Động học xúc tác enzim

Đ Ạ i H Ọ C Q U Ổ C (ỈIA HẢ NỘI TRƯ Ờ N G ĐẠI HỌC KH O A HỌC T ự NHIÊN LÊ ĐỨC N G Ọ C ĐỘNG HỌC XÚC TÃC ENZIM NHÀ X t À T BÁN N Ò N G N G H IỆ P HÀ NỒI - 2005 LỜ i NÓI Đ Ầ U Đ ộng học xúc lác enzim sớ khoa học trực tiếp cho ngành Enzim itọc Công Hịịhệ llo sinh (m ột phận quan trọng cùa Cơng nghệ Sinh học) Ngồi ra, Dộiìịị học xiic lúc enzim kiến thức khơng thể thiếu cho nghiên cứu ứng dụng enzim G iáo írình "'Động học x ú c tác enzim " soạn lại trôn sờ giáng cho học viên ngành Lý sinh, Hoá sinh cán nghiên cứu Hoá sinh quan quanh Hà Nội 20 nãm qua Chúng tỏi chù trưcmg biên tập giáo n h mộỉ cách ngán gọn, xúc tích, báo dám tính bán, tính khoa học lính kịp thời phục vụ cho lất uong nghiên cứu có liên quan đến Enzim Chúng lòi m ong muốn chi dẳn cúa độc giá vể diểm sai sót ciia lập giáo ir ìn h này, dổ có điều kiện in lại tốt hem Hà Nội, - 2004 TÁC GI M C LC ô I.ề H iú i áu Phánl C S Ở H Ó A LÝ C Ủ A X Ú C T Á C ENZIM Chươììg / Những khái niệm VCdộng học xúc tác hô học 1.1 Động học hố học 1.1 L Định n g lm 1.1.2 C ác thổng số d ặc irưng cho m ội phản ứng L2 C ché động h(K cù a phảỉì ứng hố học J1 1.2.1 Thuyếl va chạm hoạỉ dộng 1.2.2 Thuyéỉ phức hoại dộng 1.3 Xúc lác hoá học 1.3.1 DỊnh nghía 1.3.2 PhAn loụi 11 12 12 (2 13 C hiam g Xúc (ác V.n/Ằm 2-1 Đ ịnlì ng h ĩa 2.2 Phảii loại 14 2.2.1 Phan loại iheo phản ứng xúc tác enzim : loại 14 14 2.2.2 Ilìân loại theo chức 17 2.2.3 R iàn loại th e o c íư irúc 17 2.3 Cấu ÍỊIO ciư.iỉìì 2.3 l Cấu cạo giốnc protein 17 17 23.2 Cấu tạo kliác proiein [7 CliU(rfif> ỉ , C sỡ h o lý c ú a x ú c c cn7Jm >.1, C c h ế xúc tác t ú a M ichaelis‘ M caien 3.1.1 C xúc lác 18 18 3.1.2 Biéu dién dộng học phản img xúc tác bời enzim iheo c h é M ichaelis-M enlcn u Pỉiươỉig trình động học dìmg (heo mảu M ichaclis-M enten ^.2 Cơ chẽ xúc tác M ichaeĩis-M enica 3.2 L Đặl vâJi dỂ 3.2.2 Khảo sál Iheo ihuyêì va chạm hoạt dộng 3.2.3 Kháo sát iheo ihuyêì phức hoại động 3.3 Bản chấỉ ỉuơng ỉác proiein enzim (E) gổc chất (R) 19 20 21 23 3.4 Các nguyôn l6 làm cho xúc íảc cnzim có hiệu cao ,4 1'ưcmg lác hấp phụ 23 23 18 ỉ8 19 3.4.2 Xúc rđc da chức 2? 3.4.3 Tươiig tác quanh lâm 23 Chư(/ììg Đ ộng học xúc lác cn /jm 4.1 Đại cưưng vé dồng học xúc lác enzini 25 1, í Dịnh nghĩa [.2 ý nghía 4.1.3 PhAn loại 4-2 Cơ chơ dộng học 4.2.1 ĐỊnlì nghĩa 25 25 25 26 26 4,2-2- Cách biỂu ctiẻn c h ế dộng học 4.2.3 M ối quan hệ giữa: Ca chế động học phương (rình ctộng học kếí ihực nghiệm 4.3 Quan hệ giừa hoại dộ vù lốc dộ phản ứng mội c h ế phẩm enzim 4.3.1 Định nghĩa chung 2() 20 27 