Lan hài hồng (Paphiopedilum delenatii) là một trong những loài hoa lan rất khó thực hiện nhân giống vô tính, việc tìm ra một phương pháp mới, đơn giản để tạo ra một số lượng lớn cây giống trong thời gian ngắn hết sức cần thiết. Trong nghiên cứu này, các chồi non lan hài hồng có 4 lá được cấy vào môi trường SH có bổ sung 0,5 mg/l BA, 0,5 mg/l NAA, 30 g/l đường sucrose, 9,0 g/l agar, 1 g/l than hoạt tính và được nuôi trong điều kiện che tối hoàn toàn trong 4 tháng nhằm kéo dài các đốt thân; sau đó được đưa ra điều kiện chiếu sáng thêm 2 tháng để lá tổng hợp diệp lục tố và các năng lượng cần thiết cho cây. Kết quả cho thấy, các chồi non được kéo dài trung bình 10,50 cm, với số lá mới hình thành trung bình 5 lá/chồi, tương ứng với 5 đốt/chồi thu được sau 120 ngày nuôi trong điều kiện tối. Sau đó, các chồi được đưa sang điều kiện chiếu sáng 60 ngày, các chồi non tiếp tục hình thành lá mới, tuy nhiên, không nhận thấy có sự phân đốt. Sau 180 ngày nuôi cấy, các chồi được cắt thành 5 đốt riêng biệt với 1 lá và 1 rễ, riêng phần đỉnh chồi được giữ nguyên với 3 lá và 2 rễ. Cuối cùng, các đốt thân được trồng trên giá thể dớn Đài Loan thu được kết quả cao nhất ở vị trí đốt thân số 1 với tỷ lệ sống sót (100%) sau 12 tháng.
TẠP CHÍ SINH HỌC 2014, 36(1se): 272-276 SỬ DỤNG PHƯƠNG PHÁP CẮT ĐỐT VÀ TRỒNG TRỰC TIẾP RA VƯỜN ƯƠM CÂY LAN HÀI HỒNG (Paphiopedilum delenatii) Vũ Quốc Luận1, Nguyễn Phúc Huy1, Đỗ Khắc Thịnh2, Dương Tấn Nhựt1* Viện Nghiên cứu Khoa học Tây Nguyên, Viện Hàn lâm KH & CN Việt Nam, *duongtannhut@gmail.com Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp Miền Nam, Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam TÓM TẮT: Lan hài hồng (Paphiopedilum delenatii) lồi hoa lan khó thực nhân giống vơ tính, việc tìm phương pháp mới, đơn giản để tạo số lượng lớn giống thời gian ngắn cần thiết Trong nghiên cứu này, chồi non lan hài hồng có cấy vào mơi trường SH có bổ sung 0,5 mg/l BA, 0,5 mg/l NAA, 30 g/l đường sucrose, 9,0 g/l agar, g/l than hoạt tính ni điều kiện che tối hồn tồn tháng nhằm kéo dài đốt thân; sau đưa điều kiện chiếu sáng thêm tháng để tổng hợp diệp lục tố lượng cần thiết cho Kết cho thấy, chồi non kéo dài trung bình 10,50 cm, với số hình thành trung bình lá/chồi, tương ứng với đốt/chồi thu sau 120 ngày ni điều kiện tối Sau đó, chồi đưa sang điều kiện chiếu sáng 60 ngày, chồi non tiếp tục hình thành mới, nhiên, khơng nhận thấy có phân đốt Sau 180 ngày ni cấy, chồi cắt thành đốt riêng biệt với rễ, riêng phần đỉnh chồi giữ nguyên với rễ Cuối cùng, đốt thân trồng giá thể dớn Đài Loan thu kết cao vị trí đốt thân số với tỷ lệ sống sót (100%) sau 12 tháng Từ khóa: Paphiopedilum delenatii, nhân giống vơ tính, phương pháp cắt đốt MỞ ĐẦU Lan hài hồng (Paphiopedilum delenatii) loài lan đặc hữu Việt Nam Lan hài hồng không cho hoa đẹp, q, có hương thơm nở nên nhiều người ưa chuộng [8] Hiện nay, lan hài hồng xếp vào loài lan bị đe dọa có nguy tuyệt chủng [1] Cho tới nay, có số báo cáo nghiên cứu nhân giống vơ tính lan hài hồng: phương pháp gây viết thương [6], phương pháp kéo dài đốt thân in vitro