Ứng dụng các chỉ thị này để xác định sự có mặt của các gen kháng đã được tiến hành ở nhiều quốc gia, giúp rút ngắn thời gian đánh giá và có thể sử dụng trực tiếp trong chọn giống hiện đạ
Trang 1Nghiên cứu đánh giá tiềm năng di truyền kháng bạc lá của một số giống lúa nếp địa phương bằng chỉ
thị phân tử
Trang 2
Nghiên cứu đánh giá tiềm năng di truyền kháng bạc lá của một số giống lúa nếp địa phương bằng chỉ thị phân tử
I ĐẶT VẤN ĐỀ
Lúa là cây lương thực chiếm tỉ trọng cao trong tổng sản lượng lương thực hàng năm, cung cấp gần 80% nhu cầu tinh bột trung bình cho người dân Việt Nam Nước ta có khí hậu nhiệt đới là điều kiện thuận lợi cho nhiều loại sâu bệnh hại phát triển Trong đó, bệnh bạc lá là một bệnh nguy hiểm đối với lúa trồng do có khả năng gây giảm năng suất nghiêm trọng, có khi thiệt hại lên đến 30-60%, có thể dẫn đến mất trắng
Biện pháp sử dụng giống kháng bệnh được coi là xu hướng có hiệu quả về cả mặt kinh
tế và môi trường Ngày nay, số lượng các chủng bạc lá ở miền Bắc nước ta đang tăng lên nhanh chóng và đa dạng hơn, đòi hỏi cần tạo ra những giống lúa mới mang nhiều gen kháng,
có tính kháng bền vững hơn Định hướng trong nghiên cứu chọn tạo giống là tạo giống kháng bền vững mang từ 1 đến nhiều gen kháng có năng suất cao, chất lượng tốt để tiến tới có thể thay thế dần các giống nhập nội Vì thế, nghiên cứu xác định nguồn gen kháng bệnh bạc lá sẵn có trong các nguồn gen lúa địa phương nhằm hạn chế tác hại của bệnh
Cho đến nay, hơn 30 gen kháng bệnh bạc lá đã được phát hiện và một số gen kháng chính đã được xác định với các chỉ thị liên kết (J.S Kim và cs., 2009) Ứng dụng các chỉ thị này để xác định sự có mặt của các gen kháng đã được tiến hành ở nhiều quốc gia, giúp rút ngắn thời gian đánh giá và có thể sử dụng trực tiếp trong chọn giống hiện đại nhờ chỉ thị phân
tử do xác định chính xác được nguồn gen kháng
Với mong muốn nhanh chóng tiếp cận nguồn gen kháng bệnh của các tập đoàn lúa đang được lưu giữ tại Ngân hàng gen cây trồng Quốc gia để theo kịp với tiến trình chọn giống lúa hiện
đại, chúng tôi đã tiến hành đề tài: “Nghiên cứu đánh giá tiềm nămg di truyền kháng bạc lá của một số giống lúa nếp địa phương bằng chỉ thị phân tử”
II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
1 Vật liệu nghiên cứu
- Vật liệu thực vật:
+ Các dòng lúa đẳng gen mang gen kháng bệnh bạc lá có nguồn gốc từ IRRI đươc thu thập từ hai đơn vị: Bộ môn Bệnh cây Nông nghiệp, Khoa Nông học, Trường Đại học Nông
nghiệp HN và Viện Di truyền Nông nghiệp
+ Các mẫu giống lúa nếp thuộc phân loài phụ Japonica trong ngân hàng gen lúa đã có
dữ liệu đánh giá tinh kháng bệnh bạc (BL) lá điểm 1 đến 3
Trang 3STT SĐK Tên giống I2 - KI Điểm kháng BL
- Nguồn vi khuẩn X oryzae sử dụng trong nghiên cứu
19 isolate vi khuẩn X.oryzae có số seri từ 893.HAU 10132-5 đến 1083.HAU
10164-3 Các isolate này thuộc 2 race: 5 và 12 dựa trên phản ứng gây bệnh của isolate trên các dòng lúa (Bùi Trọng Thủy, 2008) được cung cấp từ Bộ môn Bệnh cây – Trường Đại học Nông nghiệp HN Các isolate này đã được thu thập, phân lập và bảo quản từ vụ mùa năm 2010, được thu thập ở 11 tỉnh đó là: Thanh Hóa, Bắc Ninh, Hà Nội, Hải Phòng, Ninh Bình, Hải Dương, Thái Bình, Nam Định, Nghệ An, Hưng Yên, Điện Biên Phủ và trên 18 giống lúa: HYT 100, Q-ưu 1, MT6, MT1, Kháng Mằn, B6, Dòng 536, Bắc Thơm, Xi-6, Hương Thơm,