27 4.3.2 Đ on vị E íu im 4.3.3 Hoại dộ phân lử enzim: (só vòng quay cùa enzim ) 4.3.4 Hoại dộ tâm xúc 27 27 27 4.3.5 Hoạr dộ riẽng m ội c h í phẩm enzim 27 Chương Các phương pháp lập phương ỉrmh động học dừng 5.1 Thí dụ * 28 5.2 Phương pháp King-Altman (1956) (Qui tấc sơ dồ) 30 5.3 Qui lắc cấu trúc cùa W ong-Hamles ( Ỉ962) 5.4 Phương pháp M ,v Volkcnsiein (1966) (phương pháp dổ hình) 5.4.1 Những khái niệm cùa tht tốn dổ hình 5.4.2 Lặp phươiìg irìrìh dòng học ilìeo phương pháp đổ hình 31 5-4.3 T hí dụ áp đụng 4 Cải íiến phưcmg pháp đỏ hình cho phản ứng enzim phức ỉạp M 32 33 34 H) 5.4.5 Phương irình dổ hình áp (lụng cho cợ c h ế bao gổm giai doạn cần bảng giả cần bàng Chưỉỉỉig C c phirơng p h p hố Iv n^hícn cứu đ ộ n g học En;rim 6-1 Kỹ Ihuặl nghiẻn cứu tÔc dỏ phản ứng Enzim ò irạng thái đừng 39 6.1.1 Kỹ thuậi phân tích hố học: (Kỹ ihuậi động học) 39 K ỹ thuậl dùng máy pH 39 6.1.3 Kỹ Ihuậi điện hoá 40 6.1.4 Kỹ ihuậl quang phổ 6.2 Kỹ thuật nghi6n cứu (tông học enzim trạng thái tién ciừng 6.3 Kỹ thuật nghién cứu lốc dộ phản ứng cnzim trạng thái cản 40 42 44 Phán II ĐỘNG HỌC PHA DÙNG Chươỉig Đỏng học phản ứng enzỉm có chái Phân loại c h ế động học cúa phản ứng cnzim cỏ I chấí 7.1-1 Q ua m ộỉ chái irung gian: ỉạo phức ES Ịrtìản ứng hai giai doạn 1.2 Q ua hai chái trung gian: ỉạo phức ES phản ứng ba glâi doạn 43 45 45 7.2 Phản ứiìg qua c h li rrung gian 7.2 ỉ Trường hợp [S\o » [El, *^5 7.2.2 Trường hợp [S 1„«[E I, 7.2.3 Trưemg hợp [Sin« [E]n 7.2.4 V í dụ m inh hoạ: 48 -^0 51 7.3 Phản ứng qua hai chấi irung gian 7.3 l Trường hợp phảii ứng thuận nghịch -^3 53 7.3.2 Trường hợp phản ứng khổng Ihuận nghịch 7.4 Dạng lích phân phương irình i6c dộ cho c o c h ế động học cùa phản rmg enzim chát • sản phẩm ChUfmg Động học kìni hâm hoại hố phản ứĩìẸ xúc tác hìn Cĩì/im 8.1 Dại cươiig 8.1.1 ý nghĩa cùa việc nghíốiì cứu dộng học kìm hăm hoạỉ hố 59 1.2 M ột số khái niệm 8.2 Các c h ế dộng học cùa kìm hãm 59 60 8.2.1 Kìm hãm cạnh iranh 60 8.2.2 Kìm hăm khỏng cạnh iranh (non-(un)- Com peliíivcInhibition) 60 8.2.3 Kim hãm phửc enắm - C châì (Hnti-(in-)- Competiỉive Inlùbiiion) 61 8.2.4 Kìm hãm hỗn hợp: (M ixed '(.non- Competitive and Competitive) Inhibiiíoíi) 61 8.3 Các ché động học cùa hoạt hoá 8.3 61 l Hoại hoá loại phức cáu enzim 62 8.3.2 Hoạt hoá kiểu phức cáu chất 62 8-3-3 Hoại hoá kiéu phức cáu kim loại 62 8-3.4 Hoại hố kiểu phức vòng 63 8.4 Phương Irình tốc độ có chất ảnh hưòng 63 8-4 [ Phương Irinh tổng quái 63 8-4.2 Phương Irình tóc ciộ irường hợp kìm hãm cạnh tranh 64 8.4-3, Phưcmg !rinh iốc độ irường hợp kìm hãm khơng cạnh iranh 66 8.4.4 Phương trình róc dộ trưòng hợp kim hãm phức enzim* cháỉ 67 8.4.5 Phương irìrih íổc độ ìrườỉìg hợp hoạt tìố ngồi 69 8.4.6 Phương irlniì tốc độ irườiig h c^ hoạt hố phức cẩu chất 70 8.4.7 ttìươiig irình lóc độ Irường h c^ hoại hoá tâm (Sinerger activation) 70 8.4.8 Phương trình lốc độ trường hợp kim hăm hay hoạt hố hỗn hc^ 71 C c tr n g h ợ p p h ứ c l p k h c 73 8.5.1 Trường hợp kìm hâm cạnh (ranh k 0; M uốn phản ứng xảy theo chiều thuận, phải cung cấp nâng lượng AG = 0: Phàn úng có trạng thái cân bảng AG < 0: Phản ứng lự xảy 1.2 C O C H Ê Đ Ộ N G H Ọ C CỦA PH Ả N ÚN G H O Á H Ọ C 1.2.1 T h u y ết va c h ạm h o t dộng Khảo sál phản ứng: A + B c - T heo A reniuyl (1889); Muốn phàn ứng xảy phải có va chạm, tốc độ phản ứng phụ ihuộc vào nồng độ chất tham gia phản ứrig: co= k[A][B] - Không phải va chạm cho kết có va chạm phàn từ có lượng đủ lớn (đã hoạt hố) cho kết sỏ' phân tử có nâng lượng dủ lớiì - nãng lượng hoạt hố írong mội hỗn hợp tuân theo quy luật phân bố: M anvoel Boltznian: -E (0 = k[A](B]e«T' I ■>11 Va chạm phân tử có đù lượng - hoạt hố phải hướng cho kết Khi đó, tốc độ phản ứng: -E co= p k „ [A ].[B ].£ ^ = p c „ e (ĩ) Trong (I) yếu tơ' lập thể (2) yếu tố va chạm (3) yêu tố lượng RT Trong đó: Ụ“ „ * k j + k _ j + k , k-,k.,[E ]o V =— '^P k_) + k^2 ■*■^-2 k „ (k ,3 + k j+ k ,3 ) Kp = k_,k_2 + k |k ,+ k ^ k k - (k | + k , j + k ) - Khi [P]=0 (Tốc độ ban đẩu)-phản ứng thuận (5.8) trờ thành (5.9): K ,+[S] -Còn (S]=0 (Tốc độ cuổi cùng) phản ứng nghịch (5.8) trờ thành (5.10); (5,10) v.= " K.,+[P] Cả hai (5.9) (5.10) có dạng dộng học M ichaelis-M enten 5.2 PH Ư Ơ N G P H Á P K IN G -A L T M A N (1956) (Q ui tắc sơ đổ) King-Altm an đưa qui tắc sơ đổ đế thu dược trực tiếp số hạng định thức không giản uớc (5.4) cho m ội chê' động học Q u i tác sơ đồ: "Đối vối chế dộng học gồm n dạng enzim, biểu Ihức khai iriển cùa định thức cho dạng enzim thứ i ([E,]) tổng sổ n số hạng đương, mù mỏi sô' hạng lích số cùa n -l số lốc dó bậc hay giả bậc 1* ( số tốc độ bâc I = có sơ' cùa giai đoạn phản úĩig có bậc hàng sơ' tốc độ bậc = tích sỗ’ cùa hàng số tốc độ bậc vói nồng độ chất hay sàn phẩm giai đoạn phàn ứng có bẠc 2) mộl sơ đổ khơng khép kín vẽ từ giai đoạn đầu đến lạo thìmh dạng cnzim thứ i (Ei) Khi đó, biểu thức E,/E„ có dạng: (MI) ĨE ]„ D , , + D , , + D,_ Á p dụng cho thí dụ dã xét: - Cho dạng [E]; ta lập sơ đồ lìm dược E E E y ES *^í;EP y ES b) Khi CÓ 1 ỘI vài cung, di lừ núl khác đến nút r ihì có ihé thay mộl cung có độ lớiì bầng tích số độ lứn cung dẫn đến r k| kikjki k' c) Khi có đổ hình có cấu trúc đối xúng, cho tưcmg đưcmg với đồ hình khác đơii giàn A 2C B 5.4.2 L ập p h o ng trìn h đ ộ n g học th e o phư ng p h p dồ hình u C õng thứ c tổ n g quát: (5.