Để tăng hiệu lực tác động của đầu Neem, bài viết tiến hành phối trộn dầu ép từ hạt Neem 4 đến 5 tuổi trồng tại Ninh Thuận với bột Bt và khảo sát hiệu lực gây chết của chế phẩm này trên sâu xanh và sâu tơ.
27(3): 61-65 9-2005 Tạp chí Sinh học KHảO SáT HàM LƯợng ba HOạT CHấT sinh học TRONG DầU H¹T neem (Azadirachta indica A Juss.) TRåNG T¹I VIƯT NAM Vũ VĂN Độ, NGUYễN TIếN THắNG, NGÔ Kế SƯƠNG Viện Sinh học nhiệt đới Một giải pháp xây dựng nông nghiệp sinh thái bền vững giảm áp lực sử dụng thuốc hoá học, tăng cờng sử dụng loại chế phẩm bảo vệ thực vật sinh học thân hữu với môi trờng, vừa có tác dụng phòng trừ sâu hại vừa bảo đảm suất, phẩm chất trồng không gây ô nhiễm môi trờng Một chế phẩm dầu neem đợc chiết xuất từ hạt neem (Azadirachta indica A Juss.) có tên gọi xoan ấn độ v xoan chịu hạn (tên địa phơng) Việt Nam, năm gần đây, đ có số nghiên cứu sử dụng dầu neem phòng trừ sâu hại, nh sử dụng dầu neem để phòng trừ bọ hà khoai lang (Cyclas formicarius F.) có hiệu nồng độ phun 15 ppm [4] Còn nồng độ xử lý 200 ppm cho thấy dầu neem làm giảm ký sinh, sinh sản bọ hà khoai lang có tác dụng xua đuổi bọ hà đến ký sinh [5] Dơng Anh Tuấn cs (2002) đ cho thấy phân đoạn dầu neem thu đợc phòng thí nghiệm có hoạt tính gây ngán ăn cao sâu khoang, số gây ngán ăn đạt đến 87% xư lý ë nång ®é 1% [1, 2] Hoạt chất nhân hạt neem azadirachtin đ đợc chiết tách, tinh với độ đạt 92% [2] Hầu nh cha có tác giả xác định hàm lợng hoạt chất sinh học azadirachtin, salanin, nimbin nhân hạt neem, nh dầu bánh dầu hạt neem trồng Việt Nam Hiện nay, riêng tỉnh Ninh Thuận, đ có gần 400 neem trồng tập trung đ cho (trong tổng số 1.718 đ trồng), ớc tính đạt 5-10 quả/ha; nguồn nguyên liệu để sản xuất thuốc bảo vệ thực vật có giá trị Bớc đầu đ tiến hành khảo sát quy trình ép dầu neem xác định hàm lợng hoạt chất có hoạt tính sinh học dầu làm sở để xây dựng quy trình sản xuất thuốc bảo vệ thực vật (BVTV) từ dầu neem quy mô pilot Để tăng hiệu lực tác động dầu neem, tiến hành phối trộn dầu ép từ hạt neem 4-5 ti trång t¹i Ninh Thn víi bét Bt khảo sát hiệu lực gây chết chế phẩm sâu xanh sâu tơ I PHƯƠNG PHáP NGHIÊN CứU Nguyên liệu Quả neem đợc thu hái từ neem 4-5 năm tuổi trồng tỉnh Ninh Thuận, làm vỏ thịt hạt, sau phơi khô hạt bóng dâm sấy khô nhiệt độ 50oC Hạt đợc tách vỏ lấy nhân hạt để ép dầu Thiết bị hóa chất Máy ép dầu thực vật KOMET Model D 851G (Đức); máy sắc ký lỏng hiệu suất cao (HPLC); máy sắc ký khí (GC); máy trộn; máy cô quay chân không; dung môi mêtanol êtanol Phơng pháp nghiên cứu a Phơng pháp ép lạnh Sử dụng máy ép dầu chuyên dụng KOMETĐức để ép dầu từ nhân hạt neem nhiệt độ khống chế từ 35oC đến 45oC b Phơng pháp xác định hàm lợng hoạt chất sinh học dầu bánh dầu neem HPLC - Xử lý mẫu: Cân 20 g hạt neem, nghiền nhỏ thành bột mịn chiết rút với 200 ml mêtanol (MeOH) từ 1,5-2,0 giờ, lặp lại quy trình lần Các dịch chiết đợc gom lại, cô máy cô quay 61 chân không 50oC 10 ml Lọc dịch cô qua màng lọc 0,45àm xác định hàm lợng hoạt chất dịch lọc HPLC nhiễu trình phiên m RNA, trình tạo ATP gây cân tính bán thấm màng tế bào côn trùng [7, 8] - Định lợng hoạt chất azadirachtin, salanin nimbin HPLC: Trong thực tế, thuốc trừ sâu sinh học nói chung dầu neem nói riêng cha đợc sử