Xi, BC15, Tạp Giao, IR64, D-ưu 527, Tẻ Đỏ, Khang dân, C70
- Các chỉ thị phân tử sử dụng trong nghiên cứu
Các chỉ thị phân tử PCR based: STS và SSR liên kết với gen kháng bệnh bạc lá Xa4, xa5, Xa7, Xa21 từ các tài liệu tham khảo được sử dụng trong nghiên cứu
2 Phương pháp nghiên cứu, kỹ thuật sử dụng
2.1 Lây nhiễm nhân tạo
Thí nghiệm đánh giá khả năng kháng bệnh qua lây nhiễm nhân tạo được bố trí trong nhà lưới có mái che, theo kiểu tuần tự, cấy 1 dảnh Tiến hành lây nhiễm bằng phương pháp cắt đầu lá sâu 3-5cm bằng kéo nhúng dung dịch vi khuẩn khi lúa bắt đầu có đòng và đánh giá trên 3 khóm/mẫu giống/isolate vi khuẩn, mỗi giống ghi nhận kết quả ở 5 lá trên/khóm bằng cách đo chiều dài vết bệnh sau 18 - 21 ngày lây nhiễm
Mức độ kháng/nhiễm của các mẫu giống được đánh giá dựa trên chiều dài trung bình của vết bệnh trên lá lúa theo phương pháp của IRRI như sau: chiều dài vết bệnh < 8 cm: kháng bệnh (R); 8-12cm: nhiễm vừa (M); > 12 cm: nhiễm nặng (S)
2.2 Kiểm tra khả năng mang gen kháng bệnh bạc lá bằng phương pháp PCR
2.2.1 Phương pháp tách chiết ADN
ADN lá lúa được tách chiết và tinh sạch theo phương pháp CTAB của Doyle, JJ và ctv (1987) Chất lượng và nồng độ ADN tổng số được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0.8%
2.2.2 Kỹ thuật PCR
Trang 4Phản ứng PCR được tiến hành trên máy PCR MJ-PTC200 Tổng dung dịch phản ứng
là 15 µl bao gồm 50ng ADN tổng số, 0.15µM mồi, 0.2 mM dNTPs, 1X dịch đệm PCR,
với từng chỉ thị ở các bước như sau:
- Phản ứng PCR đối với các cặp mồi MP1-2, P3, pTA248 lần lượt của các gen Xa4, Xa7, Xa21 được thực hiện theo chu kì nhiệt như sau: 94ºC trong 4 phút; 30 chu kỳ: 94ºC trong
1 phút, 56ºC trong 1 phút, 72ºC trong 2 phút; và 72ºC trong 8 phút, bảo quản ở 4°C
- Phản ứng PCR đối với cặp mồi RM6320 của gen xa5 được thực hiện theo chu kì
nhiệt: 94ºC trong 4 phút; 34 chu kỳ: 94ºC trong 1 phút, 55ºC trong 1 phút, 72ºC trong 1 phút
50 giây; và 72ºC trong 7 phút, bảo quản sản phẩm ở 4°C
- Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 1,5-2% Bản gel được nhuộm bằng ethidium bromide, chụp ảnh dưới tia UV
2.3 Phương pháp phân tích và xử lý số liệu:
Số liệu được xử lý bằng phần mềm thông dụng Microsoft Office Excel 2003
III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
1.Thu thập, phân t ch th ng tin về ngu n gen lúa địa phương v các d ng lúa đ ng gen mang gen kháng l m vật liệu đánh giá khả năng kháng bệnh bạc lá
+ Các dòng lúa đẳng gen mang gen kháng bệnh bạc lá:
Chúng tôi đã thu thập và gieo trồng được 20 dòng lúa đẳng gen mang gen kháng có nguồn gốc từ IRRI được thu thập từ hai đơn vị: Bộ môn Bệnh cây Nông nghiệp, Khoa Nông học, Trường Đại học Nông nghiệp HN và Viện Di truyền Nông nghiệp Các dòng đẳng gen
mang các nguồn gen kháng đơn như Xa1, Xa2, Xa3, Xa4, xa5, Xa7, Xa10, Xa11, Xa14, Xa21
và một số dòng mang các tổ hợp đa gen kháng như IRBB21, IRBB55, IRBB57, IRBB59,
IRBB60, IRBB62, IRBB1/4 Trong đó, chỉ có xa5 là gen lặn, các gen khác là gen trội IR24
không chứa gen kháng nên được chọn làm giống chuẩn nhiễm và làm giống đối chứng nhiễm
