Ứng dụng kỹ thuật RT – PCR sàng lọc giống sạch bệnh và nhân nhanh in vitro một số giống khoai lang sạch bệnh virut đốm lông chim (SPFMV)

1. Lý do chọn đề tài Cây khoai lang được coi là một trong 7 loài cây lương thực quan trọng trên thế giới và xếp quan trọng hàng thứ 5 đối với các nước đang phát triển. Nó được trồng trên hơn 100 quốc gia trên thế giới với chức năng là một nguồn thực phẩm giá trị đối với con người, gia súc cũng như là vật liệu thô cho các ngành công nghiệp chế biến. Cây khoai lang tạo được lượng sinh khối và chất dinh dưỡng lớn nhất trên cùng một đơn vị diện tích khi so sánh với bất cứ loài cây trồng nào. Trong một nghiên cứu tại Nhật Bản, so sánh với 20 loài trái cây và rau quả khác trong việc làm ngăn chặn cũng như làm giảm lượng cholesterol thì khoai lang được xếp đầu bảng. Ngoài ra khoai lang còn mang tính giải độc cao đối với các loại kim loại nặng. Cây khoai lang thích nghi được với nhiều điều kiện sinh thái nông nghiệp khác nhau, nó có thể mọc ở những vùng đất nghèo dinh dưỡng cũng như những vùng đất bị khô hạn. Tại Ai Cập, khoai lang được trồng ở những vùng đất khác nhau với tổng diện tích là 11.200 hecta với năng suất là 30 tấnha. Trong vòng vài ba năm qua nhu cầu xuất khẩu khoai lang tăng lên rất nhiều nhưng Ai Cập chỉ xuất được 6.000 tấn sang châu Âu. Lý do là dịch hại và bệnh đã ngăn cản việc làm cho khoai lang ở Ai Cập không đạt được năng suất tối đa. Trong đó bệnh virus được coi là nguyên nhân chính làm giảm năng suất. Do đó, Viện Nghiên Cứu Kỹ thuật Gen Nông nghiệp Ai Cập (AGERI) đã áp dụng nhiều kỹ thuật nhằm cải tạo giống khoai lang và đã rất thành công. Ở Việt Nam khoai lang là một trong bốn loại lương thực chính sau lúa, ngô, sắn, là cây lương thực quan trọng của một số vùng nước ta, tạo sinh khối lớn trong thời gian ngắn. Khoai lang thuộc giống cây có củ, là đối tượng kinh tế mà người trồng sử dụng và giao lưu kinh tế trên thị trường để có thu nhập và đảm bảo cuộc sống hằng ngày. Một số giống khoai lang cho năng suất cao, phẩm chất tốt được trồng nhiều hiện nay như giống khoai Hoàng Long, KTB1, KTB2, Chiêm Dâu, KL5, Tím Nhật, Tím thường… ViệtNam đượcxếpthứnămvềsảnlượngkhoailangxuấtkhẩu trên toàn thế giới.Tuy nhiên, năngsuấtcònthấpvàbấpbênh, không ổn định, củ nhỏ dosửdụnggiống bịthoáihóa,ítquantâm đến biện pháp canh tác và sâu bệnh. Mặt khác, hầu hết nông dân vẫn chưa tiếp cận và nhận được nguồn giống đảm bảo sạch bệnh. Virut đốm lông chim khoai lang (Sweetpotato feathery mottle virus – SPFMV) thường làm giảm năng suất đáng kể ở các vụ mùa khoai lang trên toàn thế giới. Trên các cánh đồng, sản lượng các cây khoai lang bị nhiễm virus thường giảm từ 20% đến 100% so với nhiều cây trồng không bị nhiễm bệnh. Những cây trồng mẫn cảm hơn với vi rút thường bị thiệt hại đáng kể năng suất so với những cây trồng có khả năng chịu đựng tốt. Các triệu chứng của SPFMV trên tán lá thường nhẹ hoặc không có. Mức độ hiển thị triệu chứng trên phụ thuộc tính mẫn cảm của giống cây trồng, giai đoạn phát triển và mức độc tố của virut. Các triệu chứng trên củ phụ thuộc chủng SPFMV và giống khoai lang. Virus cũng có thể tiềm ẩn trong dây,tồn tại trong hom giống và được lưu truyền do nhiều loài rệp. SPFMV được tìm thấy bất cứ nơi nào khoai lang được trồng. Ngày nay, bằng kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại và phương pháp nhân giống invitro đã tạo nhiều giống sạch bệnh, năng suất cao, phẩm chất tốt. Đặc biệt ứng dụng trên nhiều giống quý cho hiệu quả cao. Mặc dù trên thế giới các phương pháp này đã được ứng dụng khá nhiều tuy nhiên ở Việt Nam còn khá hạn chế. Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi thực hiện đề tài: Ứng dụng kỹ thuật RT – PCR sàng lọc giống sạch bệnh và nhân nhanh in vitro một số giống khoai lang sạch bệnh virut đốm lông chim (SPFMV)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI

VIRUT ĐỐM LÔNG CHIM (SPFMV)

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC SINH HỌC

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Nguyễn Xuân Viết, người đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt quá trình học tập và hoàn thiện đề tài.

Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể cán bộ phòng nuôi cấy mô Viện Khoa học kỹ thuật Nông nghiệp Bắc Trung Bộ, kỹ thuật viên Phùng Văn Hào trung tâm thực hành thí nghiệm trường Đại học Vinh đã tạo điều kiện và tận tình giúp đỡ, chỉ bảo cho tôi về kiến thức, kỹ thuật và kinh nghiệm trong suốt thời gian tôi thực hiện nghiên cứu và hoàn thành luận văn này.

Tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè luôn bên cạnh động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu.

Hà Nội, ngày 12 tháng 10 năm 2014

Học viên

Đặng Minh Hằng

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT VÀ KÍ HIỆU SỬ DỤNG

DANH MỤC HÌNH VẼ VÀ SƠ ĐỒ

DANH MỤC BẢNG

MỤC LỤC

PHẦN I MỞ ĐẦU

1. Lý do chọn đề tài

Cây khoai lang được coi là một trong 7 loài cây lương thực quan trọng trên thếgiới và xếp quan trọng hàng thứ 5 đối với các nước đang phát triển Nó được trồng trênhơn 100 quốc gia trên thế giới với chức năng là một nguồn thực phẩm giá trị đối vớicon người, gia súc cũng như là vật liệu thô cho các ngành công nghiệp chế biến

Cây khoai lang tạo được lượng sinh khối và chất dinh dưỡng lớn nhất trêncùng một đơn vị diện tích khi so sánh với bất cứ loài cây trồng nào Trong mộtnghiên cứu tại Nhật Bản, so sánh với 20 loài trái cây và rau quả khác trong việc làmngăn chặn cũng như làm giảm lượng cholesterol thì khoai lang được xếp đầu bảng.Ngoài ra khoai lang còn mang tính giải độc cao đối với các loại kim loại nặng

Cây khoai lang thích nghi được với nhiều điều kiện sinh thái nông nghiệpkhác nhau, nó có thể mọc ở những vùng đất nghèo dinh dưỡng cũng như nhữngvùng đất bị khô hạn Tại Ai Cập, khoai lang được trồng ở những vùng đất khácnhau với tổng diện tích là 11.200 hecta với năng suất là 30 tấn/ha Trong vòng vài

ba năm qua nhu cầu xuất khẩu khoai lang tăng lên rất nhiều nhưng Ai Cập chỉ xuấtđược 6.000 tấn sang châu Âu Lý do là dịch hại và bệnh đã ngăn cản việc làm chokhoai lang ở Ai Cập không đạt được năng suất tối đa Trong đó bệnh virus được coi

là nguyên nhân chính làm giảm năng suất Do đó, Viện Nghiên Cứu Kỹ thuật GenNông nghiệp Ai Cập (AGERI) đã áp dụng nhiều kỹ thuật nhằm cải tạo giống khoailang và đã rất thành công

Ở Việt Nam khoai lang là một trong bốn loại lương thực chính sau lúa, ngô, sắn,

là cây lương thực quan trọng của một số vùng nước ta, tạo sinh khối lớn trong thời gianngắn Khoai lang thuộc giống cây có củ, là đối tượng kinh tế mà người trồng sử dụng

và giao lưu kinh tế trên thị trường để có thu nhập và đảm bảo cuộc sống hằng ngày.Một số giống khoai lang cho năng suất cao, phẩm chất tốt được trồng nhiều hiện naynhư giống khoai Hoàng Long, KTB1, KTB2, Chiêm Dâu, KL5, Tím Nhật, Tímthường…

Việt Nam được xếp thứ năm về sản lượng khoai lang xuất khẩu trên toàn thế

giới Tuy nhiên, năng suất còn thấp và bấp bênh, không ổn định, củ nhỏ do sử dụnggiống bị thoái hóa, ít quan tâm đến biện pháp canh tác và sâu bệnh Mặt khác, hầuhết nông dân vẫn chưa tiếp cận và nhận được nguồn giống đảm bảo sạch bệnh.

