THIẾT KẾ CẤU TRÚC CHỈNH SỬA PROMOTER GEN OsSWEET LIÊN QUAN ĐẾN CƠ CHẾ XÂM NHIỄM CỦA VI KHUẨN GÂY BỆNH BẠC LÁ TRÊN GIỐNG LÚA TBR225

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ––––––––––––––––––––– Phùng Thị Thu Hƣơng THIẾT KẾ CẤU TRÚC CHỈNH SỬA PROMOTER GEN OsSWEET LIÊN QUAN ĐẾN CƠ CHẾ XÂM NHIỄM CỦA VI KHUẨN GÂY BỆNH BẠC LÁ TRÊN GIỐNG LÚA TBR225 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – 2019 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN ––––––––––––––––––––– Phùng Thị Thu Hƣơng THIẾT KẾ CẤU TRÚC CHỈNH SỬA PROMOTER GEN OsSWEET LIÊN QUAN ĐẾN CƠ CHẾ XÂM NHIỄM CỦA VI KHUẨN GÂY BỆNH BẠC LÁ TRÊN GIỐNG LÚA TBR225 Chuyên ngành: Sinh học Thực nghiệm Mã số: 8420101.14 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS LÊ QUỲNH MAI PGS.TS PHẠM XUÂN HỘI Hà Nội – 2019 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Lê Quỳnh Mai PGS.TS Phạm Xuân Hội – người thầy tận tình bảo hướng dẫn em trình thực đề tài giúp đỡ em hoàn thành tốt Luận văn Thạc sĩ Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới thầy cô giáo Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên nhiệt tình hướng dẫn giảng dạy cho em kiến thức bổ ích suốt trình học tập vừa qua Em xin gửi lời cảm ơn tới TS Nguyễn Duy Phương anh chị em đồng nghiệp Bộ môn Bệnh học Phân tử Thực vật, Viện Di truyền Nông nghiệp chia sẻ, giúp đỡ tạo điều kiện lớn suốt trình em thực Luận văn Kinh phí thực Luận văn tài trợ từ Dự án “Nghiên cứu ứng dụng công nghệ thị phân tử chỉnh sửa hệ gen chọn tạo giống lúa suất, chất lượng, chống chịu sâu bệnh bất lợi ngoại cảnh” (Mã số: ĐM.36.DN/18) thuộc Chương trình Chương trình Đổi cơng nghệ quốc gia – Bộ Khoa học Công nghệ Cuối cùng, em muốn gửi lời cảm ơn đến gia đình bạn bè bên, động viên, giúp đỡ em suốt thời gian học tập thực Luận văn Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 11 tháng 01 năm 2019 Học viên Phùng Thị Thu Hƣơng MỤC LỤC MỞ ĐẦU .1 Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 BỆNH BẠC LÁ Ở LÚA 1.1.1 Giới thiệu chung bệnh bạc lúa 1.1.2 Ảnh hưởng bệnh bạc tới sản xuất lúa gạo 1.1.3 Biện pháp phòng trừ bệnh bạc lúa 1.2 VI KHUẨN XANTHOMONAS ORYZAE PV ORYZAE .7 1.2.1 Phân loại vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv oryzae 1.2.2 Đặc điểm sinh học vi khuẩn Xoo 1.2.3 Cơ chế gây bệnh lúa vi khuẩn Xoo .8 1.3 NGHIÊN CỨU CHỌN TẠO GIỐNG LÚA KHÁNG BỆNH BẠC LÁ 10 1.3.1 Nghiên cứu chọn tạo giống lúa kháng bạc dựa gen kháng 10 1.3.2 Nghiên cứu chọn tạo giống lúa kháng bạc dựa protein TAL 14 1.4 HỆ THỐNG CHỈNH SỬA GEN CRISPR/Cas9 .16 1.4.1 Giới thiệu công nghệ chỉnh sửa hệ gen 16 1.4.2 Hệ thống chỉnh sửa gen CRISPR/Cas9 18 1.4.3 Ứng dụng hệ thống CRISPR/Cas9 chỉnh sửa gen thực vật 22 1.5 CHUYỂN GEN Ở THỰC VẬT VÀ HỆ VECTOR CHUYỂN GEN .23 1.5.1 Phương pháp chuyển gen thực vật thông qua A tumefaciens .23 1.5.2 Hệ vector sử dụng nghiên cứu chuyển gen thực vật .24 1.5.3 Vector chỉnh sửa gen tế bào thực vật 25 Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27 2.1 VẬT LIỆU 27 2.1.1 Mẫu thực vật .27 2.1.2 Chủng vi sinh vật 27 2.1.3 Vector oligonucleotide .28 2.1.4 Hóa chất 29 2.1.5 Thiết bị 29 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29 2.2.1 Chuẩn bị mẫu thực vật 29 2.2.2 Tách chiết, định tính, định lượng DNA 29 2.2.3 Đánh giá độc tính vi khuẩn Xoo giống lúa TBR225 32 2.2.4 Nhân dòng promoter SW14–TBR vào vector pGEM–T 33 2.2.5 Thiết kế cấu trúc chỉnh sửa promoter SW14–TBR 35 2.2.6 Biến nạp vector pCas9/Tal5–TalC vào tế bào A tumefaciens 38 2.2.7 Xác định kiểu gen chuyển gen PCR 39 Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU & THẢO LUẬN 40 3.1 ĐÁNH GIÁ ĐỘC TÍNH CỦA CÁC CHỦNG VI KHUẨN XOO 40 3.1.1 Đánh giá độc tính vi khuẩn Xoo giống lúa TBR225 40 3.1.2 Vai trò OsSWEET14 trình lây nhiễm Xoo 41 3.2 NHÂN DỊNG VÀ GIẢI TRÌNH TỰ PROMOTER SW14–TBR .44 3.2.1 Nhân promoter SW14–TBR 44 3.2.2 Nhân dòng promoter SW14–TBR .45 3.2.3 Giải trình tự promoter