Ỉ3) v=^ Trong đó: D, = Định thức cho dạng cnzim sinh sản phẩm D, = Định thức cho dạng enzim m ất đl sản phẩm Ds = Định ihức cho dạng enzim k., = hầng sô lốc dộ cùa giai đoạn sinh (+) hay di (-) sàn phẩm, r = sô' giai đoạn diễn biến chế / Có h a i trư ờng hợ p rién g th n g gập: - Trong trường hợp đổ hình có m ột lối không thuận nghịch, tức phàn ứng enzim ẹó mội dạng sinh sản phẩm , phương trình tớc độ có dạng, (5.14) ẹ d s ; - Trong trường hợp đồ hình có m ột lối thuận nghịch, ỉức phàn ứng có m ộl dạng enzim sinh sản phẩm inà giai đỉn lại thuận nghịch: (5.15) ID Như vậy, thực châì phương pháp đồ hình M v Volkensiein toán học hoá qui tầc sơ đổ kinh nghiệm cúa King-Altman 5.4.3 T hí dụ áp dụng T hí dụ I: Lập phương trình dộng học cho chế M ichaelis-M enlen; E+ s ES —^ E+ p - Đ hình: p k.JS] ♦ ,ES - Đ ịnh thức: Di; = k.| + D p ^ = k J S ] - Phương irình: k k J S ] [ E L k _ ,+ k ,j+ k ,,[ S ] i^ [E]oĩS] ^ VJS] K,+[S] T hí dụ 2: Lập phương trình động học cho c h ế sau: E + s r ~ ^ ES EP - Đ ổ hình: k., E+ p Định thức: 1^1 “ ^1^-2 D ,,s = k ,J S ] k , + k [P] k + k„[S] k , D|.I'= k,|[SỊ k_2 + k.;k,x(P] + k.,[P] K ị Phương trình; k ,D ,,.- k ,D , V= fE]„ D , + D ^ + D,, + D,.p T hí dụ 3: Lập phucmg trình động học cho chế sau E+s ES — EA —^ E + Pj - Đổ hình: p - Định Ihức: D|; = ” k*|[S] D ka = k+|[S] k^.2 - PhươngIrình: ^ dP, - dl k A ^ D , + D,:^ + D,^ IE]„ [S],[E]„ V - k*3+k,, k-.+k>2 + [S) k*2+k., Thí dụ 4: Lập phương trình dộng học cho enzim có hai ưim hoạt động, xúc c iheo chê’dộng học sau; (đổ hình đối xứng) 2k ,+k k,+k., 2k E E S l.s £S - Vi hệ sô' ES = 2, nên độ lớn cung xuất phát íừ khơng phải nhân với2 - Độ lớn cung đến phải nhân với - Định thức: D , = ( k ,+ k ,) ( k , + M D ^ ,= D ,^ = ( k , [ S ] ) { k , + k ^ ) D ^ ',= k „ [ S ] k , [S] - Phương trình; 2[E], " K „ K ^ + K J S ] + [S f - Trong đó: k -1 + k -3 5.4.4 C ải tiến p h ong p h p đồ h ìn h ch o p h ả n ứng cn/.im phức tạ p H.J.Fromm (1970) đưa mộl phưcmg pháp lính dịnh ihức sờ cho phương pháp đồ hình dẻ’ iránh nhẩm lẫn phàn ứng phức tạp T h í d ụ : lập phương trình động học cho m ột enzim xúc tác phàn ứng có hai chất theo c h ế sau: k.,[A Cách lập định ihúx: cho dạng enzim liến hành sau: 1/ Chọn dạng enzim cần lập dịnh thức làm núí gốc llm độ lóiì cung dản đến nút gốc EA HAB 2/ Lấy độ iófn cùa cung dến nút gốc nhân với lícli sơ' dộ tóti tổng cung lập nên từ dạng cnzim lại đến dạng enzim khác (hai núl mội): T h íd ụ r Chọn cung EA — ~ ■* E ; Đ ộ lón cùa cung k.