Virut đốm lông chim khoai lang (Sweetpotato feathery mottle virus –

SPFMV) thường làm giảm năng suất đáng kể ở các vụ mùa khoai lang trên toàn thếgiới Trên các cánh đồng, sản lượng các cây khoai lang bị nhiễm virus thường giảm

từ 20% đến 100% so với nhiều cây trồng không bị nhiễm bệnh Những cây trồngmẫn cảm hơn với vi rút thường bị thiệt hại đáng kể năng suất so với những câytrồng có khả năng chịu đựng tốt

Các triệu chứng của SPFMV trên tán lá thường nhẹ hoặc không có Mức độhiển thị triệu chứng trên phụ thuộc tính mẫn cảm của giống cây trồng, giai đoạnphát triển và mức độc tố của virut Các triệu chứng trên củ phụ thuộc chủngSPFMV và giống khoai lang Virus cũng có thể tiềm ẩn trong dây,tồn tại trong homgiống và được lưu truyền do nhiều loài rệp SPFMV được tìm thấy bất cứ nơi nàokhoai lang được trồng

Ngày nay, bằng kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại và phương pháp nhângiống invitro đã tạo nhiều giống sạch bệnh, năng suất cao, phẩm chất tốt Đặc biệtứng dụng trên nhiều giống quý cho hiệu quả cao Mặc dù trên thế giới các phươngpháp này đã được ứng dụng khá nhiều tuy nhiên ở Việt Nam còn khá hạn chế

Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi thực hiện đề tài:

Ứng dụng kỹ thuật RT – PCR sàng lọc giống sạch bệnh và nhân nhanh in vitro một số giống khoai lang sạch bệnh virut đốm lông chim (SPFMV)

2. Mục đích nghiên cứu của đề tài

- Sử dụng kỹ thuật RT-PCR chọn giống sạch virut đốm lông chim (Sweetpotato

feathery mottle virus) làm vật liệu nhân nhanh in vitro.

- Xác định ảnh hưởng của kiểu gen đối với một số thành phần Cytokinin và Auxintrong môi trường nuôi cấy in vitro qua đó xác định được môi trường nhân nhanhthích hợp một số giống khoai lang quý, năng suất cao, phẩm chất tốt phục vụ chosản xuất

3. Nhiệm vụ cụ thể của đề tài

- Nghiên cứu sàng lọc ban đầu và đánh giá hiệu quả sàng lọc của mẫu mô nuôi cấy

tạo vật liệu nhân giống khoai lang.

- Nghiên cứu ảnh hưởng của kiểu gen giống đối với hiệu quả nhân nhanh 6 giốngkhoai lang

- Đánh giá bước đầu triển vọng áp dụng kỹ thuật RT-PCR kết hợp nuôi cấy in vitro tạonguồn giống khoai lang sạch bệnh virut cho sản xuất

4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

- Sử dụng kỹ thuật RT-PCR sàng lọc được các giống khoai lang đảm bảo sạch bệnhvirut đốm lông chim, cung cấp nguồn giống cho sản xuất ở địa phương

- Xác định môi trường nuôi cấy in vitro thích hợp sẽ góp phần phát triển nhanh các

giống khoai lang chất lượng cao phục vụ nông dân những vùng khó khăn và đẩymạnh sản xuất khoai lang hàng hóa trên quy mô lớn

5. Địa điểm và thời gian nghiên cứu

- Địa điểm nghiên cứu

• Viện Khoa học kỹ thuật nông nghiệp Bắc Trung Bộ

• Phòng nuôi cấy mô – Trung tâm thực hành, thí nghiệm - Trường Đại học Vinh

• Vườn thực nghiệm – Khoa sinh học – Trường đại học Vinh

- Thời gian nghiên cứu

Thời gian nghiên cứu từ tháng 01/2014 – 10/ 2014

PHẦN II NỘI DUNG CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1. Giới thiệu chung về cây khoai lang

1.1. Phân loại, nguồn gốc, phân bố và đặc điểm tế bào học

- Chi (genus): Ipomoea

- Loài : Ipomoea Batatas L.

Khoai lang được khám phá bởi Christophe Columbus trong cuộc thám hiểmtìm ra châu Mỹ năm 1492 Ông đã đưa nó vào Tây Ban Nha được gọi là khoai tâyTây Ban Nha hay khoai tây ngọt, mãi sau này mới gọi là khoai lang.

Khoai lang được mở rộng theo hai con đường: Con đường từ Tây Ban Nhavào châu Âu sau đó truyền tới châu Phi, vào Ấn Độ và Tây Ấn Con đường khác dongười Tây Ban Nha mang khoai lang từ vùng Trung Mỹ tới Philippines (Yen, 1982)vào khoảng năm 1521 (Obrien, 1972), sau đó tiếp tục đưa đến châu Phi (Cinklin,1963) Khoai lang được đưa về Trung Quốc từ Philippines và xuất hiện ở Phúc Kiến(Fukien) năm 1594 Con đường khác vào Trung Quốc là do người Tây Ban Nha,đưa vào vùng Combatfami năm 1674 Một người Anh đưa vào Nhật năm 1615.Khoai lang được tiếp tục đưa vào Malaysia và các nước Nam Á, Đông Nam Á

Ở Việt Nam, theo nhiều tài liệu để lại như “Thực vật bản thảo”, “Lĩnh namtạp kỷ” và “Quảng Đông tân ngữ“ của Lê Quí Đôn thì khoai lang được du nhập vàonước ta từ Philipines vào khoảng cuối đời Minh cai trị nước ta Cây được trồngtrong phạm vi rộng giữa vĩ tuyến 40 độ Bắc đến 40 độ Nam và lên tới độ cao 2.300

m so với mặt nước biển (Đinh Thế Lộc, 1996)

1.1.2.2. Phân bố

Ø Trên thế giới

Ngày nay, khoai lang được trồng rộng khắp trong các khu vực nhiệt đới và

ôn đới ấm với lượng nước đủ để hỗ trợ sự phát triển của nó

Theo số liệu thống kê của FAO năm 2004 thì sản lượng toàn thế giới là 127triệu tấn Trong đó phần lớn tại Trung Quốc với sản lượng khoảng 105 triệu tấn vàdiện tích trồng là 49.000 km² Khoảng một nửa sản lượng của Trung Quốc đượcdùng làm thức ăn cho gia súc và gia cầm

Sản lượng tính trên đầu người đạt cao nhất tại các quốc gia mà khoai lang làmặt hàng lương thực chính trong khẩu phần ăn, đứng đầu là quần đảo Solomon với

160 kg/người/năm và Burundi với 130 kg

Bắc Carolina, bang đứng đầu Hoa Kỳ về sản xuất khoai lang, hiện nay cungcấp 40% sản lượng khoai lang hàng năm của quốc gia này

Ø Trong nước

Ở nước ta, khoai lang là loại cây lương thực được trồng lâu đời và xếp saulúa và ngô Khoai lang được trồng nhiều từ Bắc chí Nam, đặc biệt là đồng bằng venbiển Đây là một trong những loại cây có củ quan trọng, có khả năng thích ứngmạnh, tương đối ít sâu bệnh, trồng được trên nhiều loại đất khác nhau: nặng, nhẹ,đất thịt, đất cát Khoai lang lại có thể trồng được nhiều vụ trong năm, dễ trồng, chonăng suất cao, tương đối ổn định Khoai lang được trồng khắp nơi, đặc biệt ở miềnTrung, Trung du phía Bắc, Đồng bằng Sông Hồng, Đồng bằng Sông Cửu Long,

Về nguồn gen thu thập và nhập nội, chương trình cây có củ quốc gia đã nhậpnội và tổ chức sưu tập nguồn gen trong cả nước trong đó có Trường Đại học NôngLâm Tp Hồ Chí Minh tham gia Các nguồn gen này hiện được lưu trữ tại Trungtâm Cây có củ thuộc Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam và Trung tâm Nghiêncứu Nông nghiệp Hưng Lộc, Viện Khoa học Nông nghiệp miền Nam gồm nhiềumẫu giống và dòng lai

Kết quả chọn tạo giống khoai lang từ 1991-1995 của Trung tâm Nghiên cứuNông nghiệp Hưng Lộc và Trường Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh đã tuyểnchọn được 36 dòng triển vọng có năng suất củ tươi cao và phẩm chất củ ngon; giớithiệu được các giống khoai lang tốt như: K4, TN66, HL-4, NC1525, HL-419, HL-

518 Năm 1993-1994, các giống K4, HL-4, TN66 đã được Bộ Nông nghiệp vàPTNT công nhận (Hoàng Kim, Nguyễn Thị Sâm, Nguyễn Đức Tuyến, Trương Văn

Rễ khoai lang chia làm ba loại: rễ con, rễ đực và rễ củ

ØThân

Thân khoai lang có dạng bò hay nửa đứng Thân phổ biến màu xanh, tím vàxanh tím Thân có nhiều đốt với chiều dài lóng khác nhau Ở mắt đốt mọc ra rễ phụ.