lan hài hồng có nguồn gốc từ hạt để gia tăng hệ số nhân chồi [5] Luan et al (2012) [2] chiếu xạ PLB có nguồn gốc từ hạt tạo giống đột biến đối tượng lan hài hồng Luan et al (2012) [4] sử dụng chồi non tháng tuổi ex vitro phục vụ cho trình tạo mẫu ban đầu sử dụng phương pháp hủy đỉnh để nhân nhanh tạo hoàn chỉnh in vitro Để khắc phục khó khăn q trình tạo mẫu tăng số mẫu cấy ban đầu, Luan et al (2012) [3] sử dụng ánh sáng đơn sắc để kéo dài chồi lan hài hồng ex vitro nhằm tạo điều kiện thuận lợi cho trình thu mẫu khử trùng mẫu phục vụ cho trình tạo mẫu ban đầu Sau đó, sử dụng phương pháp gây vết thương chồi 272 non để kích thích tạo chồi bên tạo hồn chỉnh Để giảm chi phí q trình nhân nhanh chồi tạo hồn chỉnh Trong nghiên cứu này, kéo dài chồi in vitro điều kiện tối tháng đưa điều kiện chiếu sáng thêm tháng Sau đó, sử dụng phương pháp cắt đốt trồng trực tiếp vườn ươm VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Vật liệu nghiên cứu chồi non in vitro lan hài hồng có chiều dài khoảng cm có số trung bình lá/chồi ni cấy Phòng Sinh học phân tử Chọn tạo giống trồng thuộc Viện Nghiên cứu Khoa học Tây Nguyên Những chồi đưa vào điều kiện tối tháng nhằm kéo dài chồi tạo thành đốt riêng biệt Sau đó, chúng đưa điều kiện chiếu sáng thêm tháng để tổng hợp chất diệp lục lượng cần thiết Cuối cùng, chúng cắt thành đốt riêng biệt trồng điều kiện vườn ươm Kéo dài chồi in vitro lan hài hồng điều kiện che tối hồn tồn Các chồi non có cấy vào môi trường SH (Schenk & Hildebrandt, 1972) [7] có Vu Quoc Luan et al bổ sung 0,5 mg/l BA, 0,5 mg/l NAA, 30 g/l đường sucrose, 9,0 g/l agar, g/l than hoạt tính đưa vào điều kiện che tối hoàn toàn tháng nhằm khảo sát ảnh hưởng điều kiện che tối hoàn toàn lên khả kéo dài chồi in vitro Khảo sát khả sống sót đốt thân vườn ươm Các chồi in vitro đặt điều kiện che tối tháng, sau đó, đưa điều kiện chiếu sáng đèn huỳnh quang với cường độ chiếu sáng 2.500-3.000 lux thời gian chiếu sáng 16/8 (sáng/tối) tháng nhiệt độ phòng 25±3ºC Cuối chồi cắt thành đốt riêng biệt trồng vườn ươm với giá thể dớn Đài Loan sau 12 tháng Xử lý số liệu Đối với công thức kéo dài chồi in vitro điều kiện che tối hoàn toàn, lần xử lý với bình, bình có chồi non thí nghiệm cắt đốt trồng vườn ươm lần xử lý 25 đốt với đốt thân/chậu Thí nghiệm lặp lại lần, số liệu xử lý cách sử dụng phần mềm phân tích thống kê SPSS 16.0 theo phương pháp Ducan test với α=0,05 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Khảo sát kéo dài chồi in vitro lan hài hồng điều kiện che tối hoàn toàn Bảng Ảnh hưởng điều kiện che tối lên kéo dài chồi in vitro lan hài hồng Thời gian che tối (ngày) Chiều cao chồi (cm) Số /chồi Chiều dài (cm) Chiều rộng (cm) Số rễ hình thành/ đốt Màu sắc Đối chứng 120 ngày sáng 4,25d 3,00c 4,95a 3,37a 0,00c Chồi xanh đậm 30 4,37d 1,00e 3,80b 1,65b 0,00c 60 5,65c 2,42d 3,00c 1,45bc 0,00c 90 7,12b 3,75b 2,22d 1,15c 1,82b 120 10,50a 5,00a 2,00d 1,12c 3,37a Lá non hình thành có màu xanh nhạt Lá gốc màu vàng, non có màu xanh trắng Lá gốc màu vàng, non có màu xanh trắng Lá gốc màu nâu, non có màu xanh trắng Ảnh hưởng