[ nhủn với dộ lớn cùa cung lại: k.,(EAB — -> EA + EAB — > E + EAB - - > EB)(EB —> EAB +EB — > E) = k,(k.2 + k ,,+ k ,) ( k , + k.j(A |) Tương tự cho cung EB -> E EAB — E lính được: k.,(EAB -— > EB + EAB -— > E + EAB — -> EA)(EA —>E +EA —> EAB) = k ,(k ^ + k , + k j K k I + k ,,[B ]) k*s(EB -—> E + EB -— > EAB)(EA —> E + EA —> EAB) = M k i + k,2[B] )(k., + K^ị A]) 3/ Định thức sở cho nút gốc chọn tổng số lích thu dược (nhân vào bỏ hệ sô' k.,.k*i, rút gọn ): D,,_ = k iM k J +k^0+ k,|k^[A ](k.j + M + k.;k.,[B l(k„ + k,,)+ k ,jk „ k ,,[A ]|B | Bằng cách tương tự ta tính D^:^, D e a D ị I, D |:^ u = k ^ ik ,[A ] ( k ì + k_, + k „ ) + cho thí dụ írẻn: + k O + k jk ,,k ^ [ A ] [ B ] D,;b= k.jk„[B l (k.j + k„ +k^0 + k^;k^,[B]^(k.4 + k „) + k ,k jk JA ][B l D eab= (k*|k,3k., + k |k „k ,^) [AJ [B] + k„k,jk,j[A )^ + k ^ ;k ,,k J A ][B l’ - Phương trình lốc dộ cùa c h ế có dạng: V = k*5Di:AH [E|o D, + D( ^ + D,inn + D ^AR 5.4.5 Phưong trình đồ hình áp dụng cho ché bao góm cã giai doạn cán bảng hoăc già cán bàng VolKenstein dã m rộng phưcmg pháp đồ hình áp dụng dổ viẽì phương trình động học cho phản ứng cnzim bao gổm giai doạn cân già cân Trong trường hợp lẠp đổ hình, giai đoạn cân bảng dáng nhẽ cung tương ứng ihay dườiig nối độ lớn cùa lỳ số số tốc dộ phàn ứng nghịch nêu h'nh theo chiéu thuận, chiều nghịch ngược lại (Tính thcc) số tốc dộ bậc hay giả bậc 1) Khi gọi M độ lớn cùa đường từ E„ đến E, biểu thức tốc độ có dạng: ^k ,M (m ^ r ) v = ^ ^ - [E]„ (5.16) y^M (m 1=1 - Trong đó: M (m —» r)= độ lớn đưcfng tính từ đường vào đến E, ỏ đưcỉiig (Ghi chú: I/Đ ường vào dường nối lừ dạng Enzim lự voà phản ứng 2/ Đưcmg dường nối từ dạng Enzim tạo thành sản phẩm Enzim lự do) M{m -> i)= độ lớn cùa đưcmg tính từ dạng E„, đến dạng E, dó mà tồn lại cân bàng k, = sô' tốc độ giai đoạn tạo sản phẩm T hí dụ: Lập phương Irình lốc độ cho phàn ứng enzitn có hai giai đoạn thuận nghịch cân bang theo c h ế sau; E+s < RS >E+p ĨỊí^s ES, - Đ ổ hình: K E - ^ E S — ►p ISl Ei S k | [ SỊ ^ hẳngsò' tốc độ thuận nghịch gi ả bậc _ s k, h ằ n g s ố iố c d ộ n g h ịc h bậc - Tính độ lớn: M (E -> E) = I M(E ES) = Ks M ( E ^ E S ) = H ,M = Ì ! L - Phưcmg trình tốc d ộ ; k ;® [E ] Ks k ,.[E ]ẹ.