MỤC LỤCPHẦN I. MỞ ĐẦU11.Lý do chọn đề tài12.Mục đích nghiên cứu của đề tài23.Nhiệm vụ cụ thể của đề tài34.Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài35.Địa điểm và thời gian nghiên cứu3 Thời gian nghiên cứu3PHẦN II. NỘI DUNG4CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU41.Giới thiệu chung về cây khoai lang41.1.Phân loại, nguồn gốc, phân bố41.1.1.Phân loại41.1.2.Nguồn gốc và phân bố41.2.Đặc tính thực vật học61.2.1.Đặc điểm hình thái loài khoai lang61.2.2.Sinh trưởng và phát triển71.2.3.Kỹ thuật trồng và chăm sóc khoai lang82.PCR và ứng dụng kỹ thuật PCR trong nghiên cứu di truyền học.122.1. PCR122.1.1. Định nghĩa132.1.2.Nguyên tắc của kỹ thuật PCR132.2. Phương pháp RTPCR142.2.1. Khái niệm142.2.2. Nguyên tắc153.Công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật và ứng dụng trông nhân giống cây trồng153.1.Khái niệm nuôi cấy mô thực vật153.3.Cơ sở khoa học của kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật163.3.1.Tính toàn năng của tế bào thực vật163.3.2.Sự phân hóa và phản phân hóa của tế bào thực vật.163.3.3.Ý nghĩa của vi nhân giống173.4.Quy trình vi nhân giống183.5.Các yếu tố ảnh hưởng đến nhân giống vô tính in vitro193.5.1.Mô nuôi cấy193.5.2.Môi trường dinh dưỡng193.5.3.Chất điều hòa sinh trưởng193.6.Ứng dụng của nuôi cấy mô tế bào thực vật trong nuôi cấy các giống khoai lang trên thế giới và ở Việt Nam213.6.1.Tình hình nuôi cấy giống khoai lang trên thế giới213.6.2.Tình hình nuôi cấy giống khoai lang ở Việt Nam234.Virut đốm lông chim (Sweetpotato feathery mottle virus – SPFMV)24CHƯƠNG II. VẬT LIỆU VÀ28PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU281.Vật liệu nghiên cứu281.1.Vật liệu thực vật và các cặp mồi281.2.Hóa chất và thiết bị292. Phương pháp nghiên cứu302.1. Phương pháp tinh sạch virut đốm lông chim bằng kỹ thuật RT PCR302.1.1. Phương pháp tách chiết ADN302.1.2. Kỹ thuật RTPCR312.1.3.Điện di trên gel agarose322.1.4 Phương pháp phân tích số liệu.322.2. Các phương pháp nuôi cấy in vitro322.2.1. Thí nghiệm khử trùng cho mẫu nuôi cấy322.2.2. Thí nghiệm xác định môi trường tái sinh chồi trực tiếp từ mẫu cấy.342.2.3. Thí nghiệm xác định môi trường nhân nhanh cho chồi in vitro.352.2.4. Thí nghiệm xác định môi trường ra rễ thích hợp cho chồi in vitro362.2.5. Xác định khả năng sinh trưởng của chồi in vitro khi ra trồng ở giá thể.373. Phương pháp phân tích, xử lý số liệu.37CHƯƠNG III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU38VÀ THẢO LUẬN381.Kết quả sàng lọc ban đầu giống khoai lang sạch bệnh virut đốm lông chim (SPFMV).381.1Kết quả tách chiết ARN tổng số từ 6 giống khoai lang nghiên cứu.381.2. Kết quả sàng lọc giống khoai lang sạch virut bằng kỹ thuật RTPCR.392.Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của kiểu gen giống đến hiệu quả nhân in vitro.402.1Hiệu quả khử trùng tạo mẫu sạch của 6 giống khoai lang nghiên cứu.402.2.Kết quả kiểm tra độ tinh sạch virut của các mẫu cấy in vitro462.3.Kết quả tái sinh chồi trực tiếp từ mẫu sạch virut đốm lông chim của các giống nghiên cứu.47Hình 3.6 Chồi tái sinh trực tiếp của các giống nuôi cấy522.4.Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ các chất điều tiết sinh trưởng lên hệ số nhân nhanh của chồi in vitro ở các giống khoai nghiên cứu.522.5.Thành phần môi trường ra rễ thích hợp đối với các giống khoai lang nghiên cứu.60Hình 3.8 Rễ của các giống khoai lang trên môi trường ra rễ phù hợp nhất662.6.Kết quả đánh giá bước đầu khả năng sinh trưởng của cây in vitro khi ra trồng ở giá thể và ngoài môi trường66KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ68I. KẾT LUẬN68II. ĐỀ NGHỊ68TÀI LIỆU THAM KHẢO70
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI ***** ĐẶNG MINH HẰNG ỨNG DỤNG KỸ THUẬT RT – PCR SÀNG LỌC GIỐNG SẠCH BỆNH VÀ NHÂN NHANH IN VITRO MỘT SỐ GIỐNG KHOAI LANG SẠCH BỆNH VIRUT ĐỐM LÔNG CHIM (SPFMV) Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 60.42.01.21 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Nguyễn Xuân Viết HÀ NỘI - 2014 LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Nguyễn Xuân Viết, người tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tạo điều kiện tốt cho suốt trình học tập hoàn thiện đề tài Tôi xin chân thành cảm ơn kỹ thuật viên Trần Thị Quỳnh Nga tập thể cán phòng nuôi cấy mô Viện Khoa học kỹ thuật Nông nghiệp Bắc Trung Bộ, kỹ thuật viên Phùng Văn Hào trung tâm thực hành thí nghiệm trường Đại học Vinh tạo điều kiện tận tình giúp đỡ, bảo cho kiến thức, kỹ thuật kinh nghiệm suốt thời gian thực nghiên cứu hoàn thành luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè bên cạnh động viên, giúp đỡ suốt trình học tập nghiên cứu Hà Nội, ngày 12 tháng 10 năm 2014 Học viên Đặng Minh Hằng DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT VÀ KÍ HIỆU SỬ DỤNG Chữ viết tắt Viết đầy đủ ADN Axit Deoxiribo Nucleic ARN Axit Ribo Nucleic BAP 6- benzylaminopurin CT Công thức dNTP Deoxyribo Nucleotide Triphotphat ĐC Đối chứng GA3 Axit gibberellic IAA Indol Acetic Acid Kb Kilo base KHKTNN Khoa học kỹ thuật nông nghiệp MS Muraghige – Skoog NAA α – naphytyl Acetic Acid PCR Polymerase Chain Reaction RT-PCR Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction SPFMV Sweet potato feathery mottle virus TAE Tris – acetic acid – EDTA Taq Thermus aquaticus UV Ultra Violet DANH MỤC HÌNH VẼ VÀ SƠ ĐỒ DANH MỤC BẢNG VÀ BIỂU ĐỒ MỤC LỤC PHẦN I MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài Cây khoai lang coi loài lương thực quan trọng giới xếp quan trọng hàng thứ nước phát triển Nó trồng 100 quốc gia giới với chức nguồn thực phẩm giá trị người, gia súc vật liệu thô cho ngành công nghiệp chế biến Cây khoai lang tạo lượng sinh khối chất dinh dưỡng lớn đơn vị diện tích so sánh với loài trồng Trong nghiên cứu Nhật Bản, so sánh với 20 loài trái rau khác việc làm ngăn chặn làm giảm lượng cholesterol khoai lang xếp đầu bảng Ngoài khoai lang mang tính giải độc cao loại kim loại nặng Cây khoai lang thích nghi với nhiều điều kiện sinh thái nông nghiệp khác nhau, mọc vùng đất nghèo dinh dưỡng vùng đất bị khô hạn Tại Ai Cập, khoai lang trồng vùng đất khác với tổng diện tích 11.200 hecta với suất 30 tấn/ha Trong vòng vài ba năm qua nhu cầu xuất khoai lang tăng lên nhiều Ai Cập xuất 6.000 sang châu Âu Lý dịch hại bệnh ngăn cản việc làm cho khoai lang Ai Cập không đạt suất tối đa Trong bệnh virus coi nguyên nhân làm giảm suất Do đó, Viện Nghiên Cứu Kỹ thuật Gen Nông nghiệp Ai Cập (AGERI) áp dụng nhiều kỹ thuật nhằm cải tạo giống khoai lang thành công Ở Việt Nam khoai lang bốn loại lương thực sau lúa, ngô, sắn, lương thực quan trọng số vùng nước ta, tạo sinh khối lớn thời gian ngắn Khoai lang thuộc giống có củ, đối tượng kinh tế mà người trồng sử dụng giao lưu kinh tế thị trường để có thu nhập đảm bảo sống ngày Một số giống khoai lang cho suất cao, phẩm chất tốt trồng nhiều giống khoai Hoàng Long, KTB1, KTB2, Chiêm Dâu, KL5, Tím Nhật, Tím thường, cực nhanh… Việt Nam xếp thứ năm sản lượng khoai lang xuất toàn giới Tuy nhiên, suất thấp bấp bênh, không ổn định, củ nhỏ sử dụng giống bị thoái hóa, quan tâm đến biện pháp canh tác sâu bệnh Mặt khác, hầu hết nông dân chưa tiếp cận nhận nguồn giống đảm bảo bệnh Virut đốm lông chim khoai lang (Sweetpotato feathery mottle virus – SPFMV) thường làm giảm suất đáng kể vụ mùa khoai lang toàn giới Trên cánh đồng, sản lượng khoai lang bị nhiễm virus thường giảm từ 20% đến 100% so với nhiều trồng không bị nhiễm bệnh Những trồng mẫn cảm với vi rút thường bị thiệt hại đáng kể suất so với trồng có khả chịu đựng tốt Các triệu chứng SPFMV tán thường nhẹ Mức độ hiển thị triệu chứng phụ thuộc tính mẫn cảm giống trồng, giai đoạn phát triển mức độc tố virut Các triệu chứng củ phụ thuộc chủng SPFMV giống khoai lang Virus tiềm ẩn dây, tồn hom giống lưu truyền nhiều loài rệp SPFMV tìm thấy nơi khoai lang trồng Ngày nay, kỹ thuật sinh học phân tử đại phương pháp nhân giống in vitro tạo nhiều giống bệnh, suất cao, phẩm chất tốt Đặc biệt ứng dụng nhiều giống quý cho hiệu cao Mặc dù giới phương pháp ứng dụng nhiều nhiên Việt Nam hạn chế Xuất phát từ lý trên, thực đề tài: Ứng dụng kỹ thuật RT – PCR sàng lọc giống bệnh nhân nhanh in vitro số giống khoai lang bệnh virut đốm lông chim (SPFMV) - Mục đích nghiên cứu đề tài Sử dụng kỹ thuật RT-PCR chọn giống virut đốm lông chim (Sweet potato - feathery mottle virus) làm vật liệu nhân nhanh in vitro Xác định ảnh hưởng kiểu gen số thành phần Cytokinin Auxin môi trường nuôi cấy in vitro qua xác định môi trường nhân nhanh thích hợp số giống khoai lang quý, suất cao, phẩm chất tốt phục vụ cho - sản xuất Nhiệm vụ cụ thể đề tài Nghiên cứu sàng lọc ban đầu đánh giá hiệu sàng lọc mẫu mô nuôi cấy - tạo vật liệu nhân giống khoai lang Nghiên cứu ảnh hưởng kiểu gen giống hiệu nhân nhanh giống - khoai lang Đánh giá bước đầu triển vọng áp dụng kỹ thuật RT-PCR kết hợp nuôi cấy in vitro tạo - nguồn giống khoai lang bệnh virut cho sản xuất Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài Sử dụng kỹ thuật RT-PCR sàng lọc giống khoai lang đảm bảo bệnh - virut đốm lông chim, cung cấp nguồn giống cho sản xuất địa phương Xác định môi trường nuôi cấy in vitro thích hợp góp phần phát triển nhanh giống khoai lang chất lượng cao phục vụ nông dân vùng khó khăn đẩy mạnh sản xuất khoai lang hàng hóa quy mô lớn Địa điểm thời gian