SW14–TBR 47 3.3 THIẾT KẾ CẤU TRÚC CHỈNH SỬA PROMOTER SW14–TBR 50 3.3.1 Thiết kế trình tự crRNA chỉnh sửa promoter SW14–TBR 50 3.3.2 Thiết kế cấu trúc biểu sgRNA chỉnh sửa SW14–TBR 54 3.3.3 Thiết kế vector chuyển gen mang cấu trúc chỉnh sửa SW14–TBR 58 3.4 NGHIÊN CỨU CHUYỂN CẤU TRÚC T-DNA VÀO LÚA TBR225 62 3.4.1 Biến nạp vector biểu vào A tumefaciens EHA105 62 3.4.2 Chuyển cấu trúc chỉnh sửa SW14–TBR vào giống lúa TBR225 63 KẾT LUẬN .69 KIẾN NGHỊ 70 TÀI LIỆU THAM KHẢO 71 DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Một số gen/QTL kháng bệnh bạc công bố 12 Bảng 1.2: Một số hệ vector CRISPR/Cas9 dùng cho chuyển gen thực vật 26 Bảng 2.1: Các chủng vi khuẩn Xoo sử dụng nghiên cứu 27 Bảng 2.2: Trình tự oligonucleotide sử dụng nghiên cứu 28 Bảng 3.1: Đặc điểm crRNA chỉnh sửa promoter SW14–TBR 51 Bảng 3.2: Trình tự DNA gần giống crRNA chỉnh sửa OsSWEET14 hệ gen 53 I DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Bản đồ phân bố bệnh bạc lúa giới Hình 1.2: Triệu chứng điển hình bệnh bạc lúa Hình 1.3: Tế bào vi khuẩn Xoo Hình 1.4: Vi khuẩn Xoo xâm nhập vào khí khổng bề mặt lúa Hình 1.5: Cơ chế sửa chữa đột biến đứt gãy DNA tế bào 17 Hình 1.6: Mơ hình hoạt động hệ thống chỉnh sửa hệ gen 18 Hình 1.7: Cơ chế cắt DNA phức hệ protein CRISPR/Cas9 .20 Hình 2.1: Lây nhiễm vi khuẩn Xoo lúa phương pháp cắt .33 Hình 2.2: Sơ đồ vector pGEM/SW14–TBR .34 Hình 2.3: Sơ đồ thiết kế cấu trúc [Tal5–TalC] 36 Hình 2.4: Sơ đồ thiết kế vector biểu pCas9/Tal5–TalC 38 Hình 3.1: PCR trực tiếp khuẩn lạc Xoo .40 Hình 3.2: Độc tính chủng vi khuẩn Xoo giống lúa TBR225 .41 Hình 3.3: Độc tính vi khuẩn Xoo đại diện lúa Kitaake .43 Hình 3.4: PCR nhân promoter SW14–TBR .45 Hình 3.5: PCR trực tiếp khuẩn lạc biến nạp pGEM/SW14–TBR 45 Hình 3.6: PCR cắt giới hạn vector pGEM/SW14–TBR .47 Hình 3.7: So sánh trình tự promoter SW14–TBR giống lúa 48 Hình 3.8: Đặc điểm trình tự Nu promoter SW14–TBR 49 Hình 3.9: Cấu trúc bậc II sgRNA chỉnh sửa promoter SW14–TBR 52 Hình 3.10: Ghép nối trình tự Tal5–gRNA vào cấu trúc biểu PCR 55 Hình 3.11: Ghép nối trình tự TalC–gRNA vào cấu trúc biểu PCR 56 Hình 3.12: PCR cắt giới hạn vector pGEM/Tal5–TalC .57 Hình 3.13: Cắt giới hạn vector pGEM/Tal5–TalC pCas9 .59 Hình 3.14: PCR trực tiếp khuẩn lạc biến nạp pCas9/Tal5–TalC .60 II Hình 3.15: PCR cắt giới hạn vector pCas9/Tal5–TalC 61 Hình 3.16: Giải trình tự vector tái tổ hợp pCas9/Tal5–TalC 62 Hình 3.17: PCR trực tiếp khuẩn lạc A tumefaciens biến nạp pCas9/Tal5–TalC .63 Hình 3.18: Chuyể n cấu trúc T–DNA chỉnh sửa SW14–TBR vào lúa TBR225 64 Hình 3.19: Xác định có mặt gen chọn lọc HygR PCR 65 Hình 3.20: Xác định có mặt cấu trúc chỉnh sửa SW14–TBR PCR .66 III DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT A tumefaciens Agrobacterium tumefaciens bp base pair (cặp bazơ) CRISPR Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (nhóm đoạn ngắn đối xứng lặp lại thường xuyên) Cas CRISPR associated protein (protein liên kết CRISPR) crRNA CRISPR RNA CTAB Cetyltrimethylammonium bromide DBS Double–stranded break (đứt gãy sợi đôi) dNTP Deoxynucleotide triphosphate ddNTP Dideoxynucleotide triphosphate E coli Escherichia coli EBE Effector–binding element EPS Extracellular polysaccharide (polysaccharide ngoại bào) EtBr Ethidium bromide HR Homologous recombination (tái tổ hợp tương đồng) kb Kilobase LB Luria–Bertani (môi trường nuôi cấy vi khuẩn) NHEJ Non–homologous end–joining (ghép nối điểm cuối không tương đồng) NST Nhiễm sắc thể Nu Nucleotide OD Optical density (mật độ quang học) PAM Protospacer adjacent motif (motif liền kề protospacer) PCR Polymerase chain reaction (phản ứng chuỗi trùng hợp) IV PSA Potato sugar agar (môi trường nuôi cấy vi khuẩn) QTL Quantitative trait locus RNAi RNA interference (can thiệp RNA) sgRNA single guide RNA (RNA dẫn đường) T2SS Type II secretion system (hệ thống tiết loại II) T3SS Type III secretion system (hệ thống tiết loại III) TAL