CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN

Các phương pháp định lượng protein GVHD: TS Trần Thị Bích Lam Mục lục LỜI NĨI ĐẦU Protein thành phần thiếu tất thể sinh vật, cấu tạo từ nhiều nguyên tố: c , H, o , N Chủ yếu bao gồm L-axit amin kết hợp với liên kết peptid Tỉ lệ phần trăm khối lượng nguyên tố bong phân tử Protein sau: : C: 50-55%; O: 21-24%; N: 15-18%; H: 6,5 - 7,3%; S: - 0.24% Ngoài nguyên tố số protein chứa lượng ngun tố khác p, Fe, Zn, Cu, Mn, Ca (Sách Hóa sinh cơng nghiệp- Lê Ngọc Tú- NXB khoa học kĩ thuật HN, trang 94) Protein có đặc tính đặc thù cao cho lồi, quan mô cá thể Protein đa dạng cấu trúc chức thể sống Trong mô tế bào sinh vật thành phần Protein (chất đạm) tồn nhiều dạng khác như: đạm hữu cơ, đạm vô cơ, đạm Protein (comoniac muối amonium) Để xác định chúng có nhiều phương pháp tùy theo đối tượng khảo xác tùy theo chiều hướng muốn khảo xác, người ta áp dụng phương pháp thích hợp trục tiếp gián tiếp Seminar trình bày số phương pháp dùng để định lượng Protein, với số lưu ý sử dụng phương pháp cụ thể I Tổng quan: Câu tạo phân tử Proteỉn: Tất protein chứa nguyên tố c , o , N, H, số chứa lượng nhỏ s Tỉ lệ phần trăm khối lương nguyên tố phân tử protein sau: C: 50-55%; O: 21-24%; N: 15-18%; H: 6,5 - 7,3%; S: - 0.24% Ngồi ngun tố số protein chứa lượng nguyên tố khác p, Fe, Zn, Cu, Mn, Ca Protein có thành phần phức tạp có nhiều bật cấu trúc khác nhau, bật cấu trúc có cấu trúc chức khác giữ vai trò quan ttọng đối vđi tất thể sinh vật Cấu trúc protein chia thành bậc: 1, 2, 3, 1.1 Cấu trúc bậc 1: Là ttình tự xếp gốc acid amin ttong mạch polypeptide cấu trúc giữ vững nhờ liên kết peptide (liên kết đồng hoá trị) Liên kết peptide H HHO H HHO H I I I II 1 I II I HN - C- C- N- C- C- N- C- C- N- C- C- NC - I II I I I II I II o Ri o R2 H R3 o R4 H R5 1.2 Cấu trúc bậc 2: Là tương tác không gian gốc acid amin gần mạch polypeptide Nói cách khác không gian cục phần mạch polypeptide cấu trúc làm bền chủ yếu nhờ liên kết Hidro tạo thành liên kết peptide gần cách khoảng xác định p straitd l hp N —ca~“c harkhnne as unell as the Cg of R srotips are represented heie Note that the unide phuies arc EI Hellx Only the rt niter 7.1 7.2 7.3 Nguyên tắc: Phương pháp Dumas dùng để xác định lượng protein thô Quy trình dùng thiết bị lò điện đun nóng mẫu phân tích đến 600°c lò phản ứng bịt kín với diện oxy Hàm lượng Nito khí đốt sau dod cách dùng máy dò dẫn nhiệt Mỗi lần xác định cần khoảng thời gian ngắn (2 phút) 7.4 Thiết bị: Thiết bị phân tích đạm theo phương pháp Dumas sau: Thơng tin thiết bị: • Model: NDA 70 thiết bị Velp- Italy • Thiết nị thiết kế bao gồm lấy mẫu tự động lên tới 116 vị trí, khối lượng mẫu lổn lg • Detetor: loại Detector độ dẫn TCD tự động chuẩn Các phương pháp định lượng protein GVHD: TS Trần Thị Bích Lam • Độ lặp RSD: nhỏ 0.1 % mẫu chuẩn EDTA (9.57%) • Recovery: 99.5% • Giới hạn Detector: 0.01 mgN • Khí sử dụng: He 02 • Độ tinh khiết khí He: 99.999% (grade 5.0) • Độ tinh khiết khí 02 99.999% (grade 5.0) • Máy nén khí Nitro gen: khơng dầu nước, độ tinh khiết: 99.6% • Ap suất khí He: Bar • Ap suất khí 02: Bar • Ấp suất khí nén: Bar • Cổ giao diện: USB RS 232 • Cơng suất điện: 1400 w • Nguồn điện sử dụng: 230V/50Hz • Trọng lượng máy: 55kg • Kích thước máy 710x 51x 410mm (710x685x410mm với lấy mẫu tự động) Các phương pháp định lượng protein 7.5 GVHD: TS Trần Thị Bích Lam Cách tiến hành: Mầu phân tích kết dạng viên, đốt cháy ỏ nhiệt độ cao, tíong thời gian, trình xúc tác diễn việc khí oxy áp suất khí Khí cháy sinh gồm C02, H20, NOx, đưa qua lò thấp nơi mà khí NOx chuyển thành khí N2 Hơi ẩm H20 C02 tách riêng phận hấp thụ, thành