Độ dài đốt phụ thuộc vào giống Căn cứ vào độ dài thân chính người ta chia làm hailoại: Loại thân dài khoảng 2- 5 m , loại thân ngắn: 0,5 -1 m Thân phát triển dài ngắnngoài yếu tố chính là giống còn phụ thuộc nhiều vào chế độ mưa, loại đất và phân bón

ØLá

Lá khoai lang là lá đơn, mọc cách, mỗi mắt một lá gồm cuống lá và phiến lá.Cuống lá dài 6 - 20 cm, có lợi cho việc sử dụng ánh sáng, giúp lá vươn lên khoảngkhông gian và có thể điều chỉnh mắt lá xoay chếch theo chiều ánh sáng để lá sửdụng ánh sáng được tối đa, khắc phục nhược điểm thân nằm bò dưới mặt đất.Những giống nhiều nhánh và cuống lá to, dài sẽ có năng suất chất xanh cao Màusắc cuống lá do giống qui định Đa số các giống khoai lang có cuống lá màu xanh,một số khác có cuống màu tím nhạt, tím

ØHoa

Hoa khoai lang mọc ở nách lá hoặc ngọn thân, hoa hình chuông có cuốngdài Hoa mọc thành chùm hay riêng rẽ Tràng hoa hình phễu màu hồng tím hay phớthồng, bên trong nó có nhiều lông tơ và tuyến mật hấp dẫn côn trùng Một hoa gồm

5 nhị đực và nhụy cái, nhị đực thấp hơn nhụy cái

ØQuả và hạt

Quả khoai lang thuộc loại quả sóc hình tròn màu nâu đen, sau thụ phấn mộtđến hai tháng thì quả chín và còn tùy thuộc giống và mùa vụ Một quả có từ 1 đến 4hạt, hạt có vỏ cứng, hạt dễ bị rụng khi quả chín

1.2.2. Sinh trưởng và phát triển

Khoai lang có bốn thời kỳ sinh trưởng và phát triển: Mọc mầm và ra rễ; Phâncành và tạo củ; Tăng trưởng thân lá; Phát triển của củ

ØThời kỳ ra rễ và chồi xanh

Ra rễ và mọc mầm cần 15 - 25 ngày, phụ thuộc vào chất lượng dây giống vàđiều kiện sinh thái của các vùng khác nhau

ØThời kỳ phân cành và hình thành củ

Từ khi trồng đến khi hoàn thành giai đoạn này khoảng 40 - 50 ngày Cácnhánh trên thân bắt đầu phát triển và bò trải dần trên mặt luống Củ hình thànhkhoảng 1,0 - 1,5 tháng sau khi trồng tùy thuộc giống và điều kiện môi trường Đây

là thời kỳ quyết định số củ trên cây; trong rễ củ bắt đầu có sự hoạt động của các bómạch gỗ, hình thành các loại tượng tầng sơ cấp và tượng tầng thứ cấp để tạo củ

ØThời kỳ phát triển thân lá

Thời gian từ lúc trồng đến hoàn thành thời kỳ phát triển thân lá khoảng 75

-85 ngày Ở thời kỳ này thân lá phát triển với tốc độ nhanh nhất, bò lan phủ kín mặt

và rãnh luống Sự hình thành thêm rễ củ mới là không đáng kể Nhưng những củ đãđược hình thành phát triển theo chiều dài nhanh chóng Một số củ hình thành sớmbắt đầu quá trình tích lũy chất khô

ØThời kỳ phát triển củ

Từ khi trồng đến khi hoàn thành giai đoan này khoảng 90 - 105 ngày đối vớicác giống khoai lang hiện trồng phổ biến ở Việt Nam Điều kiện thuận lợi cho quá trìnhphình to của củ là có sự chênh lệch nhiệt độ ngày và đêm lớn (ban ngày nắng ấm, banđêm hơi se lạnh); nên chênh lệch nhiệt độ ngày và đêm càng lớn trong giai đoạn cuốithì năng suất củ khoai lang càng cao Đặc điểm của thời kỳ này là củ lớn nhanh trongkhi sinh trưởng thân lá giảm từ từ rồi ngừng hẳn, lá gốc già vàng và rụng dần

1.2.3. Điều kiện sinh thái

Cây khoai lang là cây màu dễ trồng, đòi hỏi thâm canh và đầu tư không cao,

dễ sử dụng và có phổ thích nghi rộng nên được gọi là cây lương thực của ngườinghèo Khoai lang có yêu cầu điều kiện sinh thái như sau:

Ø Nhiệt độ:

Nhiệt độ thích hợp trong quá trình sinh trưởng từ 15 - 300C Nhiệt độ dưới

100C cây khoai lang ngừng sinh trưởng, dưới 60C có thể chết héo

Khi trồng, gặp nhiệt độ 18 - 200C khoai lang bén rễ nhanh Trong suốt quátrình sinh trưởng, nhiệt độ ban ngày 20 - 350C khoai đồng hoá tốt Thời kỳ pháttriển củ, ban ngày trời nắng ráo, ban đêm trời mát lạnh củ phát triển nhiều, to vànhiều tinh bột

và lân Kali cần nhiều từ khi bắt đầu làm củ Đạm cần nhiều trong thời kỳ phát triểnthân, lá Lân thúc đẩy hình thành tinh bột của củ.

1.2.4. Kỹ thuật trồng và chăm sóc khoai lang

Phần lớn các giống khoai lang nổi tiếng, có chất lượng hiện nay là các giốngkhoai lang cổ truyền ở các vùng, miền Giống khoai này là thời gian sinh trưởng dài(khoảng 4,5 - 5 tháng), năng suất không cao như khoai Nghệ Dựa theo thời giansinh trưởng, các giống khoai lang được phân ra như sau:

Ø Giống ngắn ngày:

Thời gian sinh trưởng 75 - 80 ngày như: Khoai Hồng Quảng, Bất LuậnXuân năng suất cao nhưng hàm lượng nước nhiều, tỷ lệ tinh bột thấp, phẩm chấtkém

Ø Giống trung ngày:

Thời gian sinh trưởng 100 - 110 ngày có các giống khoai 3 tháng ở Đồngbằng sông Cửu Long, khoai Chiêm Dâu ở các tỉnh miền Trung, khoai Yên Thuỷ -Hoàng Long (nhập nội từ Hồ Nam - Trung Quốc), và một số giống khoai mới như:K51, VT1, H-1-2, KL5, KB-1, VĐ1, KB4

Ø Giống dài ngày:

Thời gian sinh trưởng trên 120 ngày như: Khoai Lim, Khoai Thuyền, KhoaiNghệ, Khoai ruột tím

Ở một số nơi đã đưa vào sử dụng một số giống mới như: VĐ1 (Đồng bằngsông Hồng), KTB1 (Bắc Trung Bộ), H-1-2, TV1, TB1, KTB2, K15, K51, P1, DT2,VA5, VA6, J1, DJF, Elina Kuma… (Quảng Trị, thừa Thiên Huế)

Ø Thời vụ trồng khoai lang

Khoai lang có thể trồng được quanh năm, trừ các tỉnh từ Bắc Trung Bộ trở raphải tránh trồng trong các tháng mùa đông lạnh

- Cày bừa đất kỹ, sạch cỏ dại và trang cho mặt ruộng bằng phẳng

- Lên luống rộng 0,9 - 1,1m, cao 35 - 40cm, rãnh luống rộng 30cm

- Rạch hàng dọc luống sâu 10 - 15cm để bỏ phân lót chuẩn bị cho đặt dây

Ø Phân bón

Tuỳ theo giống, thời vụ, đất đai và điều kiện thâm canh có thể bón theo các mức:

- Mức thâm canh trung bình: 10 tấn phân chuồng + 250kg super lân + 130kgurê + 120kg clorua kali/ ha

- Mức thâm canh cao: 15 tấn phân chuồng + 400kg super lân + 250kg urê +200kg clorua kali/ha

- Bón lót theo rạch trên luống: toàn bộ phân chuồng + toàn bộ phân lân + 1/3lượng phân đạm + 1/3 lượng phân kali

- Bón thúc sau khi trồng 30 - 40 ngày, dùng cày hoặc cuốc xả luống bón 2/3lượng phân đạm + 2/3 lượng phân kali kết hợp bón tro bếp, sau đó vun lại vồng khoai

Ø Đặt dây

- Dây giống dùng đoạn 1 và đoạn 2 (dây bánh tẻ) Mỗi dây dài khoảng 25cm

Số lượng dây cho 1 ha khoảng 33 000 - 42 000 dây

Đặt dây nông, nuối đuôi nhau dọc theo rạch hàng giữa luống hoặc có nơi đặtdây kiểu áp tường hoặc đặt dây cong Dùng tay lấp đất và ấn nhẹ (đất cát, đất thịtnhẹ lấp sâu 5 - 7cm Đất thịt nặng lấp sâu 4 - 5cm).

Ø Chăm sóc

- Sau khi trồng 30 - 40 ngày, xới xáo, cày (hoặc cuốc) xả hông luống

- Bón thúc sớm kết hợp cày xả hông luống Sau đó lấp kỹ và vun vồng caotạo điều kiện để củ phát triển

- Nhấc dây, vén dây: Thân lá phát triển thường có nhiều rễ phụ (nông dân gọi

là rễ đực) bám trên mặt luống làm tiêu hao dinh dưỡng Do vậy, sau trồng, 45 - 50ngày phải nhấc dây để đứt dễ phụ và vén dây gọn trên mặt luống nhằm tập trungdinh dưỡng cho khoai phình củ

- Trong điều kiện gặp hạn, đặc biệt là vụ Thu - Đông, Đông Xuân cần cóbiện pháp tưới ẩm thích hợp để kích thích quá trình phình to củ Tưới ngập 2/3luống khoai, khi đã ngấm vào giữa luống cần phải tháo nước ngay, không để đấtquá sũng nước

Ø Thu hoạch, bảo quản

- Nếu các vụ khoai cần phải cắt dây để chăn nuôi thì nên cắt sau khi thân lá

đã phủ luống Chỉ cắt tỉa những nhánh dây ra trước và mặt sát mặt đất, không tỉadây chính Mỗi gốc khoai lang chỉ tỉa 1 - 2 dây nhánh

- Sau khi trồng 75 - 80 ngày đã có thể thu hoạch sớm (vụ Thu Đông khoảng

85 - 90 ngày) Nếu để quá thời gian thu hoạch thì củ sẽ bị già, dễ nẩy mầm trên củ

- Dùng cát hoặc tro bếp rải đều, sau đó xếp củ (chú ý đừng để thành đốngcao) Sau đó phủ lá xoan lên bên trên lớp củ để phòng bọ hà và bệnh thối đen pháhại củ trong thời gian bảo quản

1.3. Thành phần dinh dưỡng, giá trị kinh tế và sử dụng của khoai lang

1.3.1. Thành phần dinh dưỡng của khoai lang

Trong củ khoai lang bao gồm một lượng lớn tinh bột, các acid amin, betacarotene, vitamin C, B1 và hơn 10 loại nguyên tố vi lượng cần thiết cho sức khỏecon người như canxi, phospho, kẽm, sắt,magie, natri, kali,… Vì vậy, các chuyên giadinh dưỡng đã gọi khoai lang là loại “thực phẩm cân bằng dinh dưỡng nhất”.

