Đang tải... (xem toàn văn)
Chẩn đoán di truyền tiền làm tổ là thuật ngữ chỉ việc sàng lọc những phôi mang bất thường di truyền trước chuyển phôi hoặc sàng lọc trứng trước thụ tinh. Lệch bội NST là một trong những nguyên nhân gây dị dạng, để lại hậu quả nặng nề ở thai nhi, đặc biệt là các đối tượng có nguy cơ cao. Do vậy việc sàng lọc lệch bội hoặc các bất thường di truyền ở những đối tượng thụ tinh trong ống nghiệm góp phần không nhỏ vào việc ngăn chặn những rủi ro này.
bào- gây dị dạng nặng nề cho thai nhi, sảy thai … [6][7] Do vậy, việc sàng lọc lệch bội NST bệnh nhân thụ tinh ống nghiệm cần thiết góp phần giảm thiểu tỷ lệ trẻ sinh mang dị dạng bẩm sinh, chậm phát triển trí tuệ, … hội chứng Patau, Edwards, Down, Turner … lệch bội NST 13, 18, 21 cặp NST giới tính góp phần giảm bớt gánh nặng cho gia đình xã hội Bên cạnh đó, việc sàng lọc lệch bội NST chẩn đoán di truyền tiền làm tổ cịn góp phần khơng nhỏ vào việc nâng cao tỷ lệ làm tổ phôi mà nhiều nghiên cứu giới đưa [8][9][10] Vật liệu phương pháp nghiên cứu 2.1 Vật liệu - Phôi bào ngày 3: 26 phôi bào - Dung dịch nhược trương Tác giả liên hệ (Corresponding author): Hoàng Thị Hương, email: emilyhuong2002@yahoo.com Ngày nhận (received): 15/04/2014 Ngày phản biện đánh giá báo (revised): 06/05/2014 Ngày báo chấp nhận đăng (accepted): 09/05/2014 Tạp chí phụ sản - 12(2), 176-178, 2014 - Dung dịch cố định - Kit lai huỳnh quang chỗ (MultiVysion-Vysis) - Đĩa lai ổn nhiệt - Kính hiển vi thường - Kính hiển vi huỳnh quang số vật dụng khác 2.2 Phương Pháp - Cố định phôi bào: phôi bào cố dịnh lam kính chuẩn bị sẵn sau ủ dung dịch nhược trương 5-10 phút để phá vỡ màng tế bào, bộc lộ nhân nguyên màng nhân gian kỳ Xác định vị trí nhân làm khơ tiêu mẫu nhiệt độ phịng trước lai - Lai huỳnh quang chỗ (FISH): nhỏ 3ul kít lai MultiVysion lên vị trí mẫu cố dịnh, phủ lamen, cement tiến hành lai đĩa lai ổn nhiệt ThermoBrite theo chu trình: 73OC-5 phút, 37OC-4 - Xử lý mẫu sau lai: Bỏ lamen gắn lam kính, ủ mẫu dung dịch rửa 0,4 x SSC 74OC phút Sau ủ tiếp dung dịch rửa x SSC, phút nhiệt độ phịng Để mẫu khơ hồn tồn tiến hành nhỏ 6-10ul Antifade II, phủ lamen đọc kết kính hiển vi huỳnh quang bội tiến hành lai mẫu chứng (2)(6) phơi bào bình thường số lượng cặp NST 13, 18, 21 cặp NST giới tính (3) phản ánh tượng lệch bội cặp NST 21 (hội chứng Down), ảnh (4) thị tín hiệu huỳnh quang màu đỏ cho tượng lệch bội NST 13 (hội chứng Patau) ảnh (5) cho thấy sau kết lai huỳnh quang xuất tín hiệu xanh Aqua NST số 18 (HC Edwards) Hình 1: (1) Phơi bào mang NST tam bội (mẫu chứng), (2) Phơi bào bình thường số lượng cặp NST 13, 18, 21, X Y (3) Phôi bào mang bất thường số lượng cặp NST 21 (trisomy 21-HC Down), (4) Phôi bào mang bất thường số lượng cặp NST 13 (trisomy 13HC Patau) Trên tổng số 127 phôi tiến hành xét nghiệm, tỷ lệ phơi bình