Transcription activator–like (tương tự yếu tố hoạt hóa phiên mã) TALEN TAL effector nuclease (nuclease tác động tương tự yếu tố hoạt hóa phiên mã) T–DNA Transfer–DNA (DNA chuyển) Ti–plasmid Tumor inducing plasmid (plasmid gây khối u) tracrRNA trans–encoded CRISPR RNA Xoo Xanthomonas oryzae pv oryzae ZFN Zinc finger nuclease (nuclease ngón tay kẽm) V TBR225 (Oryza sativa L.) thông qua vi khuẩn A tumefaciens (thực nhóm nghiên cứu “Dự án chọn tạo giống lúa TBR225 kháng bệnh bạc công nghệ chỉnh sửa hệ gen”), cấu trúc chuyển gen xác định có mặt số dòng lúa tái sinh PCR Tuy nhiên, tỉ lệ dòng lúa tái sinh mang đầy đủ gen đích chưa cao (2/7 mẫu kiểm tra) Khả xuất đột biến sau trình sửa DNA đứt gãy theo chế NHEJ tế bào có tính ngẫu nhiên Chính vậy, để tăng khả thu đột biến mong muốn, quy trình chuyển gen vào giống lúa TBR225 cần cải tiến nhằm thu nhiều dòng lúa mang cấu trúc biểu gen đích Trong khn khổ luận văn này, bước đầu chứng minh giống lúa TBR225 có khả tiếp nhận cấu trúc biểu phức hệ protein/RNA CRISPR/Cas9 chỉnh sửa promoter SW14–TBR Việc chỉnh sửa vị trí bám promoter “gen mẫn cảm” cho protein TAL Xanthomonas oryzae pv oryzae chiến lược kiểm soát biểu gen Một số cơng nghệ trước cho phép kiểm sốt biểu gen chủ bất hoạt gen virus (virus–induced gene silencing) hay RNAi (RNA interference) theo chế tương tác mRNA gen đích Mặc dù áp dụng rộng rãi cho nghiên cứu chức gen thực vật, kiểm soát biểu gen thông qua mRNA xảy gián tiếp tác dụng đạt phần Vì thế, chiến lược kiểm sốt trực tiếp biểu gen đích thơng qua việc tạo đột biến hệ gen cho có hiệu Hiện việc sử dụng hệ thống CRISPR/Cas9 cho phép gây đột biến mục tiêu chỉnh sửa gen xác, có khả điều chỉnh biểu gen đặc biệt kiểm tra chức thành viên họ gen [10, 43] Dòng lúa TBR225 chuyển cấu trúc biểu CRISPR/Cas9 chỉnh sửa promoter OsSWEET14 thu nghiên cứu dự đoán mang đột biến vùng promoter SW14–TBR có khả kháng bệnh bạc (ít chủng vi khuẩn Xoo đại diện) Việc đánh giá khả hoạt động cấu trúc chuyển gen chủ khả kháng bệnh bạc dòng lúa cần phải tiếp tục nghiên cứu sau 68 KẾT LUẬN Từ kết thu được, chúng tơi đưa kết luận sau: Đã đánh giá tính mẫn cảm lúa TBR225 Kitaake với chủng vi khuẩn Xoo phân lập miền bắc Việt Nam (chiều dài vết bệnh từ 17 – 35 cm 16 – 25 cm) Dòng lúa Kitaake mang đột biến promoter OsSWEET14 thể tính kháng với 5/6 chủng vi khuẩn Xoo đại diện (VXO_52, VXO_54, VXO_59, VXO_60 VXO_61 VXO_62), chiều dài vết bệnh < cm Đã nhân dòng giải trình tự đầy đủ promoter gen OsSWEET14 liên quan đến trình xâm nhiễm vi khuẩn gây bệnh bạc Xoo giống lúa TBR225 Vùng trình tự phân lập dài 1392 bp, bao gồm đoạn promoter dài 1341 bp đoạn Exon I dài 51 bp, có độ tương đồng 99% 100% so với OsSWEET14 giống lúa Niponbare (mã số AP014967.1) Shuhui498, (mã số CP018167.1) Promoter OsSWEET14 lúa TBR225 chứa hộp TATA vị trí nhận biết vi khuẩn Xoo, bao gồm TalC, Tal5, PthXa3 AvrXa7 Đã thiết kế cấu trúc crRNA (20 Nu) phục vụ nghiên cứu chỉnh sửa promoter OsSWEET14 giống lúa TBR225 công nghệ CRISPR/Cas9 Vector chuyển gen thực vật mang cấu trúc biểu phức hệ protein/RNA chỉnh sửa đồng thời hai vị trí Tal5 TalC promoter OsSWEET14 giống lúa TBR225 thiết kế thành công Vector tái tổ hợp kiểm tra PCR, cắt enzyme giới hạn giải trình tự Nu Đã xác định hai dòng lúa TBR225 tái sinh (D1.1 D1.5) có mang cấu trúc chỉnh sửa promoter OsSWEET14 phương pháp PCR 69 KIẾN NGHỊ Trên sở kết luận thu được, đưa số kiến nghị sau: Đánh giá khả hoạt động cấu trúc chuyển gen chủ khả kháng bệnh bạc dòng lúa TBR225 tái sinh Tiếp tục nghiên cứu vai trò OsSWEET14 chế xâm nhiễm vi khuẩn Xoo thu thập Việt Nam 70 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Trần Mạnh Báo, Trần Thị Hơp, Trần Thị Tiệc, Nguyễn Thị Nhung, Nguyễn Văn Hoan (2016), “Kết chọn tạo giống lúa TBR225”, Tạp chí Khoa học Nơng nghiệp Việt Nam, 14(9), tr 1360–1367 Nguyễn Thị Liên, Trần Thị Xuân Mai Nguyễn Thị Pha (2012), “Phân lập nhận diện vi khuẩn gây