điều kiện che tối hoàn toàn lên khả kéo dài đốt thân sau 120 ngày bảng Các chồi non đặt điều kiện che tối hoàn toàn cho thấy khác biệt rõ rệt chiều cao sau 30, 60, 90 120 ngày ni cấy (hình 1a-e) Trong nghiên cứu này, sau 30 ngày nuôi cấy, phần đốt bắt đầu kéo dài, non có màu xanh nhạt, phần gốc có màu trắng thiếu ánh sáng để tổng hợp diệp lục tố Sau 60 ngày nuôi cấy, chiều cao chồi tăng rõ rệt, đốt lóng thứ vượt khỏi phần tầng cũ, chiều dài ngắn lại khơng nhận thấy có xuất rễ mắt đốt Kết thu nhận sau 90 ngày nuôi cấy cho thấy, chiều dài chồi đạt 7,12 cm kéo dài đốt lóng thân đạt từ 11,5 cm, chiều dài ngắn chiều rộng tiếp tục thu hẹp 1,15 cm (bảng 1), non có màu gần trắng, gần gốc bắt dầu ngả sang màu vàng Trong đó, rễ bắt đầu xuất mắt thân với rễ/mắt (hình 1c) Sau 120 ngày ni cấy, chiều cao chồi đạt 10,50 cm với hình thành, chiều dài chiều rộng thu hẹp, có màu gần trắng 273 TẠP CHÍ SINH HỌC 2014, 36(1se): 272-276 hồn tồn thiếu diệp lục tố phần đỉnh chồi cao tới miệng bình ni cấy (hình 1e), gốc chuyển sang giai đoạn hóa nâu hoại tử Các rễ non tiếp tục dài hình thành thêm rễ mới, trung bình 3,37 rễ/chồi mắt thân non Kết nghiên cứu khác kéo dài chồi in vitro hệ thống chiếu sáng đơn sắc LED phục vụ cho trình nhân giống đối tượng lan hài hồng kết thu có chiều cao trung bình 10 cm điều kiện 100% LED đỏ ánh sáng đèn huỳnh quang cường độ thấp [6] Luan et al (2012) [3] kéo dài chồi ex vitro đối tượng lan hài hồng điều kiện chiếu sáng đèn LED điều kiện tối thu chiều cao chồi trung bình 11 cm điều kiện chiếu sáng 100% LED xanh với 5,75 lá/chồi Trong điều kiện tối với chiều cao trung bình đạt 8,87 cm lá/chồi, chiều rộng trung bình điều kiện LED xanh tối giảm dần đạt 1,35-1,60 cm, chiều dài trung bình đạt 5,75-6,12 cm Trong nghiên cứu chúng tôi, kéo dài chồi điều kiện tối hồn tồn sau 120 ngày ni cấy đạt chiều cao 10,50 cm với số hình thành trung bình lá/chồi Hình a Đối chứng 120 ngày nuôi cấy điều kiện chiếu sáng; b Nuôi cấy 30 ngày tối; c Nuôi cấy 60 ngày tối; d Nuôi cấy 90 ngày tối; e Nuôi cấy 120 ngày tối; f Nuôi cấy 180 ngày; g Cắt thành đốt riêng biệt; h Trồng đốt riêng biệt giá thể dớn Đài Loan; i, j Cây vị trí đốt thân số sinh trưởng vườn ươm sau 12 tháng; k Cây hình thành vị trí đốt thân sau 12 tháng vườn ươm 274 Vu Quoc Luan et al Khảo sát khả sống sót vị trí đốt thân ngồi vườn ươm sau 12 tháng Các chồi in vitro kéo dài đốt thân điều kiện tối chuyển sang điều kiện chiếu sáng sau 180 ngày cắt thành đốt riêng biệt trồng trực tiếp vườn ươm giá thể dớn Đài Loan (hình 1h) Kết thu nhận sau 12 tháng cho thấy, khả sống sót q trình sinh trưởng phát triển có khác biệt vị trí đốt thân Ở vị trí số (tương ứng với chồi đỉnh) cho tỷ lệ sống sót 100% chồi đỉnh tiếp tục có gia tăng tất tiêu theo dõi (bảng 2) (hình 1ij) Tỷ lệ sống sót cao giải thích vị trí đỉnh chồi trồng vườn ươm có trung bình rễ, điều gia tăng khả quang hợp hút nước cho tốt (hình 1g1) Trong đó, vị trí đốt thân số 2, khả sống sót thấp (23,75%) số mẫu chết cao khơng có hình thành chồi bên mắt đốt thân non nên trồng vườn ươm chúng bị thối hồn tồn Ở ví