[S ] K, K, C hương C Á C P H Ư Ơ N G P H Á P H O Á LÝ N G H IÊ N cứu Đ Ộ N G H Ọ C ENZIM 6.1 KỸ THUẬT NCiHIÊN u T ốc ĐỘ PHÁN ỨN(Ỉ EN/.IM ú TRẠNÍỈ THÁI D Ư N í; 6.1.1 Kỹ th u ậ t p h ã n tích ho học: (Kỹ ihuật động học) - Nguyên tắc tiến hành phán ứiig ; s — Khi theo dõi thời gian phàn ứng xác, diệt enzim lức khác nhiệi hay bàng hố chất, tìm At phân tích hố học để tlm AS hay AP lính tốc đ ộ phán i'mg enzim theo phương irình: AP -AS At At V - - Những phươtig pháp phân tích hố học thường sử dụng irong kỹ thuật là: phân lích Ihể lích, phân lích irọng lưcmg, phàn tích m anom el (dùng Wi»rburg kơ") phân íích so máu phân tích độ quay cực v.v - u điểm cùa phương pháp kỹ Ihuật dơn giàn, dụng cụ rè liền Nhược điểm ciia thời gian, độ xác ihấp tốn hố chấl (cơ chất E nzim ) phải làm lượng lớn 6.1.2 Kỹ thuật dùng máy đ o pH - Nguyẻn tác: sử dụng m ộl máy pH c h ế tạo đặc biọi hình 1 M tơ s ÍỈOIÌI cliái 2- M áy d o pH M áy ghi tõc đ ộ bơm N guỏn clifn Đ iện cực pH R le m ồiơ 8- Khuây lừ H ìn h 6.1 S đổ m y p H d ù n g đ ể n g h iẻn cừ u đ ộ n g học E n zim Khi liến hành phàn ứng Enzim có thay đổi pH, dùng axli hay kiềm trung hoà liên tục cho kim m áy đo pH không dổi vi t r í Xác dịnh t(X' dộ ưung hô (AV) ihco ihữi gian (Ai), tính dược lôc dộ phán ứng: AV At - u điểm phưcmg pháp có độ xác cao nhược điểm sứ dụng lượng lớn hoá chất không phổ biến cho nhiều phản ứng 6.1.3 Kỹ th u ậ t diện hoá - Nguyên lắc: theo dõi biến thiên điện íhế (AE) hay độ dẫn diện (AS) Iheo thời gian (At) kỹ thuật điện hoá tự ghi như: máy đo diện thế, máy đíộn lượng, máy cực phổ v v nhờ xác định dược lốc độ phản ứng xúc tác cnzim: AE V - Al hay v = Al - u điểm cùa phương pháp ỉà có độ nhạy tương đối cao, sử dụng lượng hoá chất tưc^g đối ngày điện cực chế lạo dược ngày tinh vi (lặc hiệu Tuy nhiên, phương pháp điện hoá khỏng phổ biến chi sử dụng ch o inộl sò' giới hạn phàn ứng enzim có liẽn quan đến biến đổi diện hay độ dẫn diện 6.1.4 Kỹ thuật quang phổ - Nguyên lắc: Sử dụng nhũĩig ihiết bị quang phổ h i ệ n đại lự ghi: quang phố từ ngoại u v quang phổ khả kiến Vis, quang phổ huỳnh quang (Fl) v.v đ ể ghi lại bicn thiên mật dộ quang (AD) dộ íắt(AE), độ truyền qua (AT) hay cường độ xạ huỳnh quang (AF) irong khoảng thời gian iưcmg ứng (At) cùa phán ứng xúc lác bới enziiii, lừ dó tính tốc độ phản ứng: V = A ( ) -> mội irong bón đại lượng (AD, AE, AT, AF) At - Sơ đổ nguyên tắc máy quang phổ: * M y ghi phổ Fl: M y ghi p h ổ v hay Vis = c.c.d - E F » I ^ ( 2,3 r C đ ) Ọ AF=(2,3 ) f r d Q > A C AE « (c,cl) C H in h 6.2 S đ n g u y ê n tắ c củ a m y q u a n g p h ổ Chú thích : ss Nguổn sáng; K = Kinh lọc: Bước sóng kích ỉhích e = Hệ sổ iiĩ phân (ử gam = Bước sóng xạ Q s Hệ số xạ phân lử gam D = Ttf bào quang diện: ị, = Cưởng dộ vào