dụng rộng r i hiệu lực tác dụng chậm so với thuốc trừ sâu hóa học Để tăng hiệu lực tác động dầu neem, tiến hành phối trộn bột Bt, tạo chế phẩm thuốc bảo vệ thực vật dầu neem với Bt Tiến hành định lợng azadirachtin, salanin nimbin máy sắc ký lỏng hiệu xuất cao (HPLC) Hewlett Packard 1090; series1-liquid chromatography với thông số sau: - Cột phân tích: Bondapak C18, 125 , 10àm; 3,9 mm x 300 mm - Cét b¶o vƯ: Bondapak TM C18, 125 Ǻ, 10 µm; 3,9 mm x 20 mm - Lợng mẫu bơm vào cột: àl - Detectơ DAD: λ = 220 nm - Tèc ®é rưa cét: 0,5 ml/phút - Dung môi rửa cột: axêtonitril: H2O (55: 45) - Chất chuẩn: nimbin salanin (TrifolioGmbH, Đức), azadirachtin (h ng Sigma) - Định lợng thành phần hàm lợng axít béo dầu neem sắc ký khí Dầu neem thu đợc, đợc lọc kỹ qua 2-3 lớp vải lọc mouslin đợc đem phân tích thành phần axít béo máy sắc ký khí Hewlett Packard HP 6890 series, GC system (Plus +) c Ph−¬ng pháp phối trộn tạo sản phẩm thuốc bảo vệ thực vËt sinh häc cã ngn gèc tõ dÇu neem B−íc đầu đ tạo chế phẩm chứa dầu neem bột Bt Dầu neem đ đợc chứng minh có khả phòng trừ nhiều loại sâu hại thuộc nhiều côn trùng khác [10], không gây nhờn thuốc Song, tác dụng lại chậm kéo dài dễ bị phân huỷ tác động nhiệt độ cao ¸nh s¸ng Bacillus thuringiensis (Bt) lµ mét vi khuÈn cã mặt tự nhiên, có khả kiểm soát sâu hại cao Bào tử protein tinh thể (gọi nội độc tố) vi khuẩn Bt gây chứng tê liệt đờng ruột số côn trùng, làm chúng chết khả ăn Ngoài ra, vi khuẩn Bt gây 62 Hai nguyên liệu gốc để tạo chế phẩm dầu neem đ làm giàu azadirachtin (chứa 1.600 mg/lít dầu) bột Bt, dạng bột Trung Quốc sản xuất (có mật độ bào tử 3,2 x 109 bào tử/mg) Phối trộn hai nguyên liệu để tạo thành 15 công thức, có công thức chứa dầu neem, có bột Bt với nồng độ phối chế khác nhằm tìm công thức phối trộn có hiệu diệt sâu cao Sâu xanh sâu tơ lứa tuổi đợc nuôi thức ăn nhân tạo, đợc cung cấp tổ Công nghệ sinh học động vật-Viện Sinh học nhiệt đới d Thử nghiệm hiệu diệt sâu xanh sâu tơcủa thuốc bảo vệ thực vật có nguồn gốc từ dầu neem Thử nghiệm hiệu chế phẩm dầu neem Bt việc phòng trừ hai loại sâu gây bệnh trồng sâu xanh (Heliothis armigera) sâu tơ (Plutella xylostella) [6] Số liệu thí nghiệm đợc phân tích ANOVA-1 yếu tố trắc nghiệm LSD-test [3] II KếT QUả Và THảO LUậN Quy trình ép dầu neem Qua bốn đợt ép nhân hạt neem máy ép dầu KOMET (Đức), với đợt ép từ 1,5 đến 19,25 kg nhân, nhận đợc kết sau: tỷ lệ dầu ép đạt từ 29,68% đến 39,4% (tb: 32,6%), bánh dầu từ 60,6% đến 70,32%, (tb: 67,4%) Tỷ lệ dầu ép trung bình 32,6% lợng bánh dầu trung bình thu đợc 67,4% phù hợp với số liệu đ đợc thông báo [9] Sự dao động tỷ lệ dầu bánh dầu qua lần ép ảnh hởng chất lợng hạt (hạt hạt cũ) ẩm độ hạt Tỷ lệ hao hụt qua lần ép thử nghiệm không đáng kể Bảng Kết ép dầu neem máy KOMET Lợng nhân hạt ép (kg) Lng du thu ủc (kg) Lng bánh du (kg) Nhit ủ du ép Lần ép I 7,1 2,8 (39,4%) 4,3 (60,6%) 40oC LÇn Ðp II 8,0 2,7 (33,75%) 5,3 (66,25%) 40oC LÇn Ðp III 19,25 5,7 (29,68) 13,5 (70,32%) 40oC LÇn Ðp IV 1,5 0,45 (31%) 1,0 (69%) 40oC Tæng cộng: 35,85 11,65 (32,6%) 24,1 (67,4%) Lần ép Quy trình ép dầu neem Hạt neem Nhân hạt ép lạnh Bánh dầu Chiết bánh dầu với êtanol Dầu Dịch tận thu hoạt chất Sục khí nitơ Trộn bánh dầu với phụ gia