Về dinh dưỡng, khoai lang được xem là loại thực phẩm rất tốt cho việc đa dạngchất bột đường trong khẩu phần ăn hàng ngày Khi so sánh, người ta cũng thấy khoailang cung cấp một lượng năng lượng tương đương với cơm hay khoai tây Việc ăn bổsung khoai lang cũng là một cách bổ sung thêm bột đường và năng lượng

Ngoài ra, củ và rau khoai lang có còn những giá trị chữa bệnh nên từ lâu trongdân gian có nơi còn gọi khoai lang là " Sâm nam" Khoai lang có khả năng kích thíchtiêu hóa, trị táo bón, chống viêm nhiễm, phòng chống cảm cúm, giải cảm sốt, cân bằnglượng đường trong máu, phòng ngừa bệnh viêm khớp, chữa viêm tuyến vú

1.3.2. Sử dụng củ khoai lang

Củ khoai lang được luộc, nướng, chiên, phơi làm khoai deo… rất được ưathích Khoai lang được sử dụng rất phổ biến trong đời sống hằng ngày và được sửdụng nhiều trong công nghiệp chế biến thực phẩm như sản xuất bột dinh dưỡng chotrẻ em, bột nấu súp, khoai chiên, đồ ăn chay… Các phế phẩm của khoai lang sau khithu hoạch được sử dụng làm thức ăn chăn nuôi

2. PCR và ứng dụng kỹ thuật PCR trong nghiên cứu di truyền học.

2.1 PCR 2.1.1 Định nghĩa

Phương pháp PCR (polymerase chain reaction) là phương pháp khuếch đạinhanh nhiều bản sao các đoạn DNA mà không qua tạo dòng Phương pháp nàyđược Kary Mullis đưa ra năm 1985 và Saiki hoàn thiện năm 1988 Phương phápPCR được thực hiện hoàn toàn trong các eppendoff và trong thời gian ngắn ta có thểthu nhận rất nhiều bản sao DNA Kỹ thuật PCR có thể được ứng dụng trong nhiềulĩnh vực: chẩn đoán, xét nghiệm các tác nhân vi sinh vật gây bệnh, xác định giới

tính của phôi, giải mã di truyền, tạo giống mới với các đột biến định hướng, nghiêncứu sự tiến hoá của sinh vật ở mức độ phân tử

2.1.2. Nguyên tắc của kỹ thuật PCR

Kỹ thuật PCR (polymerase chain reaction) là một phương pháp tổng hợpDNA dựa trên mạch khuôn là một trình tự đích ADN ban đầu, khuếch đại, nhân sốlượng bản sao của khuôn này thành hàng triệu bản sao nhờ hoạt động của enzymepolymerase và một cặp mồi (primer) đặc hiệu cho đoạn ADN này

Primer là những đoạn ADN ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một mạch củađoạn DNA khuôn và nhờ hoạt động của ADN polymerase đoạn primer này được kéo dài

để hình thành mạch mới Kỹ thuật PCR được hình thành dựa trên đặc tính này của ADNpolymerase, đoạn ADN nằm giữa hai primer sẽ được khuếch đại thành số lượng lớn bảnsao đến mức có thể thấy được sau khi nhuộm bằng ethidium bromide và có thể thu nhậnđoạn ADN này cho các mục đích khác nhau bằng các thao tác trên gel Như vậy, đểkhuếch đại một trình tự ADN xác định, cần phải có những thông tin tối thiểu về trình tựcủa ADN, đặc biệt là trình tự nucleotit ở hai đầu đoạn ADN đủ để tạo các primer bổsung chuyên biệt (trích dẫn bởi Hồ Huỳnh Thuỳ Dương, 2003)

Phản ứng PCR gồm nhiều chu kỳ lăp lại nối tiếp nhau Mỗi chu kỳ gồm 3bước như sau :

- Bước 1: (Biến tính tách đôi sợi ADN, denaturation)

Giai đoạn này được thực hiện ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ nóng chảy củaphân tử (94 – 950C) trong vòng 30 giây đến 1 phút, làm cho phân tử ADN mạch képtách thành 2 mạch đơn Chính 2 mạch đơn này đóng vai trò là mạch khuôn cho sựtổng hợp 2 mạch bổ sung mới

- Bước 3: (kéo dài, elongation – extension)

Nhiệt độ được tăng lên 720C giúp cho ADN polymerase hoạt động tốt nhất.Dưới tác động của ADN polymerase, các nucleotide lần lượt gắn vào primer theonguyên tắc bổ sung với mạch khuôn Thời gian của giai đoạn này tùy thuộc vào độdài của trình tự ADN khuếch đại, thường kéo dài từ 30 giây đến vài phút Sựkhuếch đại này có thể được tính như sau:

Tổng lượng ADN khuếch đại = m x 2n

m: Là số bản sao của chuỗi mã hóa

Ø Enzyme

Taq polymerase chịu nhiệt được tách chiết từ vi khuẩn sống ở các suối nướcnóng Thermus aquaticus Enzyme này không bị phá vỡ ở nhiệt độ biến tính Ngàynay, nhiều polymerase chịu nhiệt khác được đưa ra thị trường với nhiều chức năngchuyên biệt và hoàn thiện hơn

Ø Primer và nhiệt độ lai

Primer là chìa khóa quan trọng cho sự thành công hay thất bại của một thínghiệm PCR Nếu primer được thiết kế một cách chính xác thì thí nghiệm sẽ manglại kết quả về sự khuếch đại của một mảnh ADN đơn Việc lựa chọn primer cầntuân thủ theo một số nguyên tắc sau:

- Độ dài của đoạn mồi khoảng từ 17-30 Nu Các đoạn mồi không nên chứahơn 3 Nu giống nhau xếp liên tiếp

- Tỷ lệ GC lý tưởng trong đoạn mồi vào khoảng 50% để nhiệt độ bắt cặp củađoạn mồi là không quá thấp.

- Hai đoạn mồi không được có trình tự Nu bổ sung lẫn nhau

- Nhiệt độ lúc bắt đầu phản ứng, nghĩa là lúc đã cho enzyme tổng hợp ADNvào, không nên thấp hơn nhiệt độ bắt cặp cặp của đoạn mồi

- Nhiệt độ nóng chảy của 2 mồi không nên cách nhau quá xa, vì nếu sựchênh lệch nhiệt độ lớn thì primer có Tm cao hơn sẽ bắt cặp không đặc hiệu, cònprimer có Tm thấp hơn sẽ không thể lai được với ADN

- Đoạn gene cần khuếch đại không nên lớn hơn 3kb và chiều dài lý tưởng lànhỏ hơn 1kb

- Vị trí đầu 3’ của primer rất quan trọng trong việc kiểm soát hiện tượng

“mismatch” – bắt cặp không đặc hiệu Cần tránh trình tự A hay T ở đầu 3’, mà Các

kỹ thuật PCR và ứng dụng 6 thay vào đó là G hoặc C vì mối liên kết hydro giữa G –

C mạnh hơn A – T sẽ bảo đảm cho sự bắt cặp đặc hiệu

Ø Các thành phần khác

+ Nồng độ dNTP (deoxynucleotide triphotphat)

Nồng độ dNTP thường được sử dụng là 20 – 200 μM Nồng độ cao hơn dễdẫn đến sự khuếch đại “ký sinh" Bên cạnh đó, sự cân bằng trong thành phần cácdNTP cũng ảnh hưởng đến phản ứng PCR Sự mất cân bằng trong thành phần cácdNTP sẽ làm tăng các lỗi sao chép của ADN polymerase

+ Nồng độ MgCl2

Nồng độ MgCl2 cũng là một nhân tố ảnh hưởng mạnh đến phản ứng PCR

Mg2+ rất cần cho quá trình liên kết các dNTP, xúc tác cho enzyme Taq polymerase,làm tăng Tm của DNA mạch kép Mg2+ là Co – factor của Taq polymerase nên nếulượng Mg2+ quá thấp thì Taq polymerase sẽ không thể hoạt động bình thường tronggiai đoạn kéo dài (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 1999), hạn chế quá trình kéodài Ngược lại nồng độ Mg2+ cao sẽ giúp ổn định dây đôi ADN và ngăn ngừa sựbiến tính hoàn toàn (do sự mở dây đôi ) của sản phẩm trong mỗi chu kỳ, làm chosản phẩm PCR ít đi; đồng thời, có thể làm cho hiện tượng bắt cặp giả xảy ra ổn định

hơn và cho ra những sản phẩm mong muốn với số lượng quá lớn nhưng mức độchuyên biệt thấp.