bệnh bạc lúa (Xanthomonas oryzae pv oryzae) kỹ thuật PCR đa thành phần” Tạp chí Khoa học, 23(a), tr 155–164 Nguyễn Duy Phương, Trần Tuấn Tú, Phạm Xuân Hội (2012), “Thiết kế thư viện ADNc chịu hạn lúa phân lập gen NLI–IF1 kĩ thuật sàng lọc phép lai đơn tế bào nấm men”, Tạp chí Sinh học, 34(1), tr 114–122 Bùi Trọng Thủy, Phan Hữu Tôn (2004), “ Khả kháng bệnh bạc dòng lúa thị (Tester) chứa đa gen kháng với số chủng vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv oryzae gây bệnh bạc lúa phổ biến miền bắc Việt Nam”, Tạp chí Khoa học Kỹ thuật Nơng nghiệp, 2, tr 1–6 Phan Hữu Tôn (2016), “Khảo sát khả kháng bệnh bạc lá, đạo ôn, rầy nâu giống lúa phục tráng: nếp đèo đàng, tẻ pude, blechâu dao”, Tạp chí Khoa học Nơng nghiệp Việt Nam, 14(4), tr 551–559 Phan Hữu Tôn, Trịnh Thanh, Nguyễn Văn Giang, Nguyễn Văn Hùng, Tống Văn Hải (2013), “Khảo sát nguồn gen lúa nếp kháng bệnh bạc lá”, Tạp chí Khoa học Phát triển, 11(6), tr 886–891 Tiếng Anh Adachi N., Oku T (2000), “PCR–mediated detection of Xanthomonas oryzae pv oryzae by amplification of the 16S–23S rDNA spacer region sequence”, Journal of General Plant Pathology, 66(4), pp 303–309 Adhikari T B., Basnyat R C (1999), “Virulence of Xanthomonas oryzae pv oryzae on rice lines containing single resistance genes and gene combinations”, Plant Disease, 83, pp 46–50 71 Akhtar M A., Rafi A., Hameed A (2008), “Comparison of methods of inoculation of Xanthomonas oryzae pv.oryzae in rice cultivars”, Pakistan Journal of Botany, 40(5), pp 2171–2175 10 Arora L., Narula A (2017), “Gene editing and crop improvement using CRISPR– Cas9 system”, Frontiers in Plant Science, 8, pp 1932 11 Bharathkumar S., David P R S., Brindha P V., Kavitha S., Gnanamanickam S S (2008), “ Improvement of bacterial blight resistance in rice cultivars Jyothi and IR50 via markerassisted backcross breeding”, Journal of Crop Improvement, 21, pp 101–116 12 Bhat S R., Srinivasan S (2002), “Molecular and genetic analyses of transgenic plants: Considerations and approaches”, Plant Science, 163(4), pp 673–681 13 Blanvillain–Baufumé S., Reschke M., Solé M., Auguy F., Doucoure H., Szurek B., Meynard D., Portefaix M., Cunnac S., Guiderdoni E., Boch J., Koebnik R (2017), “Targeted promoter editing for rice resistance to Xanthomonas oryzae pv oryzae reveals differential activities for SWEET14–inducing TAL effectors”, Plant Biotechnology Journal, 15(3), pp 306–317 14 Boch J., Bonas U (2010), “Xanthomonas AvrBs3 family–type III effectors: discovery and function”, Annual Review of Phytopathology, 48, pp 419–36 15 Borkar S G., Yumlembam R A (2016), Bacterial diseases of crop plants, CRC Press, Florida 16 Bortesi L., Fischer R (2015), “The CRISPR/Cas9 system for plant genome editing and beyond”, Biotechnology Advances, 33(1), pp 41–52 17 CABI/EPPO (2016), Xanthomonas oryzae pv oryzae, Centre for Agriculture and Bioscience International, Oxford 18 Cernadas R A., Doyle E L., Niño–Liu D O., Wilkins K E., Bancroft T., Wang L., Schmidt C L., Caldo R., Yang B., White F F., Nettleton D., Wise R P., Bogdanove A J (2014), “Code–assisted discovery of TAL effector targets in bacterial leaf streak of rice reveals contrast with bacterial blight and a novel susceptibility gene”, Public Library of Science Pathogens, 10(4), pp e1004126 19 Chen H., Lin Y J., Zhang Q F (2011), “Review and prospect of transgenic rice research”, Chinese Science Bulletin, 54(22), pp 4049–4068 72 20 Chen L Q., Hou B H., Lalonde S., Takanaga H., Hartung M L., Qu X Q., Guo W J., Kim J G., Underwood W., Chaudhuri B., Chermak D., Antony G., White F F., Somerville S C., Mudgett M B., Frommer W B (2010), “Sugar transporters for intercellular exchange and nutrition of pathogens”, Nature, 468(7323), pp 527–532 21 Chen L Q., Qu X Q., Hou B H., Sosso D., Osorio S., Fernie A R., Frommer W B (2012), “Sucrose efflux mediated by SWEET proteins as a key step for phloem