nghiên cứu - Địa điểm nghiên cứu • Viện Khoa học kỹ thuật nông nghiệp Bắc Trung Bộ • Phòng nuôi cấy mô – Trung tâm thực hành, thí nghiệm - Trường Đại học Vinh • Vườn thực nghiệm – Khoa sinh học – Trường đại học Vinh - Thời gian nghiên cứu Thời gian nghiên cứu từ tháng 01/2014 – 10/ 2014 PHẦN II NỘI DUNG CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 1.1.1 - Giới thiệu chung khoai lang Phân loại, nguồn gốc, phân bố Phân loại Giới (kingdom) : Thực vật (Plantae) Ngành (division): Thực vật hạt kín (Mangrolyophyta) Lớp (class): Một mầm (Magnoliopsida) Bộ (order): Solanales Họ (family): Họ bìm bìm (Convolvulaceae) Chi (genus): Ipomoea Loài : Ipomoea Batatas L Hình 1.1 Cây khoai lang 1.1.2 1.1.2.1 Nguồn gốc phân bố Nguồn gốc Khoai lang có nguồn gốc Nam Mỹ khoảng 5.000 năm trước Công Nguyên Dấu tích củ khô tồn lâu khám phá Caves Chilca Canyon thuộc Peru (Engel, 1970) Người ta tìm thấy diện khoai lang vùng Mayan Trung Mỹ Astin (1977) giả thuyết có hai trung tâm phát sinh nguồn gốc khoai lang Guatamala nam Peru Trong số công trình khác đa dạng loài khoai lang cao Colombia, Equador nam Peru Khoai lang khám phá Christophe Columbus thám hiểm tìm châu Mỹ năm 1492 Ông đưa vào Tây Ban Nha gọi khoai tây Tây Ban Nha hay khoai tây ngọt, sau gọi khoai lang Khoai lang mở rộng theo hai đường: Con đường từ Tây Ban Nha vào châu Âu sau truyền tới châu Phi, vào Ấn Độ Tây Ấn Con đường khác người Tây Ban Nha mang khoai lang từ vùng Trung Mỹ tới Philippines (Yen, 1982) vào khoảng năm 1521 (Obrien, 1972), sau tiếp tục đưa đến châu Phi (Cinklin, 1963) Khoai lang đưa Trung Quốc từ Philippines xuất Phúc Kiến (Fukien) năm 1594 Con đường khác vào Trung Quốc người Tây Ban Nha, đưa vào vùng Combatfami năm 1674 Một người Anh đưa vào Nhật năm 1615 Khoai lang tiếp tục đưa vào Malaysia nước Nam Á, Đông Nam Á Ở Việt Nam, theo nhiều tài liệu để lại “Thực vật thảo”, “Lĩnh nam tạp kỷ” “Quảng Đông tân ngữ“ Lê Quí Đôn khoai lang du nhập vào nước ta từ Philipines vào khoảng cuối đời Minh cai trị nước ta Cây trồng phạm vi rộng vĩ tuyến 40 độ Bắc đến 40 độ Nam lên tới độ cao 2.300 m so với mặt nước biển (Đinh Thế Lộc, 1996) 1.1.2.2 Phân bố Ø Trên giới Ngày nay, khoai lang trồng rộng khắp khu vực nhiệt đới ôn đới ấm với lượng nước đủ để hỗ trợ phát triển Theo số liệu thống kê FAO năm 2004 sản lượng toàn giới 127 triệu Trong phần lớn Trung Quốc với sản lượng khoảng 105 triệu diện tích trồng 49.000 km² Khoảng nửa sản lượng Trung Quốc dùng làm thức ăn cho gia súc gia cầm Sản lượng tính đầu người đạt cao quốc gia mà khoai lang mặt hàng lương thực phần ăn, đứng đầu quần đảo Solomon với 160 kg/người/năm Burundi với 130 kg Bắc Carolina, bang đứng đầu Hoa Kỳ sản xuất khoai lang, cung cấp 40% sản lượng khoai lang hàng năm quốc gia 10 vừa, nhỏ Tím Nhật Tím Thường 60 60 100 2,7 3,5 Thân mảnh, yếu, nhỏ 60 60 100 3,0 3,4 Chồi bậm, màu xanh tím, rộng Có rễ 0,5 60 60 100 4,1 3,5 Chồi bậm, nhiều, phiến rộng Có rễ 1 60 60 100 4,0 3,0 Chồi bậm, ngắn, 1,5 60 60 100 3,4 2,8 Chồi mảnh, rễ nhiều 60 60 100 2,6 2,5 Chồi mảnh, yếu, 60 55 91,6 3,8 3,2 Chồi mảnh, vống, Có rễ 0,5 