PHÂN TÍCH GIÁ TRỊ một số STR MARKER TRONG CHẨN đoán TRƯỚC SINH một số LỆCH bội NHIỄM sắc THỂ

1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI BỘ Y TẾ NGUYỄN MẠNH KIÊN PHÂN TÍCH GIÁ TRỊ MỘT SỐ STR MARKER TRONG CHẨN ĐỐN TRƯỚC SINH MỘT SỐ LỆCH BỘI NHIỄM SẮC THỂ Chuyên ngành Mã số : Y Sinh học Di truyền : 60720106 ĐỀ CƯƠNG LUẬN VĂN THẠC SĨ Y HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS.BS Đoàn Thị Kim Phượng PGS.TS Trần Đức Phấn HÀ NỘI - 2017 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT BP Base pair DNA Deoxyribonucleic Acid FISH Fluorescence In Situ Hybridization NST Nhiễm sắc thể PCR Polymerase Chain Reaction QF-PCR Quantiative Fluorescence- Polymerase Chain Reaction RNA STR Ribonucleic Acid TAQ Theramus aquaticus Short Tandem Repeat MỤC LỤC DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH ĐẶT VẤN ĐỀ Dị tật bẩm sinh bất thường hay gặp thai nhi trẻ sơ sinh Tại nước phát triển, ước tính có khoảng triệu trẻ sinh có dị tật bẩm sinh [1] Trong bất thường nhiễm sắc thể nguyên nhân quan trọng gây dị tật bẩm sinh Một số hội chứng bất thường nhiễm sắc thể hay gặp như: hội chứng Down, hội chứng Edwards, hội chứng Patau số hội chứng bất thường nhiễm sắc thể giới Klinefelter, Turner Các bất thường bẩm sinh nguyên nhân gây tử vong bệnh tật năm đầu sau sinh, không để lại hậu nặng nề thiệt thòi lớn cho trẻ, mà gánh nặng lớn cho gia đình xã hội Bất thường nhiễm sắc thể chiếm khoảng 15% dị tật bẩm sinh chẩn đoán trước tuổi châu Âu, liên quan đến 25% tử vong chu sinh dị tật bẩm sinh [2] Hiện việc điều trị khắc phục hậu cho hội chứng nhiều khó khăn, việc phòng bệnh chẩn đốn sớm dị tật bẩm sinh thời kỳ phơi thai việc quan trọng cấp thiết để giảm bớt gánh nặng tâm lý kinh tế cho gia đình xã hội Gần đây, người ta phát trình tự lặp lại ngắn STR (short tandem repeat) có tính đa hình cao số locus định nhiễm sắc thể số 13, 18, 21, X, Y Nhờ tiến hành phản ứng nhân gen locus này, xác định số lượng alen hình ảnh điện di Do bất thường số lượng alen tương ứng với bất thường nhiễm sắc thể nên phương pháp ứng dụng để chẩn đoán hội chứng bất thường số lượng nhiễm sắc thể cách nhanh chóng xác mà không cần phải nuôi cấy tế bào Kỹ thuật QF-PCR gọi phản ứng chuỗi polymer huỳnh quang định lượng dùng để khuếch đại đoạn STR, nhiễm sắc thể khảo sát nhiều locus STR khác nhau, nhờ tính xác kỹ thuật nâng lên cao Nhiều kit phản ứng thương mại hóa, kit sử dụng marker STR khác đặc trưng cho nhiễm sắc thể khảo sát Tuy nhiên, chủ yếu kit sản xuất nước STR đưa vào sử dụng chủ yếu nghiên cứu từ chủng tộc thuộc châu Âu, châu Mỹ Do giá trị việc sử dụng marker người Việt Nam cần đánh