transport”, Science, 335(6065), pp 207–211 22 Chu Z., Yuan M., Yao J., Ge X., Yuan B., Xu C., Li X., Fu B., Li Z., Bennetzen J L., Zhang Q., Wang S (2006), “Promoter mutations of an essential gene for pollen development result in disease resistance in rice”, Genes & Development, 20(10), pp 1250–1255 23 Chylinski K., Le Rhun A., Charpentier E (2013), “The tracrRNA and Cas9 families of type II CRISPR–Cas immunity systems”, RNA Biology, 10(5), pp 726–37 24 Denny T P (1995), “Involvement of bacterial polysaccharides in plant pathogenesis”, Annual Review of Phytopathology, 33(1), pp 173–197 25 Doyle J J., Doyle J L (1990), “Isolation of plant DNA from fresh tissue”, Focus, 12, pp 13–15 26 Farasat I., Salis H M (2016), “A biophysical model of CRISPR/Cas9 activity for rational design of genome editing and gene regulation”, PLoS Computational Biology, 12(1), pp e1004724 27 Gao Z., Herrera–Carrillo E., Berkhout B (2018), “Improvement of the CRISPR–Cpf1 system with ribozyme–processed crRNA”, RNA Biology, 15(12), pp 1458–1467 28 Hu Y., Zhang J., Jia H., Sosso D., Li, T., Frommer W B., Yang B., White F F., Wang N., Jones J B (2014), “Lateral organ boundaries is a disease susceptibility gene for citrus bacterial canker disease”, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 111, pp 521–529 29 Huang S., Antony G., Li T., Liu B., Obasa K., Yang B., White F F (2016), “The broadly effective recessive resistance gene xa5 of rice is a virulence effector–dependent quantitative trait for bacterial blight”, The Plant Journal, 86(2), pp 186–194 73 30 Hutin M., Sabot F., Ghesquière A., Koebnik R., Szurek B (2015), “A knowledge– based molecular screen uncovers a broad spectrum OsSWEET14 resistance allele to bacterial blight from wild rice”, The Plant Journal, 84(4), pp 694–703 31 Ikeda R., Abien R E T., Ogawa T (1995), “Linkage analyses of resistance genes to bacterial blight in rice”, Japan Agricultural Research Quarterly, 29, pp 137–142 32 International Rice Research Institute, International Network for Genetic Evaluation of Rice (1996), Standard evaluation system for rice, International Rice Research Institute, Manila 33 Ji G H., Wei L F., Wu Y P., Bai X H (2008), “Biological control of rice bacterial blight by Lysobacter antibioticus strain 13–1”, Biological Control, 45, pp 288–296 34 Jones J D G., Dangl J L (2006), “The plant immune system”, Nature, 444, pp 323–329 35 Koch M., Parlevliet J E., Mew T W (1991), “Assessment of quantitative resistance of rice cultivars to Xanthomonas campestris pv oryzae: A comparison of inoculation methods”, Euphytica, 54, pp 169–175 36 Li J., Norville J E., Aach J., McCormack M., Zhang D., Bush J., Church G M., Sheen J (2013), “Multiplex and homologous recombination–mediated genome editing in Arabidopsis and Nicotiana benthamiana using guide RNA and Cas9”, Nature Biotechnology, 31, pp 688–691 37 Li T., Liu B., Spalding M H., Weeks D P., Yang B (2012), “High–efficiency TALEN–based gene editing produces disease–resistant rice”, Nature Biotechnology, 30, pp 390–392 38 Liang G., Zhang H., Lou D., Yu D (2016), “Selection of highly efficient sgRNAs for CRISPR/Cas9–based plant genome editing”, Scientific Reports, 6, pp 21451 39 Liu Q., Yuan M., Zhou Y., Li X., XIiao J., Wang S (2011), “A paralog of the MtN3/saliva family recessively confers race–specific resistance to Xanthomonas oryzae in rice”, Plant, Cell & Environment, 34, pp 1958–1969 40 Liu X., Wu S., Xu J., Sui C., Wei J., (2017), “Application of CRISPR/Cas9 in plant biology”, Acta Pharmaceutica Sinica B, 7(3), pp 292–302 41 Lu H., Patil P., Sluys M V., White F F., Ryan R P., Maxwell Dow J., Rabinowicz P., Salzberg S L., Leach J E., Sonti R., Brendel V., Bogdanove A J (2008), “Acquisition 74 and evolution of plant pathogenesis–associated gene clusters and candidate determinants of tissue–specificity in Xanthomonas”, Plos One, 3(11), pp e3828 42 