trí đốt thân số cho tỷ lệ sống sót thấp 33,75 32,50% cắt đốt thân, tạo vết thương trồng giá thể có độ ẩm cao tạo điều kiện cho vi sinh vật công vào vết thương làm cho mẫu bị thối, đó, tỷ lệ sống sót giảm Tuy nhiên, mẫu sống sót vị trí số có hình thành chồi bên trung bình tương ứng 0,75-0,72 chồi/mẫu (bảng 2) phát triển thành hoàn chỉnh với số hình thành trung bình 2,50-3,12 lá/chồi (hình 1k-3,4) Ở vị trí số (tương ứng với đốt gốc), kết cho thấy khả sống sót (56,25%) hình thành chồi tương đối thấp (0,53 chồi/mẫu) (bảng 2) Kết giải thích phần gốc bị già hóa, trồng vườn ươm, mắt đốt bắt đầu chuyển sang giai đoạn lão suy khả quang hợp, đó, khả kích thích hình thành chồi bên bị giảm Phương pháp cắt đốt tạo hoàn chỉnh in vitro đối tượng lan hài hồng mô tả Nhut et al (2007) [5] với kết đạt 75% tạo hồn chỉnh Trong đó, Luan et al (2012) [3] sử dụng phương pháp cắt đốt chồi ex vitro lan Hài hồng phục vụ cho trình tái sinh in vitro với tỷ lệ đạt 33,50% Ngoài ra, phương pháp cắt hom kết hợp xử lý phân bón để kích thích tạo chồi bên đối tượng lan Mokara báo cáo Dương Hoa Xô (2007) [9] với kết thu 4,5-5 chồi/cây Trong nghiên cứu này, chồi đỉnh cho tỷ lệ sống sót 100%, từ chồi non ban đầu sau kéo dài đốt thân tạo (1+0,75+0,72+0,53 chồi/mẫu) hoàn chỉnh từ đốt thân Bảng Ảnh hưởng vị trí đốt thân lên khả sống sót phát triển ngồi vườn ươm sau 12 tháng Tỷ lệ Tỷ lệ Vị trí Số chồi Số Chiều mẫu mẫu đốt hình hình rộng Hình thái chồi sống chết thân thành/mẫu thành (cm) (%) (%) 100,00a 0,00d 1,00a 3,87a 3,07a Chồi to, khỏe d a d d 23,75 76,25 0,00 0,00 0,00d Không tạo chồi 33,75c 66,25b 0,75b 2,50c 1,42c Chồi yếu, xanh nhạt c b b b c 32,50 67,50 0,72 3,12 1,45 Chồi yếu, xanh nhạt 56,25b 43,75c 0,53c 4,12a 2,12b Chồi to, xanh đậm KẾT LUẬN Chồi sinh trưởng kéo dài điều kiện tối sau 120 ngày nuôi cấy cho chiều cao tương ứng 10,50 cm tạo số đốt trung bình cao đốt/chồi Chồi tiếp tục nuôi cấy điều kiện chiếu sáng đèn huỳnh quang sau 60 ngày với cường độ chiếu sáng 2.500-3.000 lux thời gian chiếu sáng 16/8 (sáng/tối) Khả sống sót sinh trưởng tốt giai đoạn vườn ươm với tỷ lệ 100% giá thể dớn Đài Loan thu vị trí đốt số với số hình thành trung bình 3,87 lá/chồi với chiều rộng 3,07 cm Như vậy, từ chồi in vitro ban đầu sau kéo dài đốt thân sau 180 ngày, cắt đốt trồng giá thể dớn Đài Loan tạo hoàn chỉnh (1+0,75+0,73+0,53 chồi/mẫu ) ngồi vườn ươm sau 12 tháng 275 TẠP CHÍ SINH HỌC 2014, 36(1se): 272-276 Lời cảm ơn: Các tác giả xin chân thành cảm ơn Quỹ Nafosted, mã số 106.16-2012.32 Viện Nghiên cứu Khoa học Tây Nguyên tạo điều kiện cho chúng tơi hồn thành nghiên cứu TÀI LIỆU THAM KHẢO Convention on International Trade in Endangered Species of Wild Fauna and Flora Appendices I, II and III Geneva, Switzerland, 2008 Available at: http://www.cites.org/eng/news/SG/2011/20 110512_SG_CIC.php Luan Q L., Uyen N H P., Ha V T T., 2012 In vitro mutation breeding of Paphiopedilum by ionization radiation Sci Hort., 144: 1-9 Luan Q V., Huy N P., Tra L T T., Thinh D K., Nhut D T., 2012 Light-emitting diodes (LEDS) for ex vitro shoot elongation an shoot