+ Dung dịch đệm

Một nồng độ cao của dung dịch đệm PCR được sử dụng để tăng cường hiệuquả cho phản ứng PCR Sau đây là dung dịch đệm PCR được xem là tốt hơn đối vớicác đệm đang có mặt trên thị trường

- 16,6 mM ammoniumsulfate

- 67,7 mM TRIS – HCl, pH 8,89

- 10 mM beta – mercaptoethanol

- 170 microgams/ml BSA - 1,5 – 3 mM MgCl2

+ Số lượng chu kỳ của phản ứng PCR

Trong thực tế số chu kỳ cho một phản ứng PCR không nên vượt quá 40 Sở

dĩ như vậy vì phản ứng PCR diễn tiến qua hai giai đoạn :

- Giai đoạn đầu: Số lượng bản sao tăng lên theo cấp số nhân, tỉ lệ với lượngmẫu ban đầu

- Giai đoạn sau: Hiệu quả khuếch đại giảm hẳn do sự phân hủy và cạn kiệtcác thành phần của phản ứng, sự xuất hiện các sản phẩm phụ ức chế phản ứng, hoặccác bản sao vừa được tổng hợp không kết hợp với mồi mà bắt cặp với nhau

Số chu kỳ cho một phản ứng PCR tùy thuộc số lượng mẫu DNA ban đầu.Nếu số lượng mẫu ban đầu là 105 thì cần 25 – 30 chu kỳ Nếu số lượng mẫu banđầu là 102 – 103 thì số chu kỳ phải là 35 – 40 chu kỳ

Ø Ứng dụng của PCR

Hiện nay thành tựu của PCR mở ra nhiều triển vọng cho sinh học phân tử vớinhiều ứng dụng trong sinh học, y khoa, nông nghiệp, kiểm nghiệm vi sinh vật gâybệnh: thực phẩm, bệnh phẩm, mỹ phẩm, nước, phát hiện pháp y

Trong nghiên cứu genome học

Nhân bản vô tính với PCR

Phát hiện các khiếm khuyết gene

2.2.1 Khái niệm

RT-PCR (Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction) là một phươngpháp dùng để khuyếch đại cADN được tạo ra từ ARN dựa vào đặc tính phiên mãngược RT-PCR thường được sử dụng để tạo ra thư viện cADN (complementaryADN) lớn từ một lượng rất nhỏ mARN, sử dụng trong việc nhận biết các đột biến

và đa hình dựa vào những trình tự phiên mã ngược và sử dụng trong việc địnhlượng mức độ phân tử của gene Ngoài ra, RT- PCR còn có một ứng dụng quantrọng nữa đó là chúng được sử dụng trong việc chẩn đoán các bệnh do virus ARN

2.2.2 Nguyên tắc

Trong kỹ thuật RT-PCR có sự tham gia của 2 loại enzyme tổng hợp chuỗioligonucleotide: enzyme phiên mã ngược ( reverse transcriptase) và ADNpolymerase Enzyme reverse transcriptase cần cho quá trình tổng hợp sợi cADN từARN và enzyme cần cho sự tổng hợp sợi ADN từ cDNA Do enzyme reverse Các

kỹ thuật PCR và ứng dụng 10 transcriptase chịu nhiệt kém nên quá trình phiên mãngược để tạo ra cADN phải được thực hiện ở nhiệt độ thấp (thường khoảng từ 42-450C) Điều này gây ra những trở ngại:

- Sự tạo thành các sản phẩm khuếch không mong muốn do sự bắt cặp khôngđặc hiệu của các primers

- Giảm hiệu quả kéo dài chuỗi gen do sự hình thành ARN cấu trúc bậc hai

2.2.3 Phương pháp tạo RT- PCR gồm 5 bước khác nhau:

- Tách chiết ARN từ bệnh phẩm biểu mô

- Tạo ADN bằng phản ứng sao chép ngược

- Gây phản ứng bằng PCR với các cặp mồi

- Kiểm tra sản phẩm

- Tách dòng và giải trình trình tự sản phẩm

RT- PCR cho độ chính xác cao 2.3. Ứng dụng công nghệ sinh học phân tử trong các nghiên cứu tinh sạch virut

trên cây khoai lang

Năm 1975, Alconero và ctv đã kết hợp phương pháp nuôi cấy đỉnh sinhtrưởng và xử lý nhiệt để loại trừ virus cây khoai lang Đỉnh sinh trưởng có kíchthước từ 0,4 -0,8 mm được cấy trên môi trường MS, bổ sung kinetin và auxin

(NAA, IAA) Sau thời gian 20 - 50 ngày, đỉnh sinh trưởng hình thành mô sẹo.Trong số cây con được test virus thì có 47% không nhiễm bệnh.

Mervat và ctv (2009), nghiên cứu loại trừ virus đốm gợn sóng khoai lang(SPFMV) Các mẫu ngoài đồng ruộng được kiểm tra hiện diện virus bằng phươngpháp dot- ELISA Những cây khoai lang bị nhiễm virus được xử lý nhiệt ở nhiệt độ

420C/ ngày (16giờ chiếu sáng) và 390C/ đêm (8giờ bóng tối) trong thời gian 3 tuầntrước khi tách đỉnh sinh trưởng Những cây hình thành từ nuôi cấy đỉnh sinh trưởngtiếp tục kiểm tra virus bằng dot-ELISA Kết quả nghiên cứu cho thấy không có câynào bị nhiễm

Hiện nay, trên lĩnh công nghệ sinh học, cây khoai lang chưa được nghiên cứunhiều ở nước ta

Năm 2013, Phạm Văn Linh, Nguyễn Đức Anh, Trần Thị Quỳnh Nga và cs(Viện khoa học kỹ thuật nông nghiệp Bắc Trung Bộ) nghiên cứu kết quả nhân nhanhgiống khoai lang bằng phương pháp nuôi cấy in vitro Trong đó, có giai đoạn kiểm travirut đốm lông chim bằng công nghệ RT-PCR Kết quả cho thấy sau khi sử dụng công

nghệ RT-PCR chọn giống sạch bệnh để vào mẫu, những cây con in vitro tiếp tục được

kiểm tra bằng RT-PCR Kết quả cho thấy không có cây nào bị nhiễm bệnh

3. Công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật và ứng dụng trông nhân giống cây trồng

3.1 Khái niệm nuôi cấy mô thực vật

3.1.1. Khái niệm

Kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật hay nhân giống in vitro đều là thuật

ngữ mô tả các phương pháp nuôi cấy các bộ phận thực vật (tế bào đơn, mô, cơquan) trong ống nghiệm có chứa môi trường dinh dưỡng thích hợp như muốikhoáng, vitamin, đường và các chất điều hòa sinh trưởng thực vật trong điều kiện

vô trùng (Bùi Văn Thế Vinh, 2009)

Khi có môi trường dinh dưỡng thích hợp, mô tế bào thực vật có thể sống, quanhiều lần phân bào liên tiếp, biệt hóa thành mô, cơ quan, mô tế bào, có thể pháttriển thành cây hoàn chỉnh

Nuôi cây mô, tế bào thực vật còn gọi là nuôi cấy thực vật in vitro (trong ống

nghiệm) để phân biệt với quá trình nuôi cấy trong điều kiện tự nhiên ngoài ống

nghiệm, gọi là nuôi cấy in vitro

3.1.2. Khả năng nuôi cấy mô thực vật vào công tác giống cây trồng

Phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật có ý nghĩa quan trọng đối vớinghiên cứu lý luận sinh học cơ bản, đồng thời nó có giá trị đóng góp trực tiếp chothực tiễn sản xuất và đời sống

Phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật được ứng dụng trong một sốlĩnh vực như:

ü Lai tạo giữa những loài xa nhau về di truyền bằng phương pháp dung hợp( nuôi cấy tế bào trần )

ü Nuôi cấy tế bào thực vật trong môi trường lỏng ( nuôi cấy huyền phù tếbào) trên quy mô lớn để sản xuất các hợp chất thứ cấp như alkaloid, glucoside, cácsteroid (dùng trong y học), chất dính dùng trong công nghệp thực phẩm, những chấtkìm hãm sự sinh trưởng của vi khuẩn dùng trong nông nghiệp

ü Chọn lọc tế bào có những đặc tính mong muốn, cho phát triển thành câycon thay vì chọn lọc cây ngoài đồng ruộng (nuôi cấy tế bào đơn)

üSản xuất dòng cây đồng hợp tử (nuôi cấy bao phấn và túi phấn)

ü Vi nhân giống những giống cây có giá trị khoa học và thương mại

ü Bảo quản phôi và cơ quan trong điều kiện nhiệt độ thấp

ü Nuôi cấy phôi sinh dưỡng, phôi hợp tử

ü Nuôi cấy quang tự dưỡng

3.2. Cơ sở khoa học của kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật

3.2.1. Tính toàn năng của tế bào thực vật

Haberlandt (1902) lần đầu tiên quan niệm rằng, mỗi tế bào bất kỳ của một cơthể sinh vật đa bào đều có khả năng tiềm tang để có thể phát triển thành một cá thểhoàn chỉnh

Theo quan niệm của sinh học hiện đại thì mỗi tế bào riêng rẽ đã phân hóa đềumang toàn bộ lượng thông tin di truyền cần thiết và đủ của cả cơ thể sinh vật đó Bất cứ

tế bào nào hoặc mô nào đều chứa hệ gen quy định kiểu gen của loài đó Chúng đều cókhả năng sinh sản vô tính để tạo cây hoàn chỉnh nếu gặp điều kiện thích hợp.

