CB6, cao so sánh giống BC9 CB8 có hệ số tơng đồng di truyền 0,884 Bảng Hệ số tơng đồng di truyền 12 giống lúa cạn Cao Bằng Bắc Kạn CB2 CB3 CB5 CB6 CB7 CB8 BC9 CB2 1,000 CB3 0,846 1,000 CB5 0,655 0,703 1,000 CB6 0,515 0,548 0,548 1,000 CB7 0,766 0,758 0,758 0,606 1,000 CB8 0,666 0,777 0,714 0,612 0,766 1,000 BC9 0,633 0,740 0,740 0,580 0,733 0,884 1,000 BC10 BC11 CB12 BC17 BC18 BC10 0,700 0,750 0,750 0,645 0,800 0,821 0,851 1,000 BC11 0,531 0,566 0,620 0,750 0,677 0,689 0,655 0,785 1,000 CB12 0,538 0,583 0,520 0,379 0,433 0,538 0,500 0,464 0,444 1,000 BC17 0,769 0,833 0,692 0,483 0,633 0,703 0,666 0,678 0,500 0,636 1,000 BC18 0,846 0,769 0,642 0,548 0,645 0,600 0,566 0,689 0,516 0,520 0,833 1,000 CB2 CB3 BC17 BC18 CB5 CB7 CB8 CB9 CB10 CB6 BC11 BC12 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 HÖ sè Hình Sơ đồ phả hệ 12 giống lúa cạn Cao Bằng Bắc Kạn Hình biểu đồ mối quan hệ giống lúa cạn mặt di truyền; mức độ khác đợc thể hệ số tơng đồng di truyền giống Các giống có hệ số tơng đồng di trun cao sÏ cã mèi quan hƯ di trun 54 gần Sơ đồ hình chia giống lúa cạn thành nhánh Nhánh thứ nhÊt chØ cã gièng BC12 vµ gièng nµy cã hƯ số tơng đồng di truyền với giống khác 0,515 Nh− vËy, gièng BC12 cã hƯ sè sai kh¸c với 11 giống lại lớn (1-0,515 = 0,485) Gièng BC12 thc loµi phơ japonica cã thêi gian sinh trởng ngắn (120-125 ngày), có đặc điểm hình thái hạt khác với 11 giống thuộc nhánh Điều tồn mối liên quan sai khác cấu trúc ADN với đặc điểm hình thái hạt sinh trởng lúa cạn Nhánh thứ hai gồm 11 giống đợc chia thành nhánh phụ Nhánh phụ thø nhÊt gåm gièng CB6 vµ BC11; hai gièng thuộc loài phụ indica có hệ số tơng đồng di truyền với nhánh phụ thứ hai 0,59 Nhánh phụ thứ hai đợc chia thành hai nhóm: nhóm thứ gồm giống BC10, BC9, CB8, CB7 CB5, hai giống BC9 CB8 đứng gần sơ đồ phả hệ; nhóm thứ hai gồm giống BC18, BC17, CB3 CB2; chúng thuộc loài phụ indica Iii Kết luận Đã su tập phân loại đợc 18 giống lúa cạn hai tỉnh Cao Bằng Bắc Kạn Các giống lúa cạn có trọng lợng 1000 hạt dao động từ 21,49-31,54 g Đánh giá chất lợng hạt 18 giống lúa cạn phơng diện hóa sinh, cho thấy gạo chúng có hàm lợng protein dao động từ 4,83-8,91%; hàm lợng lipit từ 1,82-3,91% Hai giống lúa nếp vàng Muvai có hàm lợng protein cao (8,91 0,01% 8,67 0,04%) Hoạt ®éng cña enzim α-amylaza cña 12 sè 18 gièng lúa cạn dao động từ 0,050,16 (ĐVHĐ/mg); hoạt độ enzim - amylaza ảnh hởng đến tốc độ tỷ lệ nẩy mầm hạt Kết phân tích tính đa dạng di truyền 12 gièng lóa c¹n b»ng kü tht RAPD víi måi ngẫu nhiên cho thấy giống lúa cạn có ADN cđa hƯ gien kh¸c tõ 11,6-48,5% HƯ sè tơng đồng di truyền sơ đồ phả hệ chúng minh chứng điều Tài liệu tham khảo Phạm Thị Trân Châu cs., 1997: Thực hành hóa sinh học, Nxb Giáo dục, Hà Nội Lê Doãn Diên cs., 2001: Kỷ yếu hội thảo sinh häc quèc tÕ: 61-67, Hµ Néi Foolad M R., Siva A and Rodriguer L R., 1995: Tissue and Organ culture Fundamental methods: 281-298 Springer verlag, Berlin, Heidelerg NguyÔn Thu Hà, Chu Hoàng Mậu cs., 2003: Những vấn đề nghiên cứu khoa học sống: 86-89, HuÕ IRRI, 1996: Upland rice in ASIA Los Banos Philippines IRRI, 1997: Rice almanac: 22-25 Los Banos, Philippines Kumio Takawa, 1999: Structure ADN expressin of rice seed storaga protein gene, Molecular Biology of rice, IRRI Sandhu S et al., 2002: Genet Mol Res., 1(4): 359-370 Ren F., 2003: Theor Appl Genet., 108(1): 113-120 the seed biochemical composition and the genetic diversity of some local upland rice cultivars collected from Caobang and Backan provinces Chu Hoang Mau, Pham Thi Thu Nga Summary The local upland rice cultivars play an important role for the life of people in upland regions of North Vietnam The quantity of local upland rice cultivars has been degenerated considerably by the adverse 55 environment conditions and the development of agricultural and sylvicultural productions So that, the preservation of the gene source of local upland rice cultivars are very necessary 18 local upland rice cultivars had been collected from the Caobang and Backan provinces They belonged to two rice subspecies indica (13 cultivars) and japonica (5 cultivars) and consisted of sticky rice cultivars and 11 plain rice cultivars The agro-biological characters and the seed quality of these local upland rice cultivars had been assessed The total protein content of their seeds ranged from 4.83% to 8.91% and the total lipid content ranged from 1.82% to 3.91% of dry weight The molecular genetic diversity of some local upland rice cultivars had been analyzed by RAPD markers with arbitrary primers and the result obtained showed that 285 fragments have been replicated The significal difference between these local upland rice cultivars were shown by the study of the DNA polymorphism at molecular level and the appearance of plant groups with difference from 11.6% to 48.5% has been compared with the similar coefficient of local upland rice cultivars Ngµy nhËn bµi: 13-5-2005 56 ... Doãn Di n cs [2] hàm lợng protein hạt gạo nếp cao hạt gạo Nơi lấy mẫu Cao Bằng Cao B»ng Cao B»ng Cao B»ng Cao B»ng Cao B»ng Cao Bằng Cao Bằng Bắc Kạn Bắc Kạn Bắc Kạn Bắc Kạn Cao Bằng Cao Bằng Bắc. .. phả hệ 12 giống lúa cạn Cao Bằng Bắc Kạn Hình biểu đồ mối quan hệ giống lúa cạn mặt di truyền; mức độ khác đợc thể hệ số tơng đồng di truyền giống Các giống có hệ số tơng đồng di trun cao sÏ cã... II Kết nghiên cứu Kết su tập giống lúa cạn hai tỉnh Cao Bằng Bắc Kạn Công tác thu thập giống lúa cạn đợc thực từ tháng 8/2003 đến tháng 12/2003 hai tỉnh Cao Bằng Bắc Kạn Kết phân tích đánh giá