Ma X., Zhang Q., Zhu Q., Liu W., Chen Y., Qiu R., Wang B., Yang Z., Li H., Lin Y., Xie Y., Shen R., Chen S., Wang Z., Chen Y., Guo J., Chen L., Zhao X., Dong Z., Liu Y G (2015), “A robust CRISPR/Cas9 system for convenient, high-efficiency multiplex genome editing in monocot and dicot plants”, Molecular Plant, 8(8), pp 1274–1284 43 Ma X., Zhu Q., Chen Y., Liu Y G (2016), “CRISPR/Cas9 platforms for genome editing in plants: Developments and applications”, Molecular Plant, 9(7), pp 961–974 44 Mew T W (1984), “Scanning electron microscopy of virulent and avirulent strains of Xanthomonas campestris pv oryzae on rice leaves”, Phytopathology, 74(6), pp 635–641 45 Mew T W., Alvarez A M., Leach J E., Swings J (1993), “Focus on bacterial blight of rice”, Plant Disease, 77, pp 5–12 46 Mew T W., Vera Cruz C M., Medalla E S (1992), “Changes in race frequency of Xanthomonas oryzae pv oryzae in response to rice cultivars planted in the Philippines”, Plant Disease, 76, pp 1029–1032 47 Mullis K B (1990), “The unusual origin of the polymerase chain reaction”, Scientific American, 262(4), pp 56–61 48 Nakashima K., Jan A., Todaka D., Maruyama K., Goto S., Shinozaki K., Yamaguchi–Shinozaki K (2014), “Comparative functional analysis of six drought responsive promoters in transgenic rice”, Planta, 239(1), pp 47–60 49 Nekrasov V., Staskawicz B., Weigel D., Jones J.D., Kamoun S (2013), “Targeted mutagenesis in the model plant Nicotiana benthamiana using Cas9 RNA–guided endonuclease”, Nature Biotechnology, 31(8), pp 691–693 50 OEPP/EPPO (2007), “Diagnostic: Xanthomonas oryzae”, OEPP/EPPO Bulletin, 37, pp 543–553 51 Ogawa T (1993), “Methods and strategy for monitoring race distribution and identification of resistance genes to bacterial leaf blight (Xanthomonas campestris pv oryzae) in rice (Oryza sativa)”, Japan Agricultural Research Quarterly, 27, pp 71–80 75 52 Ogawa T., Sekizawa K (1993), “Studies on the breeding of rice varieties resistant to bacterial leaf blight and test of the quantitative resistance of rice native varieties in Japan by clipping inoculation methods”, Bulletin of Chugoku National Agricultual Experiment, 27, pp 19–36 53 Ogawa T., Yamamoto T., Khush G., Mew T., Kaku H (1988), “Near–isogenic lines as international differentials for resistance to bacterial blight of rice”, Rice Genetics Newsletter, 54 Ogawa T., Yamamoto T., Khush G.S., Mew T.W (1991), “Breeding of near– isogenic lines of rice with single genes for resistance to bacterial blight pathogen (Xanthomonas campestris pv oryzae)”, Japan Journal of Breeding, 41, pp 523–529 55 Pogulis R J., Vallejo A N., Pease L R (2000), “Recombination and mutagenesis by overlap extension PCR”, The Nucleic Acid Protocols Handbook, pp 857–864 56 Pranamika S., Bora L C., Puzari K C., Baruah A M., Baruah R., Talukdar K., Kataky L., Phukan A (2017), “Review on bacterial blight of rice caused by Xanthomonas oryzae pv Oryzae: different management approaches and role of pseudomonas fluorescens as a potential biocontrol agent”, International Journal of Current Microbiology and Applied Sciences, 6(3), pp 982–1005 57 Project of Capacity Building of Quality Standard Control of Agricultural Materials (chemical fertilizers and pesticides) (2011), Guide Book for Pest Management, The Japan International Cooperation Agency, Tokyo 58 Prykhozhij S V., Rajan V., Gaston D., Berman J N (2015), “CRISPR multitargeter: a web tool to find common and unique CRISPR single guide RNA targets in a set of similar sequences”, PLoS One, 10(3), pp e0119372 59 Rousseau C., Gonnet M., Le–Romancer M., Nicolas J (2009), “CRISPI: a CRISPR interactive database”, Bioinformatics, 25, pp 3317–3318 60 Sambrook J., Russel D W (2001), Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York 61 Sanchez C A., Brar D S., Huang N., Li Z., Khush G S (2000), “Sequence tagged site marker–assisted selection for three bacterial