Tính toàn năng do Haberlandt đưa ra chính là cơ sở lý luận của phương phápnuôi cấy mô, tế bào thực vật Cho đến nay con người đã hoàn toàn chứng minhđược khả năng tái sinh một cơ thể thực vật hoàn chỉnh từ một tế bào riêng rẽ

3.2.2. Sự phân hóa và phản phân hóa của tế bào thực vật.

Sự phân hóa của tế bào thực vật là sự chuyển các tế bào phôi thành các tế

bào mô chuyên hóa, đảm nhận các chức năng khác nhau

Cơ thể thực vật trưởng thành là một chỉnh thể thống nhất bao gồm nhiều cơquan, chức năng khác nhau, được hình thành từ nhiều loại tế bào khác nhau Tuynhiên, tất cả các loại tế bào đó đều bắt nguồn từ một tế bào đầu tiên (tế bào hợp tử)

Ở giai đoạn đầu, hợp tử bắt đầu phân chia hình thành nhiều tế bào phôi sinh chưamang chức năng đặc biệt (chuyên hóa) Sau đó từ các tế bào phôi sinh này ,tiếp tụcđược biến đổi thành các tế bào chuyên hóa đặc biệt cho các mô, cơ quan có chứcnăng khác nhau

Sự phản phân hóa của tế bào thực vật.

Khi tế bào đã phân hóa thành các mô, cơ quan có chức năng chuyên biệt,chúng có bị mất khả năng biến đổi của mình không? Khi tế bào đã phân hóa thànhcác tế bào có chức năng chuyên biệt chúng không hoàn toàn mất khả năng biến đổicủa mình Trong trường hợp cần thiết, ở điều kiện thích hợp chúng lại có khả năngtrở về dạng tế bào phôi sinh và phân chia mạnh mẽ Quá trình đó gọi là phản phânhóa tế bào, ngược lại với sự phân hóa tế bào Như vậy, quá trình phân hóa và phảnphân hóa tế bào có thể tóm tắt theo sơ đồ sau:

Sơ đồ 1.1 Phân hóa và phản phân hóa tế bào

Phân hóa TB

Các TB chuyênhóaCác TB dãn

Các tế bàophôi sinhHợp tử

Phản phân hóa TB

Về bản chất, sự phân hóa và phản phân hóa là một quá trình hoạt hóa, ức chếcác gen Tại một thời điểm nào đó trong quá trình phát triển cá thể, có một số genđược hoạt hóa (mà vốn trước na bị ức chế) để cho ra tính trạng mới, còn một số genkhác lại bị đình chỉ hoạt động Điều này xảy ra theo một chương trình đã được mãhóa trong cấu trúc của phân tử ADN của mỗi tế bào khiến quá trình sinh trưởng,phát triển của thực vật luôn được hài hòa.

Để điều khiển sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy, môi trường nuôi cấythường được bổ sung 2 nhóm chất điều tiết sinh trưởng thực vật là auxin vàcytokinin Tùy vào tỷ lệ hàm lượng 2 nhóm chất này trong môi trường sẽ tạo ra sựphát sinh hình thái khác nhau, có thể nhìn thấy qua một số đường hướng phát sinhhình thái của mô nuôi cấy (Phụ lục 1)

3.3. Quy trình sản xuất cây nuôi cấy mô (vi nhân giống)

3.3.1. Ý nghĩa của vi nhân giống

• Đặc điểm ưu việt:

- Nhân nhanh với hệ số nhân giống cao, đưa ra sản phẩm nhanh hơn

- Tạo ra các sản phẩm đồng nhất di truyền, công nghiệp hóa nông nghiệp

- Chất lượng cây giống tăng: sạch bệnh (virut, nấm vi khuẩn), năng suất tăng

- Tiết kiệm không gian nuôi cấy

- Khả năng tiếp thị sản phẩm tốt và nhanh hơn: bán sản phẩm dưới dạng cây controng ống nghiệm, bầu đát, củ bi, thân củ

- Lợi thế vận chuyển: cây có thể được chuyển đến vùng khác dưới dạng hàng loạimầm non đã bắt đầu phát triển

- Sản xuất quanh năm, không phụ thuộc mùa vụ

3.3.2. Quy trình vi nhân giống

Theo Georger (1993) vi nhân giống bao gồm các bước sau:

Bước 0: Chọn lọc và

chuẩn bị cây mẹ + Các cây mẹ phải sạch bệnh, đặc biệt là sạchvirut, ở giai đoạn sinh trưởng mạnh

hợp với chế độ chăm sóc và phòng trừ sâu bệnh

Bước 1: Nuôi cấy

khởi động

(khử trùng, đưa mẫu vào

nuôi cấy in vitro

+ Tỷ lệ mẫu nhiễm thấp, tỷ lệ sống cao, mô tồn tại

và sinh trưởng tốt

+ Chọn đúng loại mô, đúng giai đoạn phát triểncủa cây Quan trọng nhất là đỉnh chồi ngọn, đỉnhchồi nách, sau đó là đỉnh chồi hoa và cuối cùng làcác đoạn thân, mảnh lá…

Bước 2: Nhân nhanh

Phải xác định được môi trường nuôi cấy và điềukiện ngoại cảnh thích hợp để cho hiệu quả caonhất

Bước 3: Tạo cây in vitro

hoàn chỉnh

(tạo rễ cho chồi)

+ Chuyển từ môi trường nhân nhanh sang môitrường tạo rễ (được bổ sung một lượng nhỏ auxin)+ Một số chồi có thể phát sinh rễ ngay sau khichuyển từ môi trường nhân nhanh giàu cytokininsang môi trường không có chất điều tiết sinhtrưởng

3.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến nhân giống vô tính in vitro

3.4.1. Mô nuôi cấy

Mẫu cấy chính là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến hiệu quả tái sinh của mẫucấy, qua đó sẽ ảnh hưởng đến các thí nghiệm về sau Việc chọn các mô non nhưchồi đỉnh, chồi nách hay chồi bất định, chồi hoa non hay cụm hoa non sẽ tái sinh tốthơn mô già ở cùng một cây Ngoài ra kích thước mô cấy cũng ảnh hưởng đến khảnăng sống, sinh trưởng và phân hóa của chúng Mô cấy quá nhỏ thì sự tái sinh kém,ngược lại nếu mô quá lớn thì có khuynh hướng chỉ tạo ra một cây

3.4.2. Môi trường dinh dưỡng

Môi trường nuôi cấy cung cấp chất dinh dưỡng cho mẫu cấy nên ảnh hưởngmạnh mẽ đến các bước của vi nhân giống Trong nuôi cấy in vitro mỗi giống, loài,

tế bào đều có nhu cầu dinh dưỡng với mức đọ khác nhau Một môi trường cơ bản

phải cung cấp các thành phần dinh dưỡng cần thiết, thích hợp để mô nuôi cấy phátsinh hình thái Môi trường nuôi cấy được tạo ra từ môi trường cơ bản có bổ sungcác chất khác như đường, chất điều hòa sinh trưởng, vitamin… Các nhà nghiên cứunuôi cấy mô đã xây dựng được công thức cho một số môi trường cơ bản như MS,B5, Nitsch, WPM… Nhưng điểm chung những môi trường này cần đảm bảo nhữngthành phần sau:

+ Muối khoáng đa lượng: gồm N, P, K, S, Mg, Ca… là nguyên liệu để các tếbào và mô xây dựng các thành phần cấu trúc Chúng được sử dụng với nồng độ trên30ml/lit

+ Muối khoáng vi lượng: gồm Fe, Cl, Mn, Cu, Mo, B, Zn… Các nguyên tốnày là thành phần của các enzyme dị lập thể, nằm trong trung tâm hoạt động của cácenzyme xúc tác các phản ứng sinh hóa, thực hiện trao đổi chất Chúng được sử dụngvới nồng độ nhỏ hơn 30 ppm Tùy vào mục đích thí nghiệm của từng loại mô màhàm lượng các nguyên tố vi lượng có thể khác nhau

+ Nguồn cacsbon hữu cơ: thường được sử dụng là glucose, sucrose,lactose… Nguồn cacbon hữu cơ hay được sử dụng nhất là sucrose với nồng độ 2-3% cho một lít môi trường Tùy vào mục đích nuôi cấy mà nồng độ sucrose có thểthay đổi có thể xuống dưới 0,2% hoặc tăng lên 12%

3.4.3. Chất điều hòa sinh trưởng

Chất điều hòa sinh trưởng hoạt động với liều lượng rất thấp, ở liều lượng caochúng trở nên độc, điều này cho phép một vài chất kích thích tố được sử dụng nhưcác chất diệt cỏ

Các chất điều hòa nội sinh có thể được kiểm soát do cơ chế chuyển hóa của tếbào nên chúng được khảo sát hoặc đào thải khá nhanh Ngược lại, các chất điều hòatổng hợp tồn tại lâu hơn nhiều nên thường được sử dụng cho các ứng dụng thực tế

Có 5 nhóm chất điều hòa quan trọng trong nuối cấy mô thực vật: auxin,cytokinin, gibberillin, abscisic acid và etylen