Bã bánh dầu Trộn dầu với phụ gia Đóng gói, bảo quản Bánh dầu thu đợc sau ép, đợc chiết từ đến lÇn víi cån (1kg b /2l cån 96 o lần) đợc gom lại cô quay chân không nhiệt độ 50 o C đến thể tích xác định Dịch chiết từ bánh dầu đợc trộn với dầu đ lọc bổ sung phụ gia khác theo tỷ lệ thích hợp đóng lọ nhựa có bọc màng để bảo quản Bánh dầu đợc đóng gói bảo quản làm nguyên liệu để sản xuất phân bón sinh học Đóng gói, bảo quản Hàm lợng hoạt chất sinh học dầu bánh dầu neem Trong dầu bánh dầu neem, có mặt ba hoạt chất sinh học azadirachtin, nimbin salanin Nhng hàm lợng hoạt chất azadirachtin nằm chủ yếu bánh dầu, nhiều lần dầu ép; hàm lợng nimbin có bánh dầu dầu ép tơng đơng hàm lợng salanin dầu lại lớn 63 hàm lợng salanin có bánh dầu 1,3 lần Qua khảo sát sơ bộ, nhận thấy thu đợc phần lớn hoạt chất azadirachtin có bánh dầu dung môi thích hợp cồn 96o Bảng Hàm lợng hoạt chất sinh học dầu bánh dầu neem TT Hm lng (%) Bánh dầu neem Dầu neem 0,350 0,055 0,012 0,019 0,058 0,073 Thành phần hoạt chất chÝnh Azadirachtin Nimbin Salanin Thµnh phần hàm lợng axít béo dầu neem Qua ba đợt phân tích thành phần hàm lợng axít béo dầu neem thu năm (2002, 2003, 2004), nhận thấy: dầu neem có chứa phổ rộng axít béo no không no, với hàm lợng dao động lớn, hàm lợng axít lauric (C12) (năm 2004: 0,12%; năm 2002 2003: không phát hiện); hàm lợng axít olêic (C18=) lớn nhất, chiếm từ 43,62 đến 48,09% Các kết phân tích phù hợp với kết Kumar cs (1996) [11] Dầu neem có hiệu gây ngán ăn xua đuổi côn trùng dầu neem có tác dụng làm bền hoạt chất azadirachtin [10, 11] Nh vậy, dùng dầu neem làm nguyên liệu để sản xuất thuốc bảo vệ thực vật sinh học Bảng Thành phần hàm lợng axÝt bÐo dÇu neem TT Thành phần axÝt bÐo AxÝt AxÝt AxÝt AxÝt AxÝt AxÝt AxÝt AxÝt AxÝt lauric (C12) myristic (C14) palmitic (C16) palmitoleic (C16=) stearic (C18) olªic (C18=) linoleic (C182=) linolenic (C183=) arachidic (C20) Năm 2002 Hàm lượng (%) Năm 2003 0,220 15,37 0,100 17,80 48,09 16,51 0,500 1,420 vết 15,00 0,090 17,96 47,96 17,03 0,500 1,470 Thử nghiệm hoạt lực chế phẩm thuốc bảo vệ thực vật có nguồn gốc từ dầu neem sâu xanh sâu tơ So sánh hiệu diệt sâu 15 công thức phối chế dầu neem bột Bt cho thấy chế phẩm phối trộn dầu neem bột Bt có hiệu lực diệt sâu xanh sâu tơ cao so với chế phẩm chứa dầu neem bột Bt Với sâu xanh, nồng độ xử lý 5%, chế phẩm dầu neem Bt đ có tác dụng diệt sâu xanh 100% sau ngày xử lý Với sâu tơ, sau 64 Năm 2004 0,120 16,51 20,56 43,62 17,28 0,500 1,400 ngày phun thuốc, đ đạt đợc tỷ lệ diƯt 100%, víi nång ®é xư lý 2,5% III KÕT LUậN Đ xây dựng đợc quy trình ép dầu neem nhiệt độ thấp máy ép dầu KOMET Đ xác định đợc hoạt chất sinh học chính: azadirachtin, nimbin salanin dầu bánh dầu từ nhân hạt neem trồng Việt Nam; hàm lợng azadirachtin bánh dầu cao lần dầu neem 3 Đ xác định đợc thành phần hàm lợng axít béo dầu neem Dầu neem chế phẩm dầu neem phối trộn với bột Bt có tác dụng diệt sâu xanh sâu tơ TàI LIệU THAM KHảO Dơng Anh Tuấn cs., 2002: Kết khảo nghiệm thuốc trừ sâu từ gốc thực vật sâu hại rau ngoại thành Hà Nội Hội nghị côn trùng học toàn quốc lần 4: 489-494 Hà Nội Dơng Anh Tuấn, 2002: Azadirachtin phân đoạn dầu neem hạt neem (Azadirachta indica) họ Meliaceae di thực vào Việt