c c Ij = Cường độ d = Quãng đườiig qua châì hàp thu = Máy ghi lự động: Nồng (iộ chát, - Thí dụ 1; Khi dùng Phenyl alanin - Am onia-Liara (PAL) xúc tác cho phàn úng: N+H2 C H 2— CH— PAL coo- T n s - X in am ic L - P h e n y l A lanin >-Ma, = nm >-Ma, = nm Hình 6.3: p h ổ tử ngoại PAL C chất s sản phẩm p có bước sóng hấp thụ cực đại khác rõ rệt, có Ihể dùng máy quang phổ tử ngoại u v theo dõi AS hay AP cách dễ dàng, từ xác định dược tốc độ phản ứng - Thí dụ 2: Khi dùng G luco - - Photphal Dehydrogenara (GPDH), để xúc tác phản ứng: GPDH G - - p + NADP GIucolacton-6-P + NADPH + H* X = 340 nm Sản phẩm phản ứng N A D PH (hay NADH) có bước sóng hấp thụ cực đại 340 nm, cho sử đụng m ột m áy quang phổ tử ngoại theo dõi AP cùa phản ứng để xác định tốc độ phản ứng 220 250 280 310 340 370 H ìn h 6.4‘ P h ổ tử ngoại củ a N A D H 400 NAD - T h íd ụ 3: Có Ihể dùng mộí hệ ihống ghép hai hay nhiều phàn ứng để xác định tốc độ cho mộl phàn ứng không xác định trực tiếp AS hay AP cùa phản ứng ây: a D Glucoza + ATP z UK PK A D P+PEP P y r+ N A D H + H* ± a D -G -6 -P + A D P i A TP + Pyr ± N A D + Laclai K = 340 nm Trong phản úĩig trên, sản phẩm phàn ứng đấu chai cho phàn ứng sán phẩm cùa phản ứng thứ chất cho phản ứng Khi cho châì dư, cnzim phán ứng dư, tốc độ đo đo biến ihiên nồng dộ NADH iheo dõi máy tốc độ phản ứng thứ Bằng cách có íhổ xác định lốc độ phàn ứng cho phàn ứng bầiig phưcmg pháp quang phổ T h í dụ 4ỉ Nghiên cứu động học cùa lipaza bàng phưcmg pháp huỳnh quang, qua phàn ứng sau: o K — c o R -C O O CH,' Khổng phát huỳnh quang = 330 nm = 450 nm Sàn phẩm phản ứng mội châì phát huỳnh quang vùng nhìn thấy, có Ihế theo dõi AP dể xác định dược tốc độ phản ứng - u diểm phương pháp quang phổ vừa có dộ nhạy độ xác cao lại tốn Ihcfi gian, lốn lì hố chất Hiện phương pháp quang phổ đặc biệi quang phổ huỳnh quang phương pháp hiệu nghiệm đế nghiên cứu động học enzim 6.Z KỸ T H U Ậ T N G H IÊN c ứ u ĐỘNG H Ọ C E N Z IM ỏ TRẠNC; T H Á I T IỂ N DỦN(J - Nguyên tắc chung cùa phương pháp nghiên cứu động học enzim trạng thái tiền đừng sử dụng m áy quang phổ kèm theo m ột thiết bị đặc biệt để theo dõi phản img từ vừa irộn enzim chấi với Ị- Phương pháp dòng liên tục, sử dụng thiết hị m ổ tà hình 6.5 s K Hình 6.5 S đổ Ihiết bị p h n g p h p đ ò n g liên tục 1- M ô lơ dầy pitong: 2- Hệ thống bơm ; 3- M áy quang phổ: 4- Máy glii; 5- Binh liứiig N hờ mộỉ m ô tơ đẩy bctrn irộn E s với ống theo dõi phán ứng băng m ội m áy quang phổ !