+ Các giống lúa địa phương có tiềm năng kháng bệnh:
Trong dữ liệu tập đoàn lúa đang được lưu giữ trong ngân hàng gen, chúng tôi đã chọn lọc được 80 mẫu giống lúa có điểm kháng bệnh bạc lá từ 1 đến 3 (kết quả đánh giá từ trước năm 2000 với chủng bạc lá phổ biến) Trong đó, 22 mẫu giống lúa nếp thuộc phân loài phụ
Japonica có số liệu đánh giá tính kháng bệnh bạc (BL) lá điểm 1 được sử dụng trong nghiên
cứu (phụ lục)
2 Đánh giá khả năng kháng của các d ng lúa đ ng gen mang các gen kháng
2 ánh giá tính kháng c a các d ng l a ng gen bằng lây nhiễm v i các ch ng vi khuẩn gây bệnh bạc lá
Trong nội dung nghiên cứu này, chúng tôi đã sử dụng 19 isolate được thu thập từ 11 tỉnh đại diện cho các vùng sinh thái ở miền Bắc để tiến hành lây nhiễm trên 16 dòng lúa đẳng gen mang các gen kháng bạc lá gồm 11 dòng đẳng gen mang các gen kháng đơn nhận được từ Trường ĐHNN và 5 dòng đa gen kháng nhận được từ Viện DTNN
Từ kết quả đo chiều dài vết bệnh trung bình của 16 dòng lúa đẳng gen sau lây bệnh 18 ngày căn cứ vào phản ứng kháng (R), nhiễm(S) của các dòng lúa đẳng gen với 19 isolate vi khuẩn
X oryzae (bảng 1), chúng tôi có nhận xét như sau:
- Dòng lúa IR24 ( đối chứng – chuẩn nhiễm) đều có phản ứng nhiễm (S) với 19 isolate vi
khuẩn X oryzae
- Trong các dòng lúa mang đơn gen kháng, các gen kháng Xa1, Xa2, Xa3, Xa4, Xa10, Xa11, Xa14 đều cho phản ứng nhiễm với tất cả các isolate được sử dụng Dòng lúa mang gen kháng xa5 có hiệu lực kháng mạnh nhất (chiều dài vết bệnh trung bình <2cm), dòng mang gen kháng Xa7 cũng có biểu hiện kháng với tất cả các isolate lây nhiễm Gen kháng Xa21 có hiệu
lực kháng với gần ½ các isolate được lây nhiễm, đó là các isolate thuộc race 5 và không kháng được các isolate thuộc race 12
Trang 5- Các dòng đẳng gen mang nhiều gen kháng có phản ứng kháng với hầu hết các isolate sử
dụng để đánh giá Tất cả các dòng mang gen kháng xa5, Xa7 đều có đặc điểm kháng với các chủng vi khuẩn gây bệnh Tổ hợp giữa Xa21 và Xa13 vẫn cho phản ứng nhiễm với isolate
893 HAU 10132-5 và 976 HAU 10143-3, giống như đặc điểm kháng/nhiễm của dòng đơn gen IRBB21
Trang 6Bảng 1 Phản ứng của 16 d ng lúa đ ng gen với 19 Isolate vi khuẩn X oryzae
Ngày lây nhiễm: 07/09/2011 Ngày đo: 25/09/2011
S/R
Xa21
Xa4 Xa5 Xa21
Xa5 Xa13 Xa21
Xa4 Xa5 Xa13 Xa21
Xa4 Xa7 Xa21
Trang 72.2 ánh giá, xác ịnh n i vi khuẩn bạc lá ộc tính nhất ể lây nhiễm
Dựa vào kết quả lây nhiễm của 19 isolate vi khuẩn bạc lá (bảng 2), và căn cứ vào tiêu chuẩn xác định nòi (Bùi Trọng Thủy, 2008), chúng tôi nhận thấy:
- 10 isolate vi khuẩn X oryzae thuộc nòi số 5 có kiểu phản ứng đặc trưng là: Các dòng lúa IRBB5 (xa5), IRBB7 (Xa7), IRBB21 (Xa21) có phản ứng kháng (R), các dòng lúa IRBB1 (Xa1), IRBB2 (Xa2), IRBB3 (Xa3), IRBB4 (Xa4), IRBB10 (Xa10), IRBB11 (Xa11), IRBB14 (Xa14) có cùng kiểu phản ứng nhiễm (S)
- 9 isolate vi khuẩn X.oryzae thuộc nòi số 12 có kiểu phản ứng đặc trưng là: Các dòng lúa IRBB5 (xa5), IRBB7 (Xa7) có phản ứng kháng (R), các dòng lúa IRBB1 (Xa1), IRBB2 (Xa2), IRBB3 (Xa3), IRBB4 (Xa4), IRBB10 (Xa10), IRBB11 (Xa11), IRBB14 (Xa14), IRBB21 (Xa21) có cùng kiểu phản ứng nhiễm (S)