Ø Auxin

Auxin là hợp chất có nhân indole, gồm có 2 loại là auxin có nguồn gốc nội sinh

do thực vật tạo ra ( IAA) và auxin tổng hợp do con người tạo ra (IBA, NAA, 2,4-D, …)

Auxin can thiệp vào nhiều hiện tượng sinh lý, hoạt động của nó tùy thuộcvào nồng độ và tác động hỗ trợ của chúng với các chất điều hòa sinh trưởng khác

Auxin tác động lên sự kéo dài tế bào Hiệu quả này là sự nối tiếp cho sự giatăng tính đàn hồi của thành tế bào và cho sự xâm nhập của nước vào bên trong tếbào, sự căng của thành tế bào giảm đi và tế bài kéo dài ra

Auxin thay đổi tính thẩm thấu của màng tế bào, sự thay đổi này thể hiệnbằng một sự phóng thích ion H+ Ion này gây ra một hoạt tính acid chịu trách nhiệmlàm giảm tính đề kháng của thành tế bào bởi sự hấp thu ion K+

Auxin kích thích sự phân chia tế bào một cách đặc biệt trong quá trình hìnhthành mô sẹo và sự hình thành rễ bất định Auxin cũng ức chế sự phát triển của chồinách và sự hình thành phôi sinh dưỡng trong môi trường nuôi cấy mô sẹo

Tất cả cây trồng đều tổng hợp auxin tùy theo giai đoạn phát triển của chúng.Auxin được tổng hợp ở lá non, trong các chồi đang hoạt động, ở phát hoa, ở các quảcòn non và lưu thông từ đỉnh xuống phía dưới với một sự phân cực được nhìn thấy

rõ trên các cơ quan thực vật còn non Nhưng trong quá trình vận chuyển này, chúng

bị oxy hóa do các hoạt động của các enzyme auxin-oxidase, điều này cho thấy nồng

độ auxin luôn cao hơn ở những vùng tổng hợp ra chúng

Ø Cytokinin

Cytokinin (gồm Kinetin, IBA, Zeatin và 2-iP) được phát hiện sau auxin vàgibberellin Người ta biết rằng trong môi trường nuôi cấy, việc bổ sung cytokinin sẽtạo điều kiện thuận lợi cho sự phân chia tế bào và hình thành chồi Cytokinin là cáchợp chất adenin được thay thế, có 2 nhóm cytokinin nội sinh được biết đến là Zeatin

và IBA, ngoài ra còn có 2 nhóm cytokinin tổng hợp được sử dụng nhiều nhất trongmôi trường nuôi cấy mô thực vật là Kinetin và BAP

Cytokinin có vai trò trong sự tạo cơ quan thực vật, chúng kích thích mạnh

mẽ sự thành lập chồi non, ngược lại chúng là chất đối kháng với sự tạo rễ

Cytokinin kích thích quá trình chuyển hóa, bảo vệ các chất chuyển hóachống lại tác dụng của enzyme phân giải, làm chậm quá trình lão hóa.

Các chồi nách được xử lý bằng cytokinin sẽ phát triển và cạnh tranh với cácchồi ngọn

Tóm lại, cytokinin giúp duy trì sự sống của mô, kích thích sự phân chia tế

bào và định hướng tế bào trong quá trình phân hóa, tạo điều kiện nuôi cấy in vitro

Trong nuôi cấy in vitro, gibberellin có tác dụng đối với nhiều đỉnh sinh

trưởng, nếu thiếu gibberellin đỉnh sinh trưởng thể hiện một dạng hình cầu, tạo nêncác mắt cây

Một hoạt động cũng phức tạp trong hiện tượng làm thức giấc các chồi, mầmngủ trên các hạt giống Hiệu quả này sẽ làm thuận lợi cho sự nảy mầm hoặc là đểthay thế sự lạnh và để thu được một sự tăng trưởng tốt

3.4.4. Vitamin

Việc sử dụng các vitamin khác nhau thường làm thuận lợi cho sự phát triển

của cây nuôi cấy in vitro.

Các vitamin vẫn thường được sử dụng trong quá trình nuôi cấy mô tế bàothực vật thuộc nhóm B như:

ü B1 hoặc Thiamin: Phân hủy trong autoclave, nhưng các chất bị phân hủynày cũng có tác động lên sinh trưởng của mô như chưa phân hủy

ü B6 hoặc Pyridoxine

ü Biotin

để mẫu cấy có thể hút nước và dinh dưỡng từ môi trường nuôi cấy Nước pha chếmôi trường là nước cất không chứa chất hữu cơ hay khoáng.

3.4.6. Thạch agar

Trong nuôi cấy tĩnh, nếu môi trường lỏng các mô tế bào sẽ bị chìm trong môitrường dẫn đến thiếu oxi và chết Để khắc phục hiện tượng này, môi trường nuôicấy mô tế bào thực vật phải được làm bằng giá thể agar

Thạch là một polisacarit làm từ một loại tảo biển Rhodophyta ở dạng bộthoặc sợi, thường sử dụng ở nồng độ 0,7 – 1,5% Mô được cấy lên môi trường đặc,phần mô tiếp xúc vẫn lấy được chất dinh dưỡng, phần trên đủ thoáng để cây sinhtrưởng và phát triển bình thường

Thạch tan hoàn toàn ở 1000C và đông đặc ở 450C Trong môi trường axitthạch không thể đông đặc được

3.4.7. pH môi trường

pH của môi trường là một yếu tố quan trọng ảnh hưởng trực tiếp đến quátrình thu nhận chất dinh dưỡng từ môi trường của tế bào Sự ổn định của pH môitrường là yếu tố duy trì trao đổi các chất trong tế bào

pH môi trường thường từ 5,5 – 5,8 trước khi khử trùng, nếu pH môi trườngcao hơn 6 thì mô và tế bào phát triển chậm Ngược lại, nếu pH nhỏ hơn 5 thì môitrường sẽ khó đông kết

Để chỉnh pH môi trường, có thể dùng dung dịch 10% hoặc 1N KOH hoặcNaOH hoặc 1N HCl

3.4.8. Các hợp chất tự nhiên

Sử dụng môi trường gồm các hợp chất hóa học và đường thì không đủ cho tếbào sinh trưởng bình thường Do đó, để thành phần môi trường thêm phong phú,đầy đủ, người ta thường sử dụng thêm các hợp chất dinh dưỡng tự nhiên như: nướcdừa, dịch nghiền khoai tây, cà rốt, chuối xanh, peptone, dịch chiết nấm men…Trong đó nước dừa được sử dụng rộng rãi nhất Kết quả phân tích thành phần quảdừa non đến già của Tukule và cộng sự (1961) cho thấy trong nước dừa có aminoaxit dạng tự do và dạng liên kết, axit hữu cơ, đường, myo – inositol, các hợp chất cóhoạt tính auxin và cytokinin dạng glucose.

3.4.9. Điều kiện nuôi cấy

Trong nhân chồi ban đầu và nhân chồi tiếp theo, cường độ ánh sáng có thểkhoảng 1000- 3000 lũ , thời gian chiếu sáng 16h sáng/8h tối, nhiệt độ phòng nuôi ở

25oC là phù hợp Trong thí nghiệm tạo rễ ở môi trường nuôi cấy, cây có thể đượcchiếu sáng ở cường độ cao (3000-10000 lux) để kích thích cây chuyển từ giai đoạn

dị dưỡng sang tự dưỡng Dưới cường độ ánh sáng cao, cây lùn và mất màu xanh,nhưng khi chuyển sang môi trường đất lại cho tỉ lệ sống sót cao, còn ở cường độánh sáng thấp, cây cao và xanh nhưng tỉ lệ sống sót thấp hơn

3.5. Ứng dụng của nuôi cấy mô tế bào thực vật trong nuôi cấy các giống khoai lang

trên thế giới và ở Việt Nam

3.5.1. Tình hình nuôi cấy giống khoai lang trên thế giới

Ø Hướng nghiên cứu tạo cây khoai lang in vitro sạch virus:

Năm 1975, Alconero và cộng tác viên đã kết hợp phương pháp nuôi cấy đỉnhsinh trưởng và xử lý nhiệt để loại trừ virus cây khoai lang Đỉnh sinh trưởng có kíchthước từ 0,4 -0,8 mm được cấy trên môi trường MS, bổ sung kinetin và auxin(NAA, IAA) Sau thời gian 20 - 50 ngày, đỉnh sinh trưởng hình thành mô sẹo.Trong số cây con được test virus thì có 47% không nhiễm bệnh

Anura Hettiarachchi và Sri Lanka (1988), sử dụng môi trường MS bổ sungauxin (2,4-D), cytokinins (KI, BAP), GA3 (0,1 mg/l) để nuôi cấy đỉnh sinh trưởng

cây khoai lang Đỉnh sinh trưởng với 2 - 3 lá mầm được cắt và cấy trên các môi

trường có các chất điều hòa sinh trưởng ở những nồng độ khác nhau, và đặt trongphòng nuôi cấy ở nhiệt độ 27 ± 20C, cường độ ánh sáng 2000 - 3000 lux Kết quả

thí nghiệm cho thấy 2,4-D (1 mg/l) và BAP (0,25 mg/l) tạo được cây con tốt hơn.Trường hợp 2,4-D và KI ở nồng độ cao hơn tương ứng 2,5 mg/l và 1,5 mg/l sẽ tạo

ra mô sẹo

Mervat và cộng tác viên (2009), nghiên cứu loại trừ virus đốm gợn sóngkhoai lang (SPFMV) Các mẫu ngoài đồng ruộng được kiểm tra hiện diện virusbằng phương pháp dot- ELISA Những cây khoai lang bị nhiễm virus được xử lý ởnhiệt độ 420C/ ngày (16giờ chiếu sáng) và 390C/ đêm (8giờ bóng tối) trong thời gian