giá thực tiễn Bên cạnh đó, locus STR lựa chọn có đặc điểm riêng tính đa hình, tượng dị/đồng hợp tử từ ảnh hưởng lớn đến việc phân tích kết ý nghĩa chẩn đốn Vì tơi tiến hành đề tài “Phân tích giá trị số STR marker chẩn đoán trước sinh số dị bội nhiễm sắc thể” với mục tiêu: Xác định tỷ lệ đồng hợp tử, dị hợp tử STR marker sử dụng kỹ thuật QF-PCR để chẩn đoán số lệch bội nhiễm sắc thể Đánh giá giá trị số STR marker sử dụng kỹ thuật QF-PCR để chẩn đoán số lệch bội nhiễm sắc thể Chương TỔNG QUAN 1.1 Các bất thường lệch bội thường gặp 1.1.1 Hội chứng Down Hội chứng Down bất thường lệch bội hay gặp nhất, tần số khoảng 1/319-1/1000 trẻ sơ sinh [3-4], tần số khơng có khác biệt chủng tộc tầng lớp xã hội giới Tỷ lệ nam/nữ mắc hội chứng Down khoảng 3/2 [5] Về di truyền tế bào học, khoảng 92,5% trường hợp thể ba nhiễm 21 (47,XX,+21 47,XY,+21) [6] Thể ba nhiễm xảy rối loạn phân ly cặp NST 21 trình tạo giao tử, karotyp bố mẹ bình thường Khoảng 2-3% trường hợp thể khảm với dòng tế bào, dòng tế bào chứa 46 NST, dòng tế bào chứa 47 NST, thừa NST số 21 [5] Khoảng 2-4% trường hợp thể chuyển đoạn [7], trẻ mắc hội chứng Down có 46 NST với NST số 21 NST 21 thứ chuyển đoạn với NST tâm đầu khác, hay gặp NST số 13, 14, 15 thuộc nhóm D 21, 22 thuộc nhóm G Triệu chứng lâm sàng trường hợp khơng khác so với thể ba nhiễm 21 Tuy nhiên bệnh có tính chất gia đình, bố mẹ đứa trẻ mắc hội chứng Down chuyển đoạn người bình thường mang NST chuyền đoạn cân NST 21 với NST số 13, 14, 15 21, 22 [5] Về triệu chứng lâm sàng, hội chứng Down có biểu dễ nhận biết: đầu nhỏ, ngắn; mặt tròn, gốc mũi tẹt, khe mắt xếch, lưỡi to dày, tai nhỏ, thấp; cổ ngắn, gáy phẳng rộng, bàn tay rộng, ngón tay ngắn [8] Trẻ mắc hội chứng Down chậm phát triển trí tuệ, IQ thấp trung bình 30-50 Thường gặp dị tật tim (thơng liên thất, thơng liên nhĩ, ống động mạch), dị tật tiêu hóa (hẹp tá tràng, khơng hậu mơn phình to đại tràng) Ngồi ra, hội chứng Down liên quan đến bệnh Alzheimer, bạch cầu cấp, tăng huyết áp…[7] Các nghiên cứu tỷ lệ mắc hội chứng Down tăng nhanh theo tuổi mẹ, chế liên quan đến đột biến không phân ly NST 21 trình giảm phan tạo giao tử Bên cạnh đó, tuổi mẹ trẻ tuổi bố cao ảnh hưởng đến tần số sinh Down [9] Các nguyên nhân khác kể đến rối loạn nhiễm sắc thể bố mẹ, đột biến phát sinh yếu tố môi trường 1.1.2 Hội chứng Edwards [5] Hội chứng thể ba nhiễm 18 Edwards cộng mô tả năm 1960 Tỷ lệ chung bệnh 1/4000-1/8000 trẻ sinh với tỷ lệ nam/nữ khoảng 1/3 Về di truyền tế bào, 80% trường hợp thể ba nhiễm (47,XX,+18 47,XY,+18) Khoảng 10% thể khảm 10% thể chuyển đoạn thể ba nhiễm kép Trẻ sinh nhẹ cân, thường đẻ non, có trán