- Từ nghiên cứu này đồng thời dựa trên chiều dài viết bệnh trung bình, isolate 893-HAU 10132-5 được xác định cho độc tính cao nhất Hai isolate tiêu biểu cho hai nòi vi khuẩn này đã được sử dụng để đánh giá tính kháng của các giống địa phương ở nghiên cứu tiếp theo là 893-HAU 10132-5 (race 12) và 972 893-HAU 10144-8 (race 5)
Bảng 2 Độc tính của 19 isolate vi khuẩn bạc lá lúa sử dụng trong nghiên cứu
Ngày lây nhiễm: 07/09/2011 Ngày đo: 25/09/2011
2.3 Kiểm tra gen kháng c a các d ng ng gen bằng các chỉ thị phân tử
Để kiểm tra sự có mặt của các gen kháng trong các dòng lúa đẳng gen, chúng tôi tiến hành gieo 16 mẫu lúa mang các gen kháng bạc lá (đơn gen và đa gen) ra khay và lấy lá non
để tách chiết ADN Kết quả tách chiết ADN được kiểm tra bằng điện di trên gen agarose 0,8% cho thấy các mẫu ADN đều đạt chất lượng tốt, đủ điều kiện cho xác định biểu hiện của gen kháng nhờ phản ứng PCR với các cặp mồi liên kết với gen kháng
Khảo sát đa hình di truyền giữa các cặp giống đối chứng kháng/nhiễm được tiến hành
với 23 cặp mồi đã được tìm kiếm thông tin đối với 4 gen kháng quan tâm: Xa4, xa5, Xa7 và Xa21 Kết quả khảo sát cho thấy, các chỉ thị STS liên kết với gen kháng đều phát hiện được
Trang 8sự có mặt của các gen kháng ở các dòng lúa đẳng gen Cụ thể: chỉ thị MP1-2 cho đa hình
giữa các dòng mang gen kháng Xa4 là IRBB4, IRBB1/4, IRBB57, IRBB60, IRBB62 và IR24, chỉ thị P3 cho đa hình giữa các dòng mang gen kháng Xa7 là IRBB7, IRBB62 và IR24, chỉ thị pTA248 cho đa hình giữa các dòng mang gen kháng Xa21 là IRBB21, IRBB55,
IRBB57, IRBB60, IRBB 62 và IR24, chỉ thị RG556 cũng cho đa hình giữa các mẫu giống
mang gen và IR24 sau khi sản phẩm được cắt bằng enzyme DraI (Hình 1, 2) Các băng thu
được ở các mẫu dòng lúa đẳng gen mang gen kháng có kích thước tương đương với nhau và khác biệt với dòng nhiễm IR24 Kết quả này cho thấy các dòng lúa đẳng gen đều mang các gen kháng (trừ dòng IRBB4 được nhận từ Viện Di truyền đã không xác định được gen
kháng Xa4 bằng chỉ thị MP1-2, có thể dòng này đã bị mất gen kháng trong quá trình lưu giữ
ngoài đồng ruộng) Vì thế, trong nghiên cứu tiếp theo, chúng tôi đã chỉ sử dụng nguồn gen
kháng Xa4 đối chứng từ dòng lúa được nhận từ Bộ môn Bệnh cây- ĐHNN Ngoài ra, chỉ thị SSR RM6320 cũng cho đa hình giữa các dòng mang gen kháng xa5 và dòng lúa nhiễm
IR24
Hình 1 Điện di sản phẩm PCR của các cặp mồi MP1-2, P3, MBG trên gel agarose 1,5%
A: Các dòng lúa nhận từ Viện DTNN B: Các dòng lúa nhận từ ĐHNN HN
Hình 2 Điện di sản phẩm PCR của các cặp mồi RG556 và pTA248 trên gel agarose 1,5%
Trang 93 Đánh giá t nh kháng bạc lá của 2 ngu n gen lúa nếp địa phương
3 Xác ịnh các gen kháng bằng chỉ thị phân tử
Trong nội dung nghiên cứu này, phân tích phân tử tính kháng bệnh bạc lá nhờ các cặp mồi đặc hiệu của các gen có khả năng kháng với các nòi vi khuẩn phổ biến ở miền Bắc nước
ta là 4 gen kháng Xa4, xa5, Xa7, Xa21
- Xác định giống mang gen kháng Xa4
Kết quả phân tích phân tử xác định gen Xa4 nhờ chỉ thị MP1-2 cho thấy trong 22 mẫu giống lúa nếp Japonica, có 2 mẫu giống có chứa gen kháng này, đó là các mẫu có số đăng
ký 24 và 2369 Mẫu giống 1292 có kiểu allen chỉ thị khác biệt so với kiểu kháng/nhiễm, có kích thước nằm giữa hai allen này (hình 3) Kích thước kiểu dạng này cũng đã được ghi
nhận trong nghiên cứu của tác giả (Nguyễn Văn Viết và ctv.)