60 60 100 4,1 3,3 Chồi bậm, vống 1 60 60 100 4,8 3,6 Chồi bậm, vống, màu trắng tím, nhiều lá, có rễ 1,5 60 60 100 4,3 3,4 Chồi mảnh, nhỏ, có vàng, có rễ 60 56 93,3 2,7 3,0 Chồi mảnh, yếu, ít, rễ Khi kết hợp sử dụng Kinetin IAA, hệ sô nhân nhanh, chất lượng chồi có thay đổi khác biệt giống Số liệu bảng 3.6 cho thấy, kết hợp với kinetin hàm lượng IAA môi trường thích hợp cần dùng thấp hơn, giao động từ khoảng 0,5 – mg/l Giai đoạn nhân nhanh này, công thức thích hợp giống khoai Hoàng Long KTB2 mg/l kinetin + mg/l IAA Tuy nhiên, giống lại cho hệ số nhân nhanh khác biệt Trong giống Hoàng Long cho hệ số nhân nhanh 3,0 giống KTB2 cho hệ sô nhân nhanh 5,0, cao hẳn Ở công thức thích hợp, hình thái chồi tốt, chồi khỏe, thân bậm,cao, to bản, xanh đậm Đối với giống Chiêm Dâu, công thức thích hợp cho giai đoạn nhân nhanh môi trường bổ sung mg/l kinetin + 0,5 mg/l IAA Ở công thức cho hệ số nhân chồi 3,2 Chồi khỏe, phiến rộng, màu xanh đậm 59 mg/l kinetin + 0,5 mg/l IAA môi trường phù hợp cho giai đoạn nhân nhanh giống khoai KL5 giống Tím Nhật Hệ số nhân chồi đạt cao, xấp xỉ 4,2 lần Hình thái chồi tốt: Giống KL5 có chồi cao, khỏe, xanh nhạt Giống Tím Nhật có chồi bậm, khỏe, màu tím xanh, rộng Giống khoai Tím thường cần bổ sung hàm lượng IAA cao (1 mg/l kinetin + mg/l IAA) để có hệ số nhân nhanh tốt Đặc điểm hình thái chồi thí nghiệm thường dài, vống hơn, màu trắng tím Hệ số nhân chồi đạt 4,8 cao Có tượng rễ Trong thí nghiệm này, hàm lượng IAA cao (từ 1,5 – mg/l) lại ức chế trình sinh trưởng chồi kéo theo đó, làm cho hệ số nhân chồi giảm đi, chất lượng chồi So sánh thí nghiệm cho thấy: kết hợp với GA3, hàm lượng IAA thích hợp môi trường nhân nhanh với hầu hết giống cao hơn, giao động khoảng 1,5-2 mg/l Trong đó, kết hợp với Kinetin, hàm lượng IAA thích hợp cần hơn, giao động khoảng 0,5 -1 mg/l Mỗi giống khác lại thích hợp với chất điều tiêt sinh trưởng khác Đối với giống Hoàng Long, KTB2, KL5 cho hệ số nhân nhanh cao hẳn thử nghiệm kết hợp GA3 IAA Trong đó, giống Chiêm Dâu, Tím Nhật Tím thường lại thích hợp với môi trường bổ sung Kinetin kết hợp với IAA Số liệu so sánh thể biểu đồ 3.3 Biểu đồ 3.3: Hiệu nhân nhanh thích hợp với cặp hormon sinh trưởng giống khoai lang nghiên cứu 60 61 Hoàng Long KTB2 KL5 Chiêm Dâu Tím Nhật Tím thường Hình 3.7 Hình ảnh giống khoai nghiên cứu môi trường nhân nhanh phù hợp 2.5 Thành phần môi trường rễ thích hợp giống khoai lang nghiên cứu Trong nhân giống in vitro, giai đoạn kích thích rễ chồi tạo ống nghiệm giai đoạn thiếu Rễ có nhiều vai trò đời sống cây: hút nước, khoáng, bám vào giá thể Đối với khoai lang, rễ liên quan đến hình thành củ, phận quan trọng Khi kết thúc giai đoạn nhân chồi, số lượng chồi tạo lớn đưa vào môi trường rễ Qua số công thức thăm dò, môi trường rễ phytohormon có khả tạo rễ cho cây, tỷ lệ rễ cao cần thời gian nhiều IAA hóa chất sử dụng để nghiên cứu khả tạo rễ nghiên cứu này, với nồng độ khác Khoai lang giống dễ rễ nên hàm lượng IAA cần bổ sung thường nhỏ Kết thí nghiệm thể bảng 3.7 62 Bảng 3.7 Hiệu rễ giống khoai lang với hàm lượng IAA khác Giống Hoàng Long KTB2 CT IAA mg/l