thường chiếm 53,6% Trong số phôi bất thường, hội chứng Patau chiếm 10%, hội chứng Edwards 4,1%, hội chứng Down chiếm 18,4%, Turner chiếm 4,1%, Klinefelter chiếm 2%, monosomy chiếm 20,4% hội chứng khác thể không nhiễm, hội chứng XYY, XXX … chiếm ~41% [Bảng 1] Bảng Tỷ lệ bất thường NST cặp NST lai Bất thường Tổng Phơi Bình XNo 46,4% thường Patau Edwards Down Turner Klinefelter Monosomy Bất thường khác 127 10% 4,1% 18,4% 4,1% 2% 20,4% 41% 53,6% Kết Dưới (Hình 1) số hình ảnh mà chúng tơi đưa nghiên cứu lệch bội NST (1) thể tam Bàn luận (1) (1) (1) (1) (3) (3) (3) Hình(5) (2) (1) (1) (3) (3) (3) (2) (2) (2) (2) (4) (4) (4) (2) (4) (4) (4) Lai huỳnh quang chỗ (FISH) phương pháp sử dụng phổ biến cho xác định lệch bội NST phôi Khác với nhiễm sắc thể đồ, FISH sử dụng nhân gian kỳ nên xác định lệch bội trứng thể cực phôi bào (blastomere) phơi Sau cố định lam kính nhân gian kỳ lai với đoạn DNA dò, đoạn đặc hiệu với tùng vùng NST cần xác định đánh dấu tín hiệu màu huỳnh quang riêng Ở đây, chúng tơi sử dụng kít mang DNA dị hãng VysisMultiVysion (kít chuẩn lựa chọn nhiều trung tâm nghiên cứu lớn giới), tín hiệu huỳnh quang màu xanh (green) hiển thị cho NST 21, đỏ (red) hiển thị cho NST 13, màu xanh dương (Aqua) hiển thị cho NST 18, màu xanh nước biển (blue) hiển thị cho NST X màu vàng (gold) hiển thị cho NST Y Đối với kỹ thuật FISH, việc đánh giá kết lai gặp tỷ lệ nhỏ tín hiệu chồng lên nhau, dẫn đến kết luận sai số trường hợp monosomy (mất tín hiệu) Tuy nhiên dựa kết nghiên cứu mà (5) (6) (6) (5) bào (5)mang NST tam bội (6)(mẫu(6) Hình (1) mang Phơi chứng), h 1: (1) Phôi1:bào NST tam bội (mẫu chứng), (2) Phơi (2) bàoPhơi bìnhbào bình (5) (6) (6) Hình 1:Hình (1) Phôi 1: (1)bào Phôi mang bào(5) mang NSTbộtam NST bộitam (mẫu bội chứng), (mẫu chứng), (2) Phôi(2)bào Phôi bình bào bình số 13,X18, Y (3) bàobấtmang bất ng vềthường số lượng cặplượng NST cặp 13, NST 18, 21, và21, Y X(3)vàPhôi bàoPhôi mang nh 1: thường (1) mang bộcặp NST tam bội18, (mẫu chứng), (2) Phôi bào bình Hình (1)sốPhơi bào mang 13, NST tam chứng), (2) Phơi bào bình hường Phơi số 1: lượng vềbào cặp lượng NST 13, NST 18, 21, X 21,bội Y X (mẫu (3) Y Phôi (3) bào Phôi mang bào bất mang bất cặp số lượng NST 21 21-HC (trisomyDown), 21-HC(4) Down), ng vềthường số lượng NST cặp 21 (trisomy Phôi (4) bàoPhôi mangbào mang ường số lượng cặp NST 13, 18, 21, X Y (3) Phôi bào mang bất thường số lượng cặp NST 13, 18, 21, X Y (3) Phôi bào mang bất hường thường số lượng số cặp lượng cặp21NST (trisomy 21 (trisomy 21-HC 21-HC Down),Down), (4) Phơi(4)bào Phơi mang bào mang Tạp chí Phụ Sản Tập 12, số 02 Tháng 5-2014 177 Hỗ trợ sinh sản giới đưa ra, đây, lựa chọn phương pháp cố định tạo đường kính lớn cho nhân phôi bào giai đoạn gian kỳ nhằm giảm bớt tín hiệu giả đưa kết luận âm tính giả Để khắc phục tượng