hẹp, sọ dài to, khe mắt hẹp, tai thấp, quăn nhọn, miệng bé, hàm nhỏ lùi sau Bàn tay đặc biệt, ngón quặp vào lòng bàn tay, bàn tay nắm lại, ngón trỏ chùm lên ngón nhẫn Bàn chân vẹo Thường kèm theo dị tật tim, quan sinh dục, thoát vị rốn Tiên lượng xấu, thường chết sau đẻ sống trung bình khoảng 10 tuần Tuổi mẹ có ảnh hưởng rõ rệt đến tỷ lệ mắc hội chứng 1.1.3 Hội chứng Patau [5] Hội chứng thể ba nhiễm 13 Patau cộng miêu tả năm 1960 Tần số chung bệnh 1/5000-1/10000 trẻ sinh, với tỷ lệ nữ mắc nhiều nam Về di truyền tế bào, khoảng 80% trường hợp thể ba nhiễm , 20% trường hợp thể khảm chuyển đoạn 13/13 bố mẹ truyền cho phát sinh Trẻ mắc hội chứng Patau có đặc điểm: đầu nhỏ, nhãn cầu nhỏ khơng có nhãn cầu, tai thấp biến dạng, thường điếc, sứt môi hai bên, nứt cái, tâm thần vận động phát triển, thường kèm theo dị tật tim ống tiêu hóa Tiên lượng bệnh xấu, phần lớn chết năm đầu, trường hợp khảm biểu lâm sàng nhẹ sống lâu 1.1.4 Một số hội chứng lệch bội NST giới [5-10] Hội chứng Turner Monosomi NST X có tỷ lệ chết cao giai đoạn phôi thai (98-99%), số nhỏ sống đến sinh Tần số trẻ em gái bị monosomi NST X lúc sinh 1/3000 Về di truyền tế bào, 55% trường hợp có karyotyp 45, X; 10% trường hợp dạng khảm, 20% trường hợp NST X đểu nhánh dài nhánh ngắn, 5% trường hợp đoạn, 5% trường hợp NST X vòng, 5% trường hợp có NST Y trường hợp khảm 45,X/46,XY Về biểu lâm sàng, trẻ gái có người thấp, chậm lớn, hàm nhỏ, cằm nhỏ, tai thấp, mép xệ, tóc mọc thấp xuống tận gáy, cổ ngắn rộng Cẳng tay cong ngoài, ngắn đốt bàn 5, da nhiểu nốt ruồi, móng tay giảm sản lồi Trẻ nhi tính đến tuổi dậy thì, thường kèm theo dị tật tim mạch, tiết niệu xương Thường thiểu trí tuệ nhẹ, có trường hợp bình thường Bệnh nhân thường vô sinh, số trường hợp thể khảm nhẹ có thai sinh Hội chứng Klinefelter 10 Được mô tả Klinefelter năm 1942 80% trường hợp có Karyopyp 47,XXY, lại trạng thái khảm Triệu chứng lâm sàng giai đoạn sơ sinh trẻ nhỏ khó nhận biết khơng có dị dạng quan trọng có dị dạng khơng đặc hiệu tinh hồn lạc chỗ, lỗ đái lệch thấp Ở giai đoạn dạy thì, nhiều trường hợp người cao, chân tay dài, có trường hợp có hình thái nam bình thường Các triệu chứng thường thấy tinh hồn khơng phát triển, 35-50% có chứng vú to, giới tính nam phát triển, khơng râu, lơng mu, dương vật bé, tình dục giảm Trí tuệ phát triển bình thường, có trường hợp suy giảm Một số hội chứng khác như: Hội chứng 47,XYY; Hội chứng 47,XXX;… 1.2 Các phương pháp chẩn đoán trước sinh 1.2.1 Phương pháp di truyền tế bào - Nuôi cấy tế bào lập karyotyp phương pháp truyền thống xem tiêu chuẩn vàng phân tích rối loạn NST người Ứng dụng kỹ thuật vào chẩn đoán trước