Sau tuần nuôi cấy Số chồi Số chồi cấy rễ Số rễ Chiều TB/câ dài TB y (cm) Chất lượng rễ 60 60 5,6 4,0 Rế mảnh, ngắn 0,5 60 60 6,2 4,3 Rễ mảnh, lông hút 60 60 7,5 5,0 1,5 60 60 8,5 6,5 60 60 7,5 5,5 60 60 6,0 3,0 Rễ ngăn, mảnh 0,5 60 60 6,5 3,2 Rễ ngắn, lông hút 60 60 7,0 4,3 1,5 60 60 7.0 4,7 Rễ mập, dài, xanh Rễ mập, dài, xanh, nhiều lông hút Rễ mập, nhiều lông hút Rễ mập, nhiều lông hút, trắng Rễ mập, nhiều lông hút Rễ mập, dài, 60 60 7,2 5,5 nhiều lông hút, màu trắng Chiêm Dâu 63 60 60 4,5 2,5 0,5 60 60 5,2 4,5 60 60 5,7 3,5 Rễ mập, ngắn, cứng Rễ mập, nhiều lông hút, màu trắng Rễ mập, ngắn, lông hút, trắng 1,5 60 60 5,0 3,5 60 60 4,1 2,0 Rễ mảnh, ngắn, yếu 60 60 2,2 2,2 Rễ ngắn, cứng 0,5 60 60 2,5 2,2 Rễ ngắn, cứng 60 60 3,5 2,5 1,5 60 60 3,5 2,5 60 60 4,5 2,5 60 60 3,0 5,0 0,5 60 60 4,3 6,8 60 60 4,5 6,5 1,5 60 60 3,7 6,0 60 60 3,5 5,6 Rễ mảnh, yếu 60 60 5,0 2,0 Rễ mảnh, yếu, ngắn 0,5 60 60 6,0 2,2 60 60 7,5 2,5 1,5 60 60 6,5 2,7 KL5 Tím Nhật Tím Thườn g 64 Rễ mảnh, ngắn, lông hút Rễ mập, cứng, lông hút Rễ mập, cứng, nhiều lông hút Rễ to, mập, cứng, nhiều lông hút Rễ mảnh, dài, yếu, xanh Rễ mập, dài, nhiều lông hút, xanh Rễ mập, dài, nhiều lông hút, xanh Rễ mảnh, nhiều lông hút Rễ mảnh, ngắn, nhiều lồn hút Rễ mập, nhiều lông hút, màu nâu Rễ mập, màu nâu, tận hóa đen 60 60 4,7 2,5 Rễ nhỏ dần, yếu, lông hút Kết nghiên cứu bảng 3.7 cho thấy Tất chồi rễ môi trường nghiên cứu sau tuần nuôi cấy, kể công thức đối chứng (không bổ sung IAA) Trên môi trường đối chứng không bổ sung IAA số rễ hơn, chiều dài trung bình rễ ngắn, chất lượng rễ rễ muộn Chiều dài trung bình rễ dao động khoảng từ – cm (sau tuần nuôi cấy) số lượng rễ giao động từ 2,2 – 6,0 rễ/ (sau tuần nuôi cấy) Trong đó, môi trường có bổ sung IAA, cho hiệu cao hơn, chất lượng rễ tốt hơn, rễ dài, nhiều lông hút, khỏe chồi rễ sớm Cụ thể, sau tuần nuôi cấy, chiều dài trung bình rễ giao động khoảng 2,5 – 6,8 cm, số rễ trung bình giao động từ 3,5 – 8,5 rễ/cây Trong công thức nghiên cứu, công thức phù hợp với giống là: - 65 Giống Hoàng Long: Môi trường MS bổ sung 1,5 mg/l IAA Giống KTB2: Môi trường MS bổ sung mg/l IAA Giống Chiêm Dâu: Môi trường MS bổ sung 0,5 mg/l IAA Giống KL5: Môi trường MS bổ sung mg/l IAA Giống Tím Nhật: Môi trường MS bổ sung 0,5- mg/l IAA Giống Tím thường: Môi trường MS bổ sung mg/l IAA 66 Hoàng Long KTB2 KL5 Chiêm Dâu Tím Nhật Tím thường Hình 3.8 Rễ giống khoai lang môi trường rễ phù hợp 2.6 Kết đánh giá bước đầu khả sinh trưởng in vitro trồng giá thể môi trường Giai đoạn thích ứng in vitro điều kiện tự nhiên bước cuối quan trọng Phải biết cách lựa chọn giá thể thích hợp, huấn luyện thích nghi từ môi trường nhân tạo sang môi trường tự nhiên để in vitro không bị sốc, cho tỷ lệ sống cao Trong thí nghiệm này, lựa chọn giá thể cát ẩm, sạch, huấn luyện điều kiện thoáng mát 28-300C, phòng mát với khoảng thời gian tuần Sau cho huấn luyện thích nghi nhà lưới Thời gian theo dõi tuần Kết in vitro huấn luyện thích nghi giá thể vườn thực nghiệm thể bảng 3.8 Bảng 3.8 Khả sống sót mầm in vitro môi trường Trên môi trường giá Giống Số lượng mẫu thể cát