phần khí N đo Detector độ dẫn TCD Tất trinh diễn thời gian ngắn Dựa vào hàm lượng Nito ta xác định hàm lượng proten sau: Nito tổng= nito protein+ nito phi protein Trong nguyên liệu sinh hoc hàm lượng nito phi protein nhỏ việc tác riêng phức tạp nên người ta tính hàm lượng protein theo Nito tổng gọi protein thô hay protein tổng Protein (%)= Nito (%) X 6.25 Riêng ngũ cốc đậu có hệ số chuyển đổi 5.7 Sữa 6.15 Kết xét nghiệm theo phương pháp Dumas Kjeldahl cho 21 mẫu thịt cho kết sau: Dumas Hệ số Trung Mẩu Độ Hệ số vs Các phương pháp định lượng protein GVHD: TS Trần Thị Bích Lam Các phương pháp định lượng protein GVHD: TS Trần Thị Bích Lam Tính trung bình hệ số biến thiên phương pháp Dumas 2.7% Kjeldahl 2.1% Tính trung bình độ khác biệt đo lường hai phương pháp thấp (chỉ khoảng 0.2%) Phương pháp PRM (Pyrogallol Red Molybdate); 8.1 Nguyên tắc: Pyrogallol red kết hợp với molybdate để tạo thành hỗn hợp có màu hồng (pink) hấp thụ bước sóng 470nm Phức Pyrogallol molybdate có hấp thu bước sóng 604nm, chuyển sang màu tím đen phản ứng với Protein tác dụng acid Bằng cách đo độ hấp thụ máy đo 600nm, lượng protein xác định với abumin máu bò chuẩn "1■ PR-Mo-Protem PR-Mo complex E max: 604 nm Pyrogallol Red Đặt hỗn hợp nhiệt độ phòng khoảng 20 phút • Đo hỗn hợp bước sóng hấp thụ A600 nm máy quang phổ, máy so màu hay siêu đĩa đọc lh Phương pháp dựa tương tác màu protein với tính chất đặc trưng phức hệ PRM với giới hạn hàm lượng protein Căn vào hình thành phức hệ, màu chuyển từ hồng sang tía đen (dark purple) Phương pháp hữu dụng, đơn giản, rẻ tiền phức màu hấp thụ đặc biệt phản ứng với chất khác ngòai protein, có thao tác đơn giản so với phương pháp khác Các phương pháp định lượng protein (PR) GVHD: TS Trần Thị Bích Lam E max: 470 nm Các phương pháp định lượng protein GVHD: TS Trần Thị Bích Lam 8.2 Dụng cụ: • ơng nghiệm • Pipet hay micropipet • Quang phổ kế, máy so màu quang phổ, siêu đĩa đọc trang bị với phận lọc khoảng 600nm 8.3 Tiến hành: • Dung dich protein pha loãng với hỗn hợp màu PRM (pyrogallol red molybdate) tạo thành dung dịch đệm (điều chỉnh nước) (theo bảng), sau cho vào ống nghiệm siêu đĩa lọc để tiến A Standard Assay at room temperature hành thí nghiệm (tiến hành làm mẫu trắng để kiểm nghiệm) Các phương pháp định lượng protein GVHD: TS Trần Thị Bích Lam III So sánh sô" phương pháp định lượng proteỉn So sánh mẫu bia có khơng qua thẩm tích Hàm lượng Protein bia (mg/ml) Kết luận Các phương pháp khác cho kết không giống Hàng năm ữên giới sản xuất khoảng tỷ tân thực phẩm có protien số lượng thực phẩm cần phải phân tích protein lớn Vì người ta khơng ngừng nghiên cứu cải thiện phương pháp phân tích protein cho nhanh chóng, xác rẻ.TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Phạm Thị Trân Châu, Hóa sinh đại cương, NXB Đại Học Sư Phạm [2] Phạm Thị Trân Châu, Nguyễn Thị Hiền, Phùng Gia Tường, Thực hành hóa sinh học, NXB Giáo Dục (1997) [3] Phạm Thị Trân Châu, tạp chí sình học, tập 9,1981 [4] Phạm Thị Anh Hồng, kỹ thuật sinh hóa, NXB Đại Học Quốc Gia TPHCM [5] Phạm Thị Anh Hồng, Nguyễn Thị Huyên, Trần Mỹ Quang, thực tập sinh hóa sở, tủ sách Đại Học Khoa Học Tự Nhiên TPHCM [6] TS Lê Thị Thanh Mai, Giáo trình thực tập sinh hóa [7] Nguyễn Văn Mùi, thực hành hóa sinh học, NXB khoa học kỹ thuật, Hà Nội (2001) [8] PGS TS Đồng Thị Thanh Thu, Giáo Trình Sinh Hóa Cơ Bản [9] Vaxcrixenxki.p, Kỹ Thuật Phòng Thí Nghiệm - Phần I, NXB Đại Học Và Trung Học Chuyên Nghiệp [10] Các Wedsite www Proteomics-Protein Assays.htm www Page Protein Assays,pg.htm www Biochemistry-Protein-the chemistry of Protein www Biophysical chemistry G4170 Protein Visualization.htm