này, số trung tâm giới lựa chọn việc chuyển phôi với phôi mang thể monosomy phôi phát triển đến giai đoạn blastocyst (ngoại trừ monosomy X 21) Nhằm mục đích hiểu rõ chất lượng phôi mức độ di truyền ảnh hưởng số yếu tố đến tượng lệch bội phôi bào, tiếp tục tiến hành nghiên cứu, mở Tài liệu tham khảo Edwards Rober G, Gardner RL Sexing of live rabbit blastocysts May 1967; Nature 214 (5088): 576–7 Handyside AH, Lesko JG, Tarín JJ, Winston RM, Hughes MR Birth of a normal girl after in vitro fertilization and preimplantation diagnostic testing for cystic fibrosis N Engl J Med Sep 1992; 327 (13): 905–9 Simoncelli,Tania.Pre-implantation Genetic Diagnosis: Ethical Guidelines for Responsible Regulation CTA International Center for Technology Assessment Retrieved on Nov 19 2013 Demko Z, Rabinowitz M, Johnson D Current Methods for Preimplantation Genetic Diagnosis” Journal of Clinical Embryology 2010; 13 (1): 6–12 Shkumatov A, Kuznyetsov V, Cieslak J, Ilkevitch Y, Verlinsky Y Obtaining metaphase spreads from single Tạp chí Phụ Sản 178 Tập 12, số 02 Tháng 5-2014 Hoàng Thị Hương, Nguyễn Viết Tiến, Đặng Thu Hằng rộng số lượng mẫu quy mô lớn để kết mang ý nghĩa thống kê hơn, góp phần quan trọng cho phát triển ngành hỗ trợ sinh sản nước ta Kết luận Từ kết nghiên cứu cho thấy tỷ lệ lệch bội NST phôi bào cao dạng lệch bội mà nghiên cứu kỹ thuật FISH đơn giản, dễ thực có độ xác cao Do vậy, việc sàng lọc bất thường trước chuyển phôi yếu tố cần thiết nhằm hạn chế trẻ sinh mang dị tật bẩm sinh, đặc biệt nhóm đối tượng có nguy cao blastomeres for PGD of chromosomal rearrangements” Reprod Biomed Apr 2007; Online 14 (4): 498–503 Sen S Aneuploidy and cancer Current Opinion in Oncology January 2000; 12 (1): 82–8 Driscoll DA, Gross S Clinical practice Prenatal screening for aneuploidy The New England Journal of Medicine June 2009; 360 (24): 2556–62 Callahan, Tamara L., and Aaron B Caughey Blueprints Obstetrics & Gynecology Baltimore, MD: Lippincott Williams & Wilkins, 2013 Chen, MD, Harold “Introduction to Trisomy 18” EMedicine Retrieved 2008-07-24 10 Opitz John M., Gilbert-Barness Enid F Reflections on the Pathogenesis of Down Syndrome American Journal of Medical Genetics 1990; 7: 38–51 (44) ... quang chỗ (FISH) phương pháp sử dụng phổ biến cho xác định lệch bội NST phôi Khác với nhiễm sắc thể đồ, FISH sử dụng nhân gian kỳ nên xác định lệch bội trứng thể cực phôi bào (blastomere) phôi... ta Kết luận Từ kết nghiên cứu cho thấy tỷ lệ lệch bội NST phôi bào cao dạng lệch bội mà nghiên cứu kỹ thuật FISH đơn giản, dễ thực có độ xác cao Do vậy, việc sàng lọc bất thường trước chuyển phôi... màu đỏ cho tượng lệch bội NST 13 (hội chứng Patau) ảnh (5) cho thấy sau kết lai huỳnh quang xuất tín hiệu xanh Aqua NST số 18 (HC Edwards) Hình 1: (1) Phôi bào mang NST tam bội (mẫu chứng), (2)