ẩm Môi trường Số mẫu Tỷ lệ Số mẫu Tỷ lệ mẫu sống mẫu sống sống sống Hoàng Long 60 51 85,00 45 75,00 KTB2 60 56 93,33 50 83,33 Chiêm Dâu 60 55 91,67 49 81,67 KL5 60 45 75,00 40 66,67 Tím Nhật 60 56 93,33 52 86,67 Tím thường 60 44 73,33 38 63,33 Số liệu từ bảng 3.8 cho thấy, in vitro đưa trồng giá thể vườn thực nghiệm cho tỷ lệ sống cao Tỷ lệ sống thấp giống Tím thường đạt 73,33% môi trường giá thể 63,33% môi trường Tỷ lệ sống cao giống KTB2 giống Tím Nhật đạt 93,33% giá thể xấp xỉ 85% vườn thực nghiệm 67 Tỷ lệ sống in vitro phụ thuộc vào chất lượng chồi, số lượng chất lượng rễ Bằng thực nghiệm cho thấy, giống Hoàng Long, KTB2, Chiêm Dâu, Tím Nhật có chồi to hơn, khỏe hơn, nhiều lá, phiến rộng, rễ nhiều, dài, khỏe, nhiều lông hút cho tỷ lệ sống sót cao Giống KL5 thân cao, nhiều chất lượng rễ kém, giống tím thường vổng cao, yếu, chất lượng rễ nên cho tỷ lệ sống sót thấp Hình 3.9 Huấn luyện thích nghi giá thể sau tuần theo dõi giá thể Hình 3.10 Huấn luyện thíchVÀ nghi môi trường sau KẾT LUẬN ĐỀ NGHỊ I KẾT LUẬN 68 tuần theo dõi vườn ươm Ứng dụng kỹ thuật RT-PCR với cặp mồi đặc hiệu cho phép lựa chọn xác khoai lang bệnh virut đốm lông chim (SPFMV) làm nguồn mẫu nuôi cấy ban đầu cho nhân nhanh in vitro giống khoai lang bệnh virut phục vụ sản xuất Hiệu khử trùng mẫu cấy in vitrro mức độ mẫn cảm với chất điều tiết sinh trưởng khoai lang nghiên cứu phụ thuộc vào kiểu gen giống - Các giống Hoàng Long, Chiêm Dâu, Tím Nhật, Tím thường đạt hiệu khử trùng tốt xử lý khử trùng HgCl 0,1% thời gian 8-10 phút Giống KL5 mẫn cảm hơn, thời gian khử trùng hiệu 6-8 phút Trong đó, thuốc khử trùng Ca(OC)2 10% xử lý 20 phút có hiệu khử trùng tốt cho giống KTB2 - Môi trường MS có bổ sung BAP với hàm lượng từ mg/l cần thiết cho tái sinh chồi trực tiếp giống Hoang Long, Chiêm Dâu, KL5, Tím Nhật, Tím thường, - với giống KTB2 đòi hỏi hàm lượng BAP cao mg/l Kết hợp với GA3 (1mg/l) IAA (1,5 – 2mg/l) mang lại hiệu nhân nhanh cao đa số giống nghiên cứu so với kết hợp kinetin (1mg/l) với IAA (hàm - lượng thích hợp giao động khoảng 0,5–1 mg/l) Cây khoai lang nhân nhanh in vitro bệnh virut đốm lông chim hầu hết giống nghiên cứu (ngoại trừ giống tím thường KL5) có tỷ lệ sống sót cao giai đoạn vườn ươm 3.Ứng dụng kỹ thuật RT-PCR để chọn nguồn mẫu bệnh virut đốm lông chim nhân giống in vitro môi trường thích hợp giải nguồn giống khoai lang bệnh virut cho sản xuất II ĐỀ NGHỊ - Kết hợp ứng dụng kỹ thuật phân tử Rt-PCR để chọn lọc nguồn giống bệnh virut, kết hợp nhân nhanh giống kỹ thuật in vitro để cung cấp nguồn giống khoai lang bệnh virut đốm lông chim cho sản xuất 69 - Tiếp tục theo dõi sinh trưởng phát triển giống có nguồn gốc in vitro đồng ruộng để có kết luận toàn diện hiệu áp dụng kỹ thuật công nghệ sinh học phát triển nghề trồng khoai lang nước ta 70 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Lê Trần Bình (1997) Công nghệ sinh học thực vật cải tiến giống trồng Giáo trình cao học nông nghiệp NXB ĐH Nông nghiệp, Hà Nội, tr 62-79 Phạm Hùng Cương cộng (2010) Nghiên cứu tuyển chọn giống biện pháp kỹ thuật canh tác tổng hợp nhằm phát triển