3 tuần trước khi tách đỉnh sinh trưởng Những cây hình thành từ nuôi cấy đỉnh sinhtrưởng tiếp tục kiểm tra virus bằng dot-ELISA Kết quả nghiên cứu cho thấy không

có cây nào bị nhiễm

Trong nghiên cứu ảnh hưởng của các chất điều hoà sinh trưởng đến sự nuôicấy đỉnh sinh trưởng và nhân giống khoai lang, Iftekhar Alam và cộng tác viên(2010) đã cho thấy hơn 75% tạo chồi khi sử dụng môi trường MS có bổ sung 2 mg/l

KI và 0,5 mg/l GA3 Và các chồi này hình thành trực tiếp thành cây mà không pháttriển mô sẹo

Ø Vi nhân giống:

Nghiên cứu sớm nhất ở cây khoai lang do Yamaguchi và cộng sự công bố vàonăm 1974 về tái sinh khoai lang thông qua mô sẹo Kết quả cho thấy sự hình thành môsẹo từ rễ củ trên môi trường White có bổ sung 1 mg/l NAA và tái sinh chồi trên môitrường MS có bổ sung 1 mg/l ABA, 0,02 mg/l kinetin và 0,04 mg/l 2,4-D

Sự tái sinh chồi khoai lang in vitro từ rễ đã được công bố bởi Hwang và cộng

sự (1983) Theo nghiên cứu này, đầu tiên các đoạn rễ kích thước 2 – 3 cm đượcnuôi cấy lên môi trường MS biến đổi có bổ sung nồng độ muối khoáng cao, 100mg/l meo – inositol, 2 mg/l BA, 0,1 mg/l NAA, 30 g/l đường và 10 g/l agar Sau đó,

từ các nốt rễ sẽ tạo mô sẹo và các vùng giống như mô phân sinh để phát triển tiếpthành chồi Mười năm sau, Berlamino (1993) đã thực hiện lại quá trình tái sinh chồi

từ các nốt rễ khoai lang in vitro trên giống Benni Azuma thông qua nuôi cấy mô lá

trên môi trường MS có bổ sung 0,5 mg/l 2,4-D và 0,1 mg/l BAP và thu được tần sốtái sinh là 60%

Chee và cộng sự (1990) cho rằng bằng cách giảm nồng độ đường trong môitrường nuôi cấy xuống còn 1,6% cùng với việc bổ sung 2,4 – D sẽ tăng cường sựphát triển phôi Năm 1995, sự tái sinh khoai lang qua cuống lá được Desai và ctvthực hiện thành công trên 27 giống Giai đoạn đầu, các lá được cấy lên môi trường

MS có bổ sung 0,1 mg/l 2,4 – D và 0,2 mg/l zeatin cho tới khi cuống lá bắt đầuphình lên (2 – 4 ngày) Giai đoạn thứ hai, chúng được cấy truyền sang môi trường

MS có bổ sung 0,8 mg/l zeatin và đạt tần số tái sinh chồi cao

Tần số tái sinh cây cao đã được thiết lập từ các mô sẹo có nguồn gốc từ các mảnh

lá khoai lang in vitro nuôi cấy trên môi trường LS có bổ sung 0,5 mg/l 2,4 – D, 3g/l dịch

chiết nấm men, 50 g/l đường và chuyển sang môi trường thứ hai gồm khoáng LS có bổsung 2 mg/l ABA hoặc 2 mg/l AgNO3 để tái sinh thành cây (Otani, 1996)

Quy trình tái sinh cây trực tiếp gồm 2 giai đoạn cũng đã được công bố bởiPrakash và ctv (1996) Các mô cuống lá trong môi trường MS có bổ sung 2,4 – Dtrong giai đoạn đầu tiên và TDZ trong giai đoạn thứ hai Công bố này cho thấy khảnăng tái sinh cây phụ thuộc vào kiểu gen, giai đoạn phát triển và hướng đặt môcuống lá trên môi trường nuôi cấy

Năm 1997, Liu và cộng tác viên đã thiết lập thành công một hệ thống hiệuquả qua nuôi cấy dịch huyền phù tế bào có khả năng phát sinh phôi và tái sinh thànhcây khoai lang bằng cách sử dụng 2,4 – D và ABA Cũng trong năm 1997,Sihachakr đã nghiên cứu thành công hệ thống tái sinh cây khoai lang qua con đườngphát sinh phôi Các nhân tố ảnh hưởng đến việc tạo mô sẹo và hình thành chồi cũng

đã được thực hiện Công bố này đã cung cấp một loại môi trường cải biên trongnghiên cứu tái sinh khoai lang, môi trường SPM (Standard Sweet Potato Medium).SPM là môi trường MS có bổ sung meo – inositol 50 mg/l và 30 g/l đường Kết quảcho thấy trên môi trường SPM, mô sẽ tái tạo chồi

3.5.2. Tình hình nuôi cấy giống khoai lang ở Việt Nam

Chương trình cây có củ quốc gia đã nhập nội và tổ chức sưu tập nguồn gentrong cả nước trong đó có Trường Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh tham gia

Nông nghiệp Việt Nam và Trung tâm Nghiên cứu Nông nghiệp Hưng Lộc, ViệnKhoa học Nông nghiệp miền Nam gồm nhiều mẫu giống và dòng lai.

Kết quả chọn tạo giống khoai lang từ 1991-1995 của Trung tâm Nghiên cứuNông nghiệp Hưng Lộc và Trường Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh đã tuyểnchọn được 36 dòng triển vọng có năng suất củ tươi cao và phẩm chất củ ngon; giớithiệu được các giống khoai lang tốt như: K4, TN66, HL-4, NC1525, HL-419, HL-

518 Năm 1993-1994, các giống K4, HL-4, TN66 đã được Bộ Nông nghiệp và Pháttriển Nông thôn công nhận (Hoàng Kim, Nguyễn Thị Sâm, Nguyễn Thị Thủy,Nguyễn Đức Tuyến, Trương Văn Hộ và Enrique Chujoy, 1995)

Hiện nay, trên lĩnh công nghệ sinh học, cây khoai lang chưa được nghiên cứunhiều ở nước ta Tuy nhiên vẫn có một số các nghiên cứu nổi bật, trong đó cónghiên cứu của Nguyễn Mỹ Uyên và cộng tác viên (2006) khảo sát sự tăng trưởng

in vitro của cây khoai lang Ipomoea batatas L trong điều kiện chiếu sáng tự nhiên.

4. Virut đốm lông chim (Sweetpotato feathery mottle virus – SPFMV)

Ø Một số chủng virut: Vi rút gây bệnh đốm lá cho cây khoai lang

(Sweetpotato chlorotic leaf spot virus); Virut gây nốt sần cho cây khoai lang(Sweetpotato internal cork virus); Virut gây màu nâu đỏ nứt cho cây khoai lang(Sweetpotato russet crack virus); Sweetpotato vein mosaic virus; Vi rút A cây khoailang (Sweetpotato virus A); Sweetpotato vein clearing virus; Khoai lang bị virutđốm vòng (Sweetpotato ring spot virus)

Ø Ảnh hưởng về kinh tế

Mặc dù hiếm khi được công nhận, SPFMV thường làm giảm năng suất đáng

kể ở các vụ mùa khoai lang trên toàn thế giới Trên các cánh đồng, sản lượng cáccây khoai lang bị nhiễm virus thường giảm từ 20% đến 100% so với nhiều câytrồng không bị nhiễm bệnh Những cây trồng mẫn cảm hơn với vi rút thường bịthiệt hại đáng kể năng suất so với những cây trồng có khả năng chịu đựng tốt Tỷ lệcây bị bệnh dao động từ 30 đến 60%, tùy thuộc vào những cánh đồng được quansát Triệu chứng ban đầu bao gồm đường viền biến màu dọc theo gân lá và các đốm

úa vàng trên lá Dần dần, lá bị teo dần, còi cọc và củ không được to tròn

Vết biến màu dạng gợn sóng dọc theo

gân lá Xuất hiện đốm màu tím ở phiến lá

Xuất hiện đốm màu tím ở phiến lá Củ bị biến dạng

Hóa bần ở bên trong củ Đốm hoại tử bên ngoài

Hình 1.2 Một số triệu chứng thường gặp trên cây khoai lang bị nhiễm SPFMV

Ø Hình thái học

Các hạt virus hay còn gọi là virion có dộ dài khoảng từ 810-865 nm, chứamạch đơn ARN khoảng 3,7 x 106 D và một polypeptide khoảng 36 đến 38 KD, điềunày chỉ ra mối quan hệ huyết thanh học đối với một số potyviruses khác, trong khi

đó ở các phần siêu mỏng potyvirus loại IV với các thân hình trụ (CIBs)

Chất chiết xuất từ các mẫu lá có triệu chứng nhiễm vi rút được kiểm tra bằngkính hiển vi điện tử miễn dịch (IEM) và enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA), sử dụng một bảng các kháng thể chống lại virut gây bệnh cho cây khoailang, virut gây vàng lá khoai lang, virut gây đốm khoai lang Chỉ có một phản ứngyếu được quan sát thấy với vi rút gây bệnh cho cây khoai lang (SPFMV) trong cả