sinh bắt đầu nghiên cứu thực vào năm 1966 Steele Breg báo cáo nuôi cấy tế bào ối để xác định NST thai Tế bào ối, máu cuống rốn gai đem nuôi cấy từ – 14 ngày, sau dừng chu kỳ tế bào chu kỳ tạc động colchicin Tiến hành thu hoạch tế bào trải lên lam kính, nhuộm băng phân tích NST phần mềm chuyên dụng - Kỹ thuật xác định bất thường số lượng cấu trúc NST với độ xác cao, từ 99,4-99,8% đáng tin cậy - Tuy nhiên nhược điểm phương pháp thời gian trả kết kéo dài từ 14-21 ngày Điều tạo tâm lý bất an kéo dài thai phụ khiến việc chấm dứt thai kỳ định trở nên phức tạp nguy hiểm Bên cạnh đó, kỹ thuật đòi hỏi tay nghề chun môn cao người thực 1.2.2 Phương pháp di truyền tế bào – phân tử (kỹ thuật lai chỗ huỳnh quang FISH) 40 1:1 1:1:1 1:2/2:1 Tỷ lệ phát Tỷ lệ phát chung Nhận xét: 41 3.3.3 Tỷ lệ phát alen NST 21 STR marker Bảng 3.9: Tỷ lệ phát alen NST số 21 STR marker Ký hiệu 21A 21B 21C 21D 21G 21H 21J STR D21S1435 D21S11 D21S1411 D21S1444 D21S1446 D21S1442 D21S2055 Trisomy 21 peak peak 1:1 42 1:1:1 1:2/2:1 Tỷ lệ phát Không Trisomy 21 peak peak 43 1:1 1:1:1 1:2/2:1 Tỷ lệ phát Tỷ lệ phát chung 44 Nhận xét: 3.3.4 Tỷ lệ phát alen NST X STR marker Bảng 3.10 Tỷ lệ phát alen NST X STR marker Ký hiệu X1 X2 X3 X9 XY2 XY3 AMEL STR DXS1187 DXS981 XHPRT DXS2390 DXYS267 DXYS218 AMELX T1 T3 Trisomy 21 peak 45 peak 1:1 1:1:1 1:2/2:1 Tỷ lệ phát 46 Không Trisomy 21 peak peak 1:1 1:1:1 47 1:2/2:1 Tỷ lệ phát Tỷ lệ phát chung 3.3.5 Tỷ lệ phát alen NST Y STR marker Bảng 3.11 Tỷ lệ phát alen NST Y STR marker Ký hiệu XY2 48 XY3 AMEL ZFYX STR DXYS267 DXYS218 AMELY ZFY Trisomy 21 peak peak 1:1 1:1:1 1:2/2:1 Tỷ lệ phát 49 Không Trisomy 21 peak peak 1:1 1:1:1 1:2/2:1 Tỷ lệ phát Tỷ lệ phát chung 50 3.4 Kết phương pháp chẩn đoán trước sinh (QF-PCR Di truyền tế bào) 3.4.1 Tỷ lệ thành công phương pháp QF-PCR Di truyền tế bào Bảng 3.12: Tỷ lệ thành công phương pháp QF-PCR Di truyền tế bào Tuần thai Tỷ lệ thành công Di truyền tế bào QF-PCR 16 đến ≤17 tuần >17 đến ≤18 tuần >18 tuần Chung Nhận xét: 3.4.2 So sánh kết phương pháp QF-PCR Di truyền tế bào Bảng 3.13: So sánh kết phương pháp QF-PCR Di truyền tế bào Di truyền tế bào QF - PCR Tỷ lệ xác n % n % Trisomy 13 Trisomy 18 51 Trisomy 21 Bất thường khác Bình thường Tổng số Nhận xét: Chương DỰ KIẾN BÀN LUẬN 4.1 Bàn luận đặc điểm chung đối tượng 4.2 Bàn luận tỷ lệ đồng hợp tử, dị hợp tử STR marker sử dụng kỹ thuật QF-PCR để chẩn đoán số lệch bội NST 4.3 Bàn luận giá trị số STR marker sử dụng kỹ thuật QF-PCR để chẩn đoán số lệch bội NST 4.4 Bàn luận giá trị chẩn đoán phương pháp QF-PCR phát lệch bội NST 52 DỰ KIẾN KẾT LUẬN Tỷ lệ đồng hợp tử, dị hợp tử STR marker