Nam có hoạt tính gây ngán ăn mạnh sâu khoang Hội nghị côn trùng học toàn quốc lần 4: 504-506 Hà Nội Nguyễn Ngọc Kiểng, 2000: Các phơng pháp thí nghiệm nghiên cứu khoa hoc Trờng đại học Nông-lâm, Tp Hồ Chí Minh Nguyễn Thị Quỳnh cs., 2001: Tuyển tập công trình nghiên cứu khoa học công nghệ (1999-2000) Viện Sinh học Nhiệt đới: 137140 Nxb Nông nghiệp, Tp Hồ Chí Minh Nguyễn Thị Phơng Thảo cs., 2001: Tuyển tập công trình nghiên cứu khoa học công nghệ (1999-2000) Viện Sinh häc NhiƯt 10 11 ®íi: 141-147 Nxb Nông nghiệp, Tp Hồ Chí Minh Trần Đình Phả, 1999: Nghiên cứu công nghệ nuôi nhân hàng loạt số loại côn trùng họ ngài đêm, cánh vy (Lepidoptera: Noctuidae) thức ăn nhân tạo phòng thí nghiệm Luận án tiến sỹ nông nghiệp: 169 Viện KH & KT NN ViƯt Nam, Hµ Néi Cooksey K E., 1971: The protein crystal toxin of Bacillus thuringiensis: Biochemistry and mode of action In: Microbial control of insects and mites: 247-274 Burges H D and Hussey N W (eds) Academic Press Inc (London) Ltd Falcon L A., 1971: Use of bacteria for microbial control In: Microbial control of insects and mites: 67-95 Burges H D and Hussey N W (eds) Academic Press Inc (London) Ltd Randhawa N S., Parmar B S., 1996: Neem New Age International (P) limited, Publishers, New Dehli Zebits C P W., 1995: Oil crop In: The neem tree (Azadirachta indica A Juss) and others Meliaceous plants: 390-392 WeinhenNewYork-Basel-Cambridge-Tokyo Kumar J and Parmar B S., 1996: Journ Agric Food Chem., 44 (8): 2137-2143 Investigation of the contents of three main bio-active substances in the seed oil of the neem trees planted in NinhThuan province, Vietnam Vu Van Do, Nguyen Tien Thang, Ngo Ke Suong SuMMARY By the cold pressing method of the neem (Azadirachta indica A Juss) seed kernels at 40oC, we have received 32.6% neem oil and 67.4% neem cake The results of the analysis on high performance liquid chromatography (HPLC) and gas chromatography (GC) showed that there were three main bio-active substances: azadirachtin, salanin and nimbin in the neem oil and neem cake; the azadirachtin contents in the neem cake were times higher than that in the neem oil The neem oil consisted of saturated and unsaturated fatty acids; among them, the oleic acid (C18=)contents were the highest (43%-48%) and the lauric acid (C12) contents were the lowest (trace-0.12%) The 15 pestiside formulations from the neem oil and neem oil with Bt were made and tested on Heliothis armigera and Plutella xylostella The results showed that the neem oil itself and neem oil with Bt all affected to kill actively the insects Ngµy nhËn bµi: 10-8-2003 65 ... Bánh dầu đợc đóng gói bảo quản làm nguyên liệu để sản xuất phân bón sinh học Đóng gói, bảo quản Hàm lợng hoạt chất sinh học dầu bánh dầu neem Trong dầu bánh dầu neem, có mặt ba hoạt chất sinh học. .. khảo sát sơ bộ, nhận thấy thu đợc phần lớn hoạt chất azadirachtin có bánh dầu dung môi thích hợp cồn 96o Bảng Hàm lợng hoạt chất sinh học dầu bánh dầu neem TT Hàm lượng (%) B¸nh dầu neem Dầu neem. .. trình ép dầu neem nhiệt độ thấp máy ép dầu KOMET Đ xác định đợc hoạt chất sinh học chính: azadirachtin, nimbin salanin dầu bánh dầu từ nhân hạt neem trồng Việt Nam; hàm lợng azadirachtin bánh dầu