regeneration of paphiopedilum delenatii J Biotechnol., 10(4A): 961-968 Luan V Q., Huy N P., Thinh D K., Nhut D T., 2014 Utilizing the technique of wounding the shoot apex in micropropagation of Paphiopedilum delenatii J Scitechnol (Accepted) Nhut D T., Thuy D T T., Don N T., Luan V Q., Hai N T., Tran Thanh Van K., Chinnappa C C., 2007 Stem elongation of Paphiopedilum delenatii Guillaumin and shoot regeneration via stem node culture Prop Orn Plant., 7(1): 29-36 Nhut D T., Trang P T T., Vu N H., Thuy D T T., Khiem D V., Tran Thanh Van K., 2005 A wounding method and liquid culture in Paphiopedilum delenatii propagation Prop Orn Plant., 5(3): 158-163 Schenk R U., Hildebrandt A C., 1972 Medium and techniques for induction and growth of monocotyledonous and dicotyledonous plant cell cultures Canadian Bot., 50: 199-204 Nguyễn Thiện Tịch, 2001 Lan Việt Nam, Nxb Nông nghiệp, Hồ Chí Minh Dương Hoa Xơ, 2007 Ứng dụng số tiến kỹ thuật việc nhân giống cải thiện chất lượng cành hoa nhóm hoa lan cắt cành Mokara Hội nghị khoa học Công nghệ sinh học thực vật công tác nhân giống chọn tạo giống hoa Nxb Nông nghiệp, 341-347 USING IN VITRO STEM NODE CUTTING METHOD IN PROPAGATION OF Paphiopedilum delenatii Vu Quoc Luan1, Nguyen Phuc Huy1, Do Khac Thinh2, Duong Tan Nhut1 Tay Nguyen Institute for Scientific Research, VAST Institute of Agricultural Science for Southern Vietnam, VAGS SUMMARY Paphiopedilum delenatii is recalcitrant to micropropagation Lack of high efficient method for massive production of seedlings has existed for many years In this paper, young shoots with leaves were cultured on SH medium containing 0.5 mg/l BA, 0.5 mg/l NAA, 30 g/l sucrose, g/l agar and g/l activated charcoal and maintained under total darkness for months before transferred into fluorescent light at a PPFD of 45 µmol m−2s-1 for months After months cultured under darkness, the shoots were extended for an average of 10.5 cm, with leaves/ shoot, equivalent to nodes/ shoot After the next months under fluorescent light, leaf formation was obtained but no stem node induction was observed Shoots were then excised into single nodes with leaf and root per node, and the apical shoots developed with leaves and roots each Finally, nodes with well-developed root and leaf systems were grown in sphagnum moss (Taiwan) and gave the survival rate of 100% after 12 months Keywords: Paphiopedilum delenatii, cutting method, stem node, propagation Ngày nhận bài: 15-7-2013 276 ... giảm Phương pháp cắt đốt tạo hoàn chỉnh in vitro đối tượng lan hài hồng mô tả Nhut et al (2007) [5] với kết đạt 75% tạo hoàn chỉnh Trong đó, Luan et al (2012) [3] sử dụng phương pháp cắt đốt chồi... ngày; g Cắt thành đốt riêng biệt; h Trồng đốt riêng biệt giá thể dớn Đài Loan; i, j Cây vị trí đốt thân số sinh trưởng vườn ươm sau 12 tháng; k Cây hình thành vị trí đốt thân sau 12 tháng vườn ươm. .. sót vị trí đốt thân vườn ươm sau 12 tháng Các chồi in vitro kéo dài đốt thân điều kiện tối chuyển sang điều kiện chiếu sáng sau 180 ngày cắt thành đốt riêng biệt trồng trực tiếp vườn ươm giá thể