ự ghi sau irộn ' P h (ftìỵ p ỉỉá p ctònịi íủ n ỵ iơ (\ lạ i s d ụ n g m ộf íh iế í b ị c lìo th(}\' h iiĩh 6.6 s A -< P' M h M’ K "d R Hình 6.6 S th iết hị ph n g p h p dòng tâng tốc Trong dó: M M* = M ỏiơ dẩy bcmi p P’ = Bơm Irộn E và s D = T ế bào quang diện, R = M áy ghi s K = Khố inở dể trộn tức ihờì E Cũng nhờ m ô tơ dẩy hai bơm để trộn E s Irộn làng tốc vận khoá m phản ứng dược theo dõi mộl máy quang phổ ghi lại bầng máy ghi So sánh hai phương pháp, phưcfng pháp dòng lăng tốc có ưu điểm sử dụng lì lượng hố chấl hem điều chỉnh phản ứng Ihuận tiện 3- P h m g pháp diệt enzim tức thời: Trong trường hc^ khòng có điéu k i ệ n ghi phổ, có íhổ dùng phưcmg pháp diệt cnzim lức thời ( dùng TCA hay mộl axit mạnh khác) để dừng phản ứng enzim đem phân tích tìm AS hay AP bàng phương pháp khác Khi sử dụng thiết bị đặc biệt cho thấy hình 6.7 : M K M = Mo íơ trộn p= Pitong K= Khố c= Bộ góp H ìn h 6.7- S đ ổ thiết bị diệt enzim tức thời u điểm cùa phương pháp tiết kiệm nhiều hoá chất kiểm tra đưcfc mẫu ihực nghiệm 6.3 KỶ THUẬT NGHIÊN c ứ u T ố c Đ Ộ PHẢN ỨNG ENZIM T R Ạ N G THÁI C Â N BẰNG - Nguyên tắc: Khi tác dụng đột ngột m ột lương lác nhiột độ áp suất hay điện trường lẽn trạng thái cản m ột phán ứng, lập lức cãn chuyên dịch lức thcri (hời gian cực ngắn dến m ột cân ta cố: dAC _ AC di ” AT hay AC = A Q e ^ Trong : AC = c - c tundịch = Biến thiên nồng độ khỏi cân T = Thời gian lệch khỏi trạng thái cân Như vậy, thiết bị dặc biệt người ta xác định AC T, tính tốc độ phản ứng lệch khỏi cẳn - Thí dụ sơ đổ thiết bị sử dụng sốc nhiệt gây chuyển dịch cân cho hình 6,8 < ^ K H itth 6.8 S đố thiết bị s lý d ụ n g sốc n h iệ t gá y c h u yể n dich cán tứ c thời s Nguón sáng D-Tế bầo quang điệQ K* K ính ỉọc Đ 'Đ iộ n cực phóng nhiệt R - M y ghi Kỹ thuật m ổ tả trẽn, thường dược gọi phương pháp Relaxation (phưcmg pháp hồi phục), xác định tốc độ phản ứng cục nhanh (dến lO"* giây), vẵn chưa dược sử dụng phổ biến thiết bị đát tiền sử dụng cho động học xúc tác enzim bi han c h ế mổt số dãc điểm xúc tác enzim ... iềti hiến động học Vùng động học khuếch tán Vùng động học íiền dừng Vùng động học dừng Vùng dộng học gẩn cân Vùng động học cân 2/ H m s ố biểu diễn động học - Đ ộng học Hyperbolic = Động học M ichaelis-M... ơng Đ Ộ N G H Ọ C XỨC T Á C ENZIM 4.1 ĐẠI CƯƠN(Ỉ VỂ DỘNC HỌC x ú c TÁC ENZIM 4.1.1 Định nghĩa Đ ộng học xúc tác enzim mỏn học nghiên cứu vể tốc đọ phàn ứng xúc tác bới enzim yếu !ô' ánh hướng lên... yếu tố này, giải thích xúc tác enzim lai có hiêu xúc tác cao so với xúc lác đồng thể trẽn 10"' lần (xem bảng đây) qua yếu tố tương tác này, lán cho thấy xúc íác enzim xúc tác vi dị ihể B ả n g