blight resistance genes in rice”, Crop Science, 40, pp 792–797 76 62 Shan Q., Wang Y., Li J (2013), “Targeted genome modification of crop plants using a CRISPR–Cas system”, Nature Biotechnology, 31, pp 686–688 63 Shen B., Zhang W., Zhang J., Zhou J., Wang J., Chen L., Wang L., Hodgkins A., Iyer V., Huang X., Skarnes W.C (2014), “Efficient genome modification by CRISPR–Cas9 nickase with minimal off–target effects”, Nature Methods, 11(4), pp 399–402 64 Smith L M., Sanders J Z., Kaiser R J., Hughes P., Dodd C., Connell C R., Heiner C., Kent S B., Hood L E (1986), “Fluorescence detection in automated DNA sequence analysis”, Nature, 321(6071), pp 674–679 65 Song W Y., Wang G L., Chen L L., Kim H S., Pi L Y., Holsten T., Gardner J., Wang B., Zhai W X., Zhu L H., Fauquet C., Ronald P (1995), “A receptor kinase– like protein encoded by the rice disease resistance gene, Xa21”, Science, 270, pp 1804–1806 66 Streubel J., Pesce C., Hutin M., Koebnik R., Boch J., Szurek B (2013), “Five phylogenetically close rice SWEET genes confer TAL effector–mediated susceptibility to Xanthomonas oryzae pv Oryzae”, The New Phytologist, 200(3), pp 808–819 67 Sugio A., Yang B., Zhu T., White F F (2007), “Two type III effector genes of Xanthomonas oryzae pv oryzae control the induction of the host genes OsTFIIAgamma1 and OsTFX1 during bacterial blight of rice”, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 104, pp 10720– 10725 68 Suryadi Y., Samudra I M., Priyatno T P., Susilowati D N., Lestari P., Fatimah F., Kadir T S (2016), “Determination of pathotypes from indonesian Xanthomonas oryzae pv oryzae population causing bacterial leaf blight and their reactions on differential rice”, Makara Journal of Science, 20(3), pp 109–118 69 Swings J., Van Den Moore M., Vauterin L., Hoste B., Gillis M., Mew T.W., Kerster K (1990), “Reclassification of the causal agents of bacterial blight (Xanthomonas campestris pv oryzae) and bacterial leaf streak (Xanthomonas campestris pv oryzicola) of rice as pathovars of Xanthomonas oryzae (ex Ishiyama 1922) sp nov., nom rev.”, International Journal of Systematic Bacteriology, 40, pp 309–311 77 70 Tsaftaris A S., Polidoros A N., Karavangeli M., Nianiou–Obeidat I., Madesis P., Goudoula C (2000), “Biological resource management–connecting science and policy”, Transgenic crops: recent developments and prospects, Springer, pp 187–203 71 Tzfira T., Citovsky V (2007), Agrobacterium: From biology to biotechnology, Springer, Berlin 72 Upadhyay S K., Kumar J., Alok A., Tuli R (2013), “RNA guided genome editing for target gene mutations in wheat”, G3: Genes, Genomes, Genetics, 3, pp 2233– 2238 73 Wang K (2007), Agrobacterium Protocols, 2nd ed., in Methods Mol Biol., Humana Press, New Jersey 74 Weeks D P., Yang B (2017), Gene Editing in Plants, Academic Press, California 75 White F F., Potnis N., Jones J B., Koebnik R (2009), “The type III effectors of Xanthomonas”, Molecular Plant Pathology, 10, pp 749–766 76 Yan–chang, Shou–hai W., Cheng–quan L., Shuang W., De–zheng W., Shi–yun D (2004), “Improvement of resistance to bacterial blight by marker–assistedselection in a wide compatibility restorer line of hybrid rice”, Rice Research Institute, Anhui Academy of Agricultural Sciences, 11(5–6), pp 231–237 77 Yang B., Sugio A., White F F (2006), “Os8N3 is a host disease–susceptibility gene for bacterial blight of rice”, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 103(27): 10503–10508 78 Yinggen K., Shugang H., Meng Y (2017), “Xanthomonas oryzae pv oryzae inoculation and growth rate on rice by leaf clipping method”, BioProtocol, 7(19), pp 2568 79 Yu C., Chen H., Tian F., Yang F., He C (2017), “RpoN2- and FliA-regulated fliTX is indispensible for flagellar motility and virulence in Xanthomonas oryzae pv oryzae”, BMC Microbiology, 17, pp 171 80 Yu Y., Streubel J., Balzergue S., Champion A., Boch J., Koebnik R., Feng