sản xuất khoai lang cho vùng Bắc Trung Bộ Đề tài nghiên cứu viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp Bắc Trung Bộ, tr 13-18 Nguyễn Mạnh Cường, KS Nguyễn Mạnh Chinh (2014) Bệnh virut hại trồng NXB Nông nghiệp, Hà Nội, tr 18-44 Hà Thị Dung (2012) Đa hình RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) cảm ứng tạo củ in vitro số giống khoai môn sọ địa phương (Colocasia esculenta (L.) schott) Luận văn thạc sỹ sinh học, ĐHSP Hà Nội, tr18-27 Nguyễn Như Khanh (1996) Sinh trưởng phát triển thực vật NXB Giáo dục, tr 62 Dương Công Kiên, Lê Lý Thùy Trâm, Hồ bảo Thùy Quyên (2003) Nuôi cấy mô thực vật II, NXB Đại học Quốc gia TP HCM, tr 10,89,97 Phạm Văn Linh, Nguyễn Đức Anh, Trần Thị Quỳnh Nga cộng (2014), Kết nhân nhanh giống khoai lang phương pháp nuôi cấy in vitro, tạp chí khoa học Nghệ An, số 7, tr 1-5 Lê Đình Lương, Quyền Đình Thi (2002) Kỹ thuật di truyền ứng dụng NXB Đại học quốc gia Hà Nội, tr 24-55 Trịnh Xuân Ngọ, Đinh Thế Lộc (2004), Cây có củ kỹ thuật thâm canh Khoai lang, – khoai lang NXB Lao động xã hội, Hà Nội, tr 5- 10 30 Nguyễn Quang Thạch, Nguyễn Thị Lý Anh, Nguyễn Phương Linh (2005) 11 Giáo trình công nghệ sinh học nông nghiệp NXB Nông nghiệp, tr 38-63 Nguyễn Đức Thành(2000) Nuôi cấy mô tế bào thực vật - nghiên cứu ứng 12 dụng NXB Nông nghiệp, tr 22-31, 19-20, 63-61 Nguyễn Sỹ Tuấn, Hứa Mỹ Ngọc (2008), Sự phát sinh phôi vô tính khoai lang (Ipomoea batatas L.) ống nghiệm Tạp chí khoa học số 1, tr 12 71 13 Nguyễn Mỹ Uyên (2007), Khảo sát tăng trưởng in vitro khoai lang Ipompea batatas L điều kiện chiếu sáng tự nhiên Hội nghị khoa học công nghệ 2007, tr 56 Tiếng Anh 14 Chee, R.P., J.R Schultheis, and D.J Cantliffe 1990 Plant recovery sweet potato somatic embryos Hort.sci 25 (7): 795 – 797 15 Hwang L.S., Skirvin, RM., Casayo, J and Bouwkamp, J 1983 advent shoot formation from sections of sweet potato grown in vitro Scientia 20: 119 – 129 16 Liu J R and Cantliffe D J (1984), “Somatic embryogenic and plant regeneration in tissue cultures of sweetpotato (Ipomoea batatas Poir.)” Plant Cell Reports.Vol 3, pp 112-115 17 Murashige T, Skoog F 1962 arevised medium for rapid growth and bioassays with tobaco tissue culture Physiologia Plantarum 18 Otani M., Shimada T., Nizeki H (1987) Mesophyll protoplast culture of sweet potato (Ipomoea batatas L.) Plant Sci 53, 157 – 160 19 Sullivan J N., Asher C J and Blamey F.P (1997), Nutrient disorder of sweetpotato Australian Centre for International Agricultural Research, pp – 15 Websites 19.http://keys.lucidcentral.org/keys/sweetpotato 20.http://www.ndrs.org.uk 22.http://apsjournals.apsnet.org 23.http://www.fao.org.vn Phụ lục Thành phần môi trường Murashige – Skoog, 1962 Nhóm nguyên tố 72 Tên hóa chất Nồng độ (mg/l) môi trường Đa lượng Vi lượng Dung dịch sắt Inositol Vitamine 73 NH4NO3 1650 KNO3 MgSO4 7H2O 1900 370 CaCl2 2H2O KH2PO4 CuSO4 H2O MnSO4 H2O KI COCl2 6H2 O ZnSO4 7H2O H3BO3 Na2M0O4 2H2O FeSO4 7H2O 440 170 0.025 22.3 0.83 0.025 10.6 6.2 0,25 27.85 Na2EDTA 2H2O Myo - inositol Nicotinic acid Glycine Thiamine HCl Pyridoxine HCl 37.25 100 0,5 0,1 0,5