Hình 3 Sản phẩm PCR của 22 mẫu giống lúa nếp Japonica và các giống đối chứng với
cặp mồi MP1-2
- Xác định giống mang gen kháng xa5
Kết quả phân tích phân tử xác định gen xa5 nhờ chỉ thị STS RG556 cho thấy trong 22 mẫu giống lúa nếp Japonica, không có mẫu giống nào có biểu hiện allen kháng này Tất cả
các mẫu giống đều mang allen nhiễm của IR24
Chúng tôi đã tiếp tục sử dụng chỉ thị RM224 và RM6320 để khảo sát sự đa hình tại locut gen kháng này Kết quả thu được có sự đa hình giữa hai giống đối chứng nhưng trong tập đoàn 22 giống lúa nghiên cứu không có allen nào có kích thước tương đồng với kích thước của của gen ở dòng lúa IRBB5 Tuy nhiên, số allen đa hình tại hai locut này biến động
từ 3 allen (RM3796) và 5 allen (RM6320) (Hình 4) Đa dạng tại locut gen kháng này cũng
đã được ghi nhận với chỉ thị RM112 trong báo cáo của Shahzad và cs (2010)
Hình 4 Khảo sát locut gen kháng xa5 với chỉ thị RM6320 đối với 22 giống nghiên cứu
Ghi chú: trái qua phải: thang ADN 50bp, IR24, IRBB5, các mẫu giống
- Xác định giống mang gen kháng Xa7
Trang 10Sự có mặt của gen kháng Xa7 được xác đinh nhờ chỉ thị P3 Kết quả cho thấy trong 22 mẫu giống lúa nếp Japonica, có 4 mẫu giống có chứa gen kháng Xa7, đó là các mẫu có số
đăng ký 1902, 1930, 2036, 2369
Hình 5 Sản phẩm PCR của 22 mẫu giống lúa nếp Japonica và các giống đối chứng
với cặp mồi P3
Ghi chú: từ trái - phải: thang ADN chuẩn 100bp, đối chứng và các mấu giống
- Xác định giống mang gen kháng Xa21
Sự có mặt của gen kháng Xa21 trong tập đoàn được xác đinh nhờ chỉ thị pTA248 Kết quả cho thấy trong 22 mẫu giống lúa nếp Japonica, không có mẫu giống nào có kiểu băng
ADN giống với IRBB21 Vì thế, với chỉ thị này, chúng tôi đã không xác định được nguồn
gen nào có gen kháng Xa21 Kết quả tương tự cũng đã được ghi nhận trong nhiều nghiên cứu trước đó của Nguyễn Văn Viết (2007), Phan Hữu Tôn (2005) Gen kháng Xa21 được phát hiện ở giống lúa dại O Longistaminata (Khush và cs 1990)
3.2 ánh giá tính kháng bạc lá c a 2 nguồn gen l a n p ịa phương trong i u kiện nhà
lư i
Thí nghiệm lây nhiễm bệnh nhân tạo được tiến hành đồng thời với các nguồn gen và các giống đối chứng kháng có mang gen kháng chỉ thị và giống nhiễm IR24 trong nhà lưới với 2 isolate 893-HAU 10132-5 (nòi 12) và 972 HAU 10144-8 (nòi 5)
Hình 6 Kết quả lây nhiễm của giống lúa có số đăng ký 24 với các giống đối chứng
kháng/nhiễm với isolate vi khuẩn bạc lá 893 Kết quả cho thấy, ở cả 2 isolate, giống IR24 đều cho phản ứng nhiễm với chỉ số trung
bình vết bệnh từ 18,02 đến 26,28 Dòng IRBB4 mang gen kháng Xa4 cho thấy phản ứng