sử dụng kỹ thuật QF-PCR để chẩn đoán số lệch bội NST Giá trị số STR marker sử dụng kỹ thuật QF-PCR để chẩn đoán số lệch bội NST TÀI LIỆU THAM KHẢO Bale J.R., Stoll B.J., Lucas A.O (2003) Improving Birth Outcomes: Meeting the Challenge in the Developing World, National Academies Press, Washington (DC) Wellesley D., Dolk h., Boyd P.A et al (2012) Rare chromosome abnormalities, prevalence and prenatal diagnosis rates from populationbased congenital anomaly registers in Europe European Journal of Human Genetics., 20 (5), 521-526 O’Nuallain S., Flanagan O., Raffat I., Avalos G., Dineen B (2009) The prevalence of Down syndrome in County Galway Ir Med, 100, 329-331 Wahab A.A., Bener A.,Teebi A.S (2006) The incidence patterns of Down syndrome in Qatar Clin Genet, 69, 360-362 Trịnh Thị Thanh Hương, Trịnh Văn Bảo (2010) Di truyền y học, Nhà xuất Giáo dục Việt Nam, Phạm Thành Hồ (2001) Di truyền học, Nhà xuất Giáo dục, Asim, Ambreen, Kumar et al (2015) “Down syndrome: an insight of the disease” Journal of Biomedical Science, 22 (1), 41 Sinet P.M., Theopile D., Rahmani Z., Chettouch Z., Blovin J.L., Prier M et al (1994) Mapping of Down syndrome phenotype on chromosome 21 at the molecular level Biomed Pharmacother, 48 (5-6), 247-252 Coppedè, Fabio (2016) Risk factors for Down syndrome Archives of Toxicology, 90 (12), 2917-2929 10 Wolff D.J., Dyke D.L.V et al (2010) Laboratory guideline for Turner syndrome Genetics in Medecine, American collage of Medical Genetics, 52-55 11 Stefania Turrina, Giulia Filippini (2008) Rapid Prenatal diagnosis of common chromosome aneuploidies by QF-PCR: Evaluation of two in vitro diagnostic test kits (Chromoquant and Aneufast) Genetics Supplement Series, 1, 582-583 12 Nguyễn Duy Bắc cộng (2010) Nghiên cứu áp dụng kỹ thuật QFPCR chẩn đoán số hội chứng bất thường nhiễm sắc thể Hội nghị sinh học phân tử hóa sinh tồn quốc lần thứ 2, 160-165 13 Vũ Thị Huyền (2012) Áp dụng kỹ thuật QF-PCR để chẩn đoán trước sinh hội chứng Down, Luận văn bác sĩ nội trú, Đại học Y Hà Nội ... QF-PCR để chẩn đoán số lệch bội nhiễm sắc thể Đánh giá giá trị số STR marker sử dụng kỹ thuật QF-PCR để chẩn đoán số lệch bội nhiễm sắc thể 8 Chương TỔNG QUAN 1.1 Các bất thường lệch bội thường... phân tích kết ý nghĩa chẩn đốn Vì tơi tiến hành đề tài Phân tích giá trị số STR marker chẩn đoán trước sinh số dị bội nhiễm sắc thể với mục tiêu: Xác định tỷ lệ đồng hợp tử, dị hợp tử STR marker. .. Điện di mao quản hệ thống ABI 3500XL Phân tích liệu phần mềm Genemapper ID 3.2 Phân tích Karyotyp Đối chiếu kết Đánh giá giá trị marker STR 2.4.4 Biến số, số 2.5 Phương tiện sử dụng 2.5.1 Dụng