J., Verdier V., Szurek B (2011), “Colonization of rice leaf blades b y an African strain of Xanthomonas oryzae pv oryzae depends on a new TAL effector that induces the rice nodulin–3 Os11N3 Interactions, 24(9), pp 1102–1113 78 gene”, Molecular Plant–microbe 81 Zeng X., Tian D., Gu K., Zhou Z., Yang X., Luo Y., White F F., Yin Z (2015), “Genetic engineering of the Xa10 promoter for broad-spectrum and durable resistance to Xanthomonas oryzae pv oryzae”, Plant Biotechnology Journal, 13, pp 993–1001 82 Zhou J., Peng Z., Long J., Sosso D., Liu B., Eom J S., Huang S., Liu S., Vera Cruz C., Frommer W B., White F F., Yang B (2015), “Gene targeting by the TAL effector PthXo reveals cryptic resistance gene for bacterial blight of rice”, Plant Journal, 82(4), pp 632–643 Trang web 83 http://plants.ensembl.org/ 84 http://unafold.rna.albany.edu/ 85 http://www.fao.org/ 86 http://www.multicrispr.net/ 87 http://www.ppd.gov.vn/ 88 http://www.vaas.org.vn/ 89 https://benchling.com 90 https://crispr.cos.uni-heidelberg.de/ 79 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Kết đánh giá độc tính vi khuẩn Xoo giống lúa IR24 Ghi chú: Cây lúa IR24 lây nhiễm với 12 chủng vi khuẩn Xoo (VXO_50, 51, 52, 53, 54, 59, 60, 61, 62, 66, 68, 69) phương pháp cắt Đồ thị biểu chiều dài vết bệnh lúa sau 14 ngày lây nhiễm Số liệu đồ thị kết trung bình lần thí nghiệm Phụ lục 2: Sơ đồ vector pGEM–T Phụ lục 3: Trình tự promoter SW14–TBR (5’ – 3’) TGCATATGCGTTGGGTTCATTAGATACCAAGCTTTAAACCCGGAAAAAAG ATCATGAAAAAAAGGAAGAACAATTATGTTCTCTCTCCCTAAATGCAGG ACTGTTAATTGAAGCAAATAAAGCAGTCCAAGCTAGCTAGGGGAATTGT CAGTAGCAGCATACATGGAGAAAGCAAGCAAAAAATTTTGTGGTTATGT GCTGGGGAAGAAAGCCATGGAAGAAAGCAAGGGTGCAGTGACGTGTAA CAGTCATGGCCAAGCTTGAATGATCTGGCACGTAGAGTGTTCTTGCCTGT GCCTGGCACGCTTCTTTTTTGTGTGCCCATATTGCAAAGTAACCGTGTGTG TGCCACTCCAACTGATAACTCACCATATAATAACTCTACAGTTATTGATA GATATATACATTACGTCCCTTTTTTAACTAATATCATCCAAATATTAGTTA AAAAGGGGGCGTAGTGTATATAGCCAACAGCTGTCAAAAAATTGAAAAT TACAACGAATATACGTAATTGCAAAGTGCAAATCACTCTTGTACTATCTT AAAAAGAAATGCAGAGTTTGATCGATTTTGTCTCTAATTTTAGGCAACTG GCATTCTGATTTTTTACAAGTGGGTTAATTAGAGCCAGCTGGTCTCAGAT CGTCCGTTGGGGAATTAAAGGAGGTGTGCTCCTTTGCGGCTCATCAGTTT CTCTAAGCTCTCACCATTCATTCCACTATACAAGCCTAAGGCAGCTAGCT TAGTTAATTACCTAATAACTATAGCTTGCCCAACTCTAGATCCCTTAACT AGGACAACTTGGAGTACACAACAATGTTAATAATCCCATGCATTGAGGA CAGAGTTGTGAAGGAAACAAAAAAAAGCTAGCAGATTGGCACTTTCTGT CATGCATGGGTGCTGATGATTATCTTGTATCTAATTTAATCAATCCCATG GCTGTGATTGATCAGGAATAGTTTGTGTGTGCAGCTATATTACCTATTGG TGTCCAGGGTCACACACCATAAGGGCATGCATGTCAGCAGCTGGTCATGT GTGCCTTTTCATTCCCTTCTTCCTTCCTAGCACTATATAAACCCCCTCCAA CCAGGTGCTAAGCTCATCAAGCCTTCAAGCAAAGCAAACTCAAGTAGTA GCTGATTACCAGCTCTTCCCTCTTCTCATTGAGAAAGAGGGAATTAAGTT TTGATCTCTGCTTTATTGCCGGATCATCCTCTTGTTACTTGCAAGCAAGAA CAGTAGTGTACTGTGCCTCCTTGATCTCCTCTCACCAAACTCTCTCTCTCT CTCTCATATTCCGAGCTAGCTAGTTAATCAAGATCTTGCTGCAATGGCTG GCATGTCTCTTCAGCATCCCTGGGCCTTCGCCTTTGGTCTCCTA Phụ lục 4: Trình tự cấu trúc biểu RNA vector pENTR4/gRNA (5’ – 3’) AAGAACGAACTAAGCCGGACAAAAAAAGGAGCACATATACAAACCGGT TTTATTCATGAATGGTCACGATGGATGATGGGGCTCAGACTTGAGCTAC GAGGCCGCAGGCGAGAGAAGCCTAGTGTGCTCTCTGCTTGTTTGGGCCG TAACGGAGGATACGGCCGACGAGCGTGTACTACCGCGCGGGATGCCGC TGGGCGCTGCGGGGGCCGTTGGATGGGGATCGGTGGGTCGCGGGAGCG TTGAGGGGAGACAGGTTTAGTACCACCTCGCCTACCGAACAATGAAGAA CCCACCTTATAACCCCGCGCGCTGCCGCTTGTGTTGGCTAGGATCCATCG CAGTCAGCGATGAGTACAGCAAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAA AATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGC TTTTTTTTGAGATTTCCAACCAGGTCCCTGGAGCCCATAGTCTAGTAACG GCCGCCAGTGTGCTGGAATTGCCCTTGGATCATGAACCAACGGCCTGGC TGTATTTGGTGGTTGTGTAGGGAGATGGGGAGAAGAAAAGCCCGATTCT CTTCGCTGTGATGGGCTGGATGCATGCGGGGGAGCGGGAGGCCCAAGT ACGTGCACGGTGAGCGGCCCACAGGGCGAGTGTGAGCGCGAGAGGCGG GAGGAACAGTTTAGTACCACATTGCCCAGCTAACTCGAACGCGACCAAC TTATAAACCCGCGCGCTGTCGCTTGTGTAGAGACCAAAGGAGGTCTCAG TTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAAC TTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTTGTCCCTTCGA