Ứng dụng kỹ thuật RT – PCR sàng lọc giống sạch bệnh và nhân nhanh in vitro một số giống khoai lang sạch bệnh virut đốm lông chim (SPFMV)

1. Lý do chọn đề tài Cây khoai lang được coi là một trong 7 loài cây lương thực quan trọng trên thế giới và xếp quan trọng hàng thứ 5 đối với các nước đang phát triển. Nó được trồng trên hơn 100 quốc gia trên thế giới với chức năng là một nguồn thực phẩm giá trị đối với con người, gia súc cũng như là vật liệu thô cho các ngành công nghiệp chế biến. Cây khoai lang tạo được lượng sinh khối và chất dinh dưỡng lớn nhất trên cùng một đơn vị diện tích khi so sánh với bất cứ loài cây trồng nào. Trong một nghiên cứu tại Nhật Bản, so sánh với 20 loài trái cây và rau quả khác trong việc làm ngăn chặn cũng như làm giảm lượng cholesterol thì khoai lang được xếp đầu bảng. Ngoài ra khoai lang còn mang tính giải độc cao đối với các loại kim loại nặng. Cây khoai lang thích nghi được với nhiều điều kiện sinh thái nông nghiệp khác nhau, nó có thể mọc ở những vùng đất nghèo dinh dưỡng cũng như những vùng đất bị khô hạn. Tại Ai Cập, khoai lang được trồng ở những vùng đất khác nhau với tổng diện tích là 11.200 hecta với năng suất là 30 tấnha. Trong vòng vài ba năm qua nhu cầu xuất khẩu khoai lang tăng lên rất nhiều nhưng Ai Cập chỉ xuất được 6.000 tấn sang châu Âu. Lý do là dịch hại và bệnh đã ngăn cản việc làm cho khoai lang ở Ai Cập không đạt được năng suất tối đa. Trong đó bệnh virus được coi là nguyên nhân chính làm giảm năng suất. Do đó, Viện Nghiên Cứu Kỹ thuật Gen Nông nghiệp Ai Cập (AGERI) đã áp dụng nhiều kỹ thuật nhằm cải tạo giống khoai lang và đã rất thành công. Ở Việt Nam khoai lang là một trong bốn loại lương thực chính sau lúa, ngô, sắn, là cây lương thực quan trọng của một số vùng nước ta, tạo sinh khối lớn trong thời gian ngắn. Khoai lang thuộc giống cây có củ, là đối tượng kinh tế mà người trồng sử dụng và giao lưu kinh tế trên thị trường để có thu nhập và đảm bảo cuộc sống hằng ngày. Một số giống khoai lang cho năng suất cao, phẩm chất tốt được trồng nhiều hiện nay như giống khoai Hoàng Long, KTB1, KTB2, Chiêm Dâu, KL5, Tím Nhật, Tím thường… ViệtNam đượcxếpthứnămvềsảnlượngkhoailangxuấtkhẩu trên toàn thế giới.Tuy nhiên, năngsuấtcònthấpvàbấpbênh, không ổn định, củ nhỏ dosửdụnggiống bịthoáihóa,ítquantâm đến biện pháp canh tác và sâu bệnh. Mặt khác, hầu hết nông dân vẫn chưa tiếp cận và nhận được nguồn giống đảm bảo sạch bệnh. Virut đốm lông chim khoai lang (Sweetpotato feathery mottle virus – SPFMV) thường làm giảm năng suất đáng kể ở các vụ mùa khoai lang trên toàn thế giới. Trên các cánh đồng, sản lượng các cây khoai lang bị nhiễm virus thường giảm từ 20% đến 100% so với nhiều cây trồng không bị nhiễm bệnh. Những cây trồng mẫn cảm hơn với vi rút thường bị thiệt hại đáng kể năng suất so với những cây trồng có khả năng chịu đựng tốt. Các triệu chứng của SPFMV trên tán lá thường nhẹ hoặc không có. Mức độ hiển thị triệu chứng trên phụ thuộc tính mẫn cảm của giống cây trồng, giai đoạn phát triển và mức độc tố của virut. Các triệu chứng trên củ phụ thuộc chủng SPFMV và giống khoai lang. Virus cũng có thể tiềm ẩn trong dây,tồn tại trong hom giống và được lưu truyền do nhiều loài rệp. SPFMV được tìm thấy bất cứ nơi nào khoai lang được trồng. Ngày nay, bằng kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại và phương pháp nhân giống invitro đã tạo nhiều giống sạch bệnh, năng suất cao, phẩm chất tốt. Đặc biệt ứng dụng trên nhiều giống quý cho hiệu quả cao. Mặc dù trên thế giới các phương pháp này đã được ứng dụng khá nhiều tuy nhiên ở Việt Nam còn khá hạn chế. Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi thực hiện đề tài: Ứng dụng kỹ thuật RT – PCR sàng lọc giống sạch bệnh và nhân nhanh in vitro một số giống khoai lang sạch bệnh virut đốm lông chim (SPFMV)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI ***** ĐẶNG MINH HẰNG ỨNG DỤNG KỸ THUẬT RT – PCR SÀNG LỌC GIỐNG SẠCH BỆNH VÀ NHÂN NHANH IN VITRO MỘT SỐ GIỐNG KHOAI LANG SẠCH BỆNH VIRUT ĐỐM LÔNG CHIM (SPFMV) LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC SINH HỌC HÀ NỘI - 2014 LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Nguyễn Xuân Viết, người tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tạo điều kiện tốt cho suốt trình học tập hoàn thiện đề tài Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể cán phòng nuôi cấy mô Viện Khoa học kỹ thuật Nông nghiệp Bắc Trung Bộ, kỹ thuật viên Phùng Văn Hào trung tâm thực hành thí nghiệm trường Đại học Vinh tạo điều kiện tận tình giúp đỡ, bảo cho kiến thức, kỹ thuật kinh nghiệm suốt thời gian thực nghiên cứu hoàn thành luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè bên cạnh động viên, giúp đỡ suốt trình học tập nghiên cứu Hà Nội, ngày 12 tháng 10 năm 2014 Học viên Đặng Minh Hằng DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT VÀ KÍ HIỆU SỬ DỤNG Chữ viết tắt Viết đầy đủ ADN Axit Deoxiribo Nucleic ARN Axit Ribo Nucleic BAP 6- benzylaminopurin CT Công thức dNTP Deoxyribo Nucleotide Triphotphat ĐC Đối chứng IAA Indol Acetic Acid Kb Kilo base MS Muraghige – Skoog NAA α – naphytyl Acetic Acid PCR Polymerase Chain Reaction TAE Tris – acetic acid – EDTA Taq Thermus aquaticus UV Ultra Violet DANH MỤC HÌNH VẼ VÀ SƠ ĐỒ DANH MỤC BẢNG MỤC LỤC PHẦN I MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài Cây khoai lang coi loài lương thực quan trọng giới xếp quan trọng hàng thứ nước phát triển Nó trồng 100 quốc gia giới với chức nguồn thực phẩm giá trị người, gia súc vật liệu thô cho ngành công nghiệp chế biến Cây khoai lang tạo lượng sinh khối chất dinh dưỡng lớn đơn vị diện tích so sánh với loài trồng Trong nghiên cứu Nhật Bản, so sánh với 20 loài trái rau khác việc làm ngăn chặn làm giảm lượng cholesterol khoai lang xếp đầu bảng Ngoài khoai lang mang tính giải độc cao loại kim loại nặng Cây khoai lang thích nghi với nhiều điều kiện sinh thái nông nghiệp khác nhau, mọc vùng đất nghèo dinh dưỡng vùng đất bị khô hạn Tại Ai Cập, khoai lang trồng vùng đất khác với tổng diện tích 11.200 hecta với suất 30 tấn/ha Trong vòng vài ba năm qua nhu cầu xuất khoai lang tăng lên nhiều Ai Cập xuất 6.000 sang châu Âu Lý dịch hại bệnh ngăn cản việc làm cho khoai lang Ai Cập không đạt suất tối đa Trong bệnh virus coi nguyên nhân làm giảm suất Do đó, Viện Nghiên Cứu Kỹ thuật Gen Nông nghiệp Ai Cập (AGERI) áp dụng nhiều kỹ thuật nhằm cải tạo giống khoai lang thành công Ở Việt Nam khoai lang bốn loại lương thực sau lúa, ngô, sắn, lương thực quan trọng số vùng nước ta, tạo sinh khối lớn thời gian ngắn Khoai lang thuộc giống có củ, đối tượng kinh tế mà người trồng sử dụng giao lưu kinh tế thị trường để có thu nhập đảm bảo sống ngày Một số giống khoai lang cho suất cao, phẩm chất tốt trồng nhiều giống khoai Hoàng Long, KTB1, KTB2, Chiêm Dâu, KL5, Tím Nhật, Tím thường… Việt Nam xếp thứ năm sản lượng khoai lang xuất toàn giới Tuy nhiên, suất thấp bấp bênh, không ổn định, củ nhỏ sử dụng giống bị thoái hóa, quan tâm đến biện pháp canh tác sâu bệnh Mặt khác, hầu hết nông dân chưa tiếp cận nhận nguồn giống đảm bảo bệnh Virut đốm lông chim khoai lang (Sweetpotato feathery mottle virus – SPFMV) thường làm giảm suất đáng kể vụ mùa khoai lang toàn giới Trên cánh đồng, sản lượng khoai lang bị nhiễm virus thường giảm từ 20% đến 100% so với nhiều trồng không bị nhiễm bệnh Những trồng mẫn cảm với vi rút thường bị thiệt hại đáng kể suất so với trồng có khả chịu đựng tốt Các triệu chứng SPFMV tán thường nhẹ Mức độ hiển thị triệu chứng phụ thuộc tính mẫn cảm giống trồng, giai đoạn phát triển mức độc tố virut Các triệu chứng củ phụ thuộc chủng SPFMV giống khoai lang Virus tiềm ẩn dây,tồn hom giống lưu truyền nhiều loài rệp SPFMV tìm thấy nơi khoai lang trồng Ngày nay, kỹ thuật sinh học phân tử đại phương pháp nhân giống invitro tạo nhiều giống bệnh, suất cao, phẩm chất tốt Đặc biệt ứng dụng nhiều giống quý cho hiệu cao Mặc dù giới phương pháp ứng dụng nhiều nhiên Việt Nam hạn chế Xuất phát từ lý trên, thực đề tài: Ứng dụng kỹ thuật RT – PCR sàng lọc giống bệnh nhân nhanh in vitro số giống khoai lang bệnh virut đốm lông chim (SPFMV) Mục đích nghiên cứu đề tài - Sử dụng kỹ thuật RT-PCR chọn giống virut đốm lông chim (Sweetpotato - feathery mottle virus) làm vật liệu nhân nhanh in vitro Xác định ảnh hưởng kiểu gen số thành phần Cytokinin Auxin môi trường nuôi cấy in vitro qua xác định môi trường nhân nhanh thích hợp số giống khoai lang quý, suất cao, phẩm chất tốt phục vụ cho sản xuất Nhiệm vụ cụ thể đề tài - Nghiên cứu sàng lọc ban đầu đánh giá hiệu sàng lọc mẫu mô nuôi cấy - tạo vật liệu nhân giống khoai lang Nghiên cứu ảnh hưởng kiểu gen giống hiệu nhân nhanh giống - khoai lang Đánh giá bước đầu triển vọng áp dụng kỹ thuật RT-PCR kết hợp nuôi cấy in vitro tạo nguồn giống khoai lang bệnh virut cho sản xuất Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài - Sử dụng kỹ thuật RT-PCR sàng lọc giống khoai lang đảm bảo bệnh - virut đốm lông chim, cung cấp nguồn giống cho sản xuất địa phương Xác định môi trường nuôi cấy in vitro thích hợp góp phần phát triển nhanh giống khoai lang chất lượng cao phục vụ nông dân vùng khó khăn đẩy • • • - mạnh sản xuất khoai lang hàng hóa quy mô lớn Địa điểm thời gian nghiên cứu Địa điểm nghiên cứu Viện Khoa học kỹ thuật nông nghiệp Bắc Trung Bộ Phòng nuôi cấy mô – Trung tâm thực hành, thí nghiệm - Trường Đại học Vinh Vườn thực nghiệm – Khoa sinh học – Trường đại học Vinh Thời gian nghiên cứu Thời gian nghiên cứu từ tháng 01/2014 – 10/ 2014 PHẦN II NỘI DUNG CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU Giới thiệu chung khoai lang 1.1 1.1.1 - Phân loại, nguồn gốc, phân bố đặc điểm tế bào học Phân loại Giới (kingdom) : Thực vật (Plantae) Ngành (division): Thực vật hạt kín (Mangrolyophyta) Lớp (class): Một mầm (Magnoliopsida) Bộ (order): Solanales Họ (family): Họ bìm bìm (Convolvulaceae) Chi (genus): Ipomoea Loài : Ipomoea Batatas L Hình 1.1 Cây khoai lang 1.1.2 1.1.2.1 Nguồn gốc phân bố Nguồn gốc Khoai lang có nguồn gốc Nam Mỹ khoảng 5.000 năm trước Công Nguyên Dấu tích củ khô tồn lâu khám phá Caves Chilca Canyon thuộc Peru (Engel, 1970) Người ta tìm thấy diện khoai lang vùng Mayan Trung Mỹ Astin (1977) giả thuyết có hai trung tâm phát sinh nguồn gốc khoai lang Guatamala nam Peru Trong số công trình khác đa dạng loài khoai lang cao Colombia, Equador nam Peru 10 Bảng 3.5: Ảnh hưởng nồng độ GA3, IAA đến giai đoạn nhân nhanh Của giống: Hoàng Long, KTB2, KL5 Hormon sinh trưởng Giống Hoàng Long KTB2 KL5 63 Chỉ tiêu theo dõi GA3 (mg/l) IAA (mg/l) Tổng số mẫu cấy 60 60 100 1,7 2,0 Chồi bậm, thấp, rễ 0,5 60 60 100 2,2 2,5 Chồi bậm, nhỏ, có rễ 1 60 60 100 3,0 2,6 Chồi bậm, phiến to, xanh, có rễ 1,5 60 60 100 3,2 3,2 Chồi khỏe, to, xanh đậm, rễ nhiều 60 60 100 2,9 3,7 Chồi mảnh, cao vổng, yếu, phiến nhỏ Có rễ 60 60 100 3,5 3,7 Thân yếu thấp, nhỏ, 0,5 60 60 100 4,0 4,1 Thân bậm, cao, xanh 1 60 60 100 4,0 4,5 Thân bậm, cao, nhỏ 1,5 60 60 100 4,7 4,6 Thân khỏe, cao, nhỏ, rễ 60 60 100 5,7 5,4 Thân khỏe, cao, lớn, xanh đậm Ra rễ nhiều 60 60 100 2,3 4,2 Chồi cao vổng, yếu, thân nhỏ Có rễ 0,5 60 60 100 2,5 4,5 Chồi cao, cuống dài, phiến nhỏ Có rễ 1 60 60 100 3,0 4,5 Chồi cao vổng, xanh, phiến nhỏ Ra rễ 1,5 60 60 100 3,6 4,7 Chồi cao, thân mảnh, phiến rộng Ra rễ nhiều 60 60 100 4,5 5,3 Chồi cao, thân bậm, phiến Số mẫu tạo chồi Tỷ lệ mẫu tạo chồi (%) Hệ số nhân chồi Chiều cao trung bình (cm) Đặc điểm chồi vừa, xanh đậm Ra rễ Bảng 3.6: Ảnh hưởng nồng độ Kinetin, IAA đến giai đoạn nhân nhanh Của giống: Chiêm Dâu, Tím Nhật, Tím thường Hormon sinh trưởng Giống Chiêm Dâu Tím Nhật Tím Thường 64 Chỉ tiêu theo dõi Kineti n (mg/l) IAA (mg/l) Tổng số mẫu cấy 60 60 100 1,9 3,4 Thân bậm, ngắn, phiến rộng Có rễ 0,5 60 60 100 3,2 4,0 Chồi khỏe, cao, rộng, xanh đậm, có rễ 1 60 60 100 2,8 4,0 Chồi bậm, rộng 1,5 60 60 100 2,2 3,5 Chồi mảnh, có vàng 60 60 100 1,7 3,2 Chồi mảnh, lá, rễ 60 60 100 3,0 3,4 Chồi bậm, màu xanh tím, rộng Có rễ 0,5 60 60 100 4,1 3,5 Chồi bậm, nhiều, phiến rộng Có rễ 1 60 60 100 4,0 3,0 Chồi bậm, ngắn, 1,5 60 60 100 3,4 2,8 Chồi mảnh, rễ nhiều 60 60 100 2,6 2,5 Chồi mảnh, yếu, 60 55 91,6 3,8 3,2 Chồi mảnh, vống, Có rễ 0,5 60 60 100 4,1 3,3 Chồi bậm, vống 1 60 60 100 4,8 3,6 Chồi bậm, vống, màu trắng tím, nhiều lá, có rễ 1,5 60 60 100 4,3 3,4 Số mẫu tạo chồi Tỷ lệ mẫu tạo chồi (%) Hệ số nhân chồi Chiều cao trung bình (cm) Đặc điểm chồi Chồi mảnh, nhỏ, có vàng, có rễ 60 56 93,3 2,7 3,0 Chồi mảnh, yếu, ít, rễ Số liệu bảng 3.6 cho thấy, kết hợp với kinetin hàm lượng IAA môi trường cần phải thấp hơn, giao động từ khoảng 0,5 – mg/l Đối với giống Chiêm Dâu, công thức thích hợp cho giai đoạn nhân nhanh môi trường bổ sung mg/l kinetin + 0,5 mg/l IAA Ở công thức cho hệ số nhân chồi 3,2 Chồi khỏe, phiến rộng, màu xanh đậm mg/l kinetin + 0,5 mg/l IAA môi trường phù hợp cho giai đoạn nhân nhanh giống khoai tím nhật Hệ số nhân chồi đạt cao, 4,1 lần Chồi bậm, khỏe, màu tím xanh, rộng Giống khoai Tím thường cần bổ sung hàm lượng IAA cao (1 mg/l kinetin + mg/l IAA) công thức phù hợp Đặc điểm chồi thí nghiệm thường dài, vống hơn, màu trắng tím Hệ số nhân chồi đạt 4,8 cao Có tượng rễ Trong thí nghiệm này, hàm lượng IAA cao (từ 1,5 – mg/l) lại ức chế trình sinh trưởng chồi kéo theo đó, làm cho hệ số nhân chồi giảm IAA có khả kích thích tăng trưởng chồi mà có tác dụng phát triển rễ 65 Hoàng Long KTB2 KL5 Chiêm Dâu Tím Nhật Tím thường Hình 3.7 Hình ảnh giống khoai nghiên cứu môi trường nhân nhanh phù hợp 66 Thành phần môi trường rễ thích hợp giống khoai lang nghiên cứu Trong nhân giống invitro, giai đoạn kích thích rễ chồi tạo ống nghiệm giai đoạn thiếu Rễ có nhiều vai trò đời sống cây: hút nước, khoáng, bám vào giá thể Đối với khoai lang, rễ liên quan đến hình thành củ, phận quan trọng Khi kết thúc giai đoạn nhân chồi, số lượng chồi tạo lớn đưa vào môi trường rễ Qua số công thức thăm dò, môi trường rễ phytohormon có khả tạo rễ cho cây, tỷ lệ rễ cao cần thời gian nhiều IAA hóa chất sử dụng để nghiên cứu khả tạo rễ nghiên cứu này, với nồng độ khác Khoai lang giống dễ rễ nên hàm lượng IAA cần bổ sung thường nhỏ Kết thí nghiệm thể bảng 3.7 Bảng 3.7 Hiệu rễ giống khoai lang với hàm lượng IAA khác Giống CT IAA mg/l Số chồi Số chồi cấy rễ Sau tuần nuôi cấy Chiều Số rễ dài TB Chất lượng rễ TB/cây (cm) 5,6 4,0 Rế mảnh, ngắn 6,2 4,3 Rễ mảnh, lông hút 7,5 5,0 Rễ mập, dài, xanh Hoàng 0,5 60 60 60 60 60 60 Long 1,5 60 60 8,5 6,5 60 60 7,5 5,5 Rễ mập, nhiều lông hút 60 60 6,0 3,0 Rễ ngăn, mảnh 0,5 60 60 6,5 3,2 Rễ ngắn, lông hút 60 60 7,0 4,3 1,5 60 60 7.0 4,7 60 60 7,2 5,5 nhiều lông hút, màu 2,5 trắng Rễ mập, ngắn, cứng KTB2 Chiêm 67 60 60 4,5 Rễ mập, dài, xanh, nhiều lông hút Rễ mập, nhiều lông hút, trắng Rễ mập, nhiều lông hút Rễ mập, dài, Dâu 0,5 60 60 5,2 4,5 60 60 5,7 3,5 1,5 60 60 5,0 3,5 60 60 4,1 2,0 Rễ mảnh, ngắn, yếu 0,5 60 60 60 60 2,2 2,5 2,2 2,2 60 60 3,5 2,5 Rễ ngắn, cứng Rễ ngắn, cứng Rễ mập, cứng, 1,5 60 60 3,5 2,5 60 60 4,5 2,5 60 60 3,0 5,0 0,5 60 60 4,3 6,8 60 60 4,5 6,5 1,5 60 60 3,7 6,0 60 60 60 60 3,5 5,0 5,6 2,0 0,5 60 60 6,0 2,2 60 60 7,5 2,5 1,5 60 60 6,5 2,7 60 60 4,7 2,5 KL5 Tím Nhật Tím Rễ mập, nhiều lông Thường hút, màu trắng Rễ mập, ngắn, lông hút, trắng Rễ mảnh, ngắn, lông hút lông hút Rễ mập, cứng, nhiều lông hút Rễ to, mập, cứng, nhiều lông hút Rễ mảnh, dài, yếu, xanh Rễ mập, dài, nhiều lông hút, xanh Rễ mập, dài, nhiều lông hút, xanh Rễ mảnh, nhiều lông hút Rễ mảnh, yếu Rễ mảnh, yếu, ngắn Rễ mảnh, ngắn, nhiều lồn hút Rễ mập, nhiều lông hút, màu nâu Rễ mập, màu nâu, tận hóa đen Rễ nhỏ dần, yếu, lông hút Kết nghiên cứu bảng 3.7 cho thấy Tất chồi rễ môi trường nghiên cứu sau tuần nuôi cấy, kể công thức đối chứng (không bổ sung IAA) Trên môi trường đối chứng không bổ sung IAA số rễ hơn, chiều dài trung bình rễ ngắn, chất lượng rễ rễ muộn Chiều dài trung bình rễ dao động khoảng từ – cm (sau tuần nuôi cấy) số lượng rễ giao động từ 2,2 – 6,0 rễ/ (sau tuần nuôi cấy) 68 Trong đó, môi trường có bổ sung IAA, cho hiệu cao hơn, chất lượng rễ tốt hơn, rễ dài, nhiều lông hút, khỏe chồi rễ sớm Cụ thể, sau tuần nuôi cấy, chiều dài trung bình rễ giao động khoảng 2,5 – 6,8 cm, số rễ trung bình giao động từ 3,5 – 8,5 rễ/cây Trong công thức nghiên cứu, công thức phù hợp với giống là: - 69 Giống Hoàng Long: Môi trường MS bổ sung 1,5 mg/l IAA Giống KTB2: Môi trường MS bổ sung mg/l IAA Giống Chiêm Dâu: Môi trường MS bổ sung 0,5 mg/l IAA Giống KL5: Môi trường MS bổ sung mg/l IAA Giống Tím Nhật: Môi trường MS bổ sung 0,5- mg/l IAA Giống Tím thường: Môi trường MS bổ sung mg/l IAA Hoàng Long KTB2 KL5 Chiêm Dâu Tím Nhật Tím thường Hình 3.8 Rễ giống khoai lang môi trường rễ phù hợp 70 Kết đánh giá bước đầu khả sinh trưởng in vitro trồng giá thể môi trường Giai đoạn thích ứng in vitro điều kiện tự nhiên bước cuối quan trọng Phải biết cách lựa chọn giá thể thích hợp, huấn luyện thích nghi từ môi trường nhân tạo sang môi trường tự nhiên để in vitro không bị sốc, cho tỷ lệ sống cao Trong thí nghiệm này, lựa chọn giá thể cát ẩm, sạch, huấn luyện điều kiện thoáng mát 28-300C, phòng mát với khoảng thời gian tuần Sau cho huấn luyện thích nghi nhà lưới Thời gian theo dõi tuần Kết in vitro huấn luyện thích nghi giá thể vườn thực nghiệm thể bảng 3.8 Bảng 3.8 Khả sống sót mầm invitro môi trường Giống Số lượng mẫu Trên môi trường giá thể Môi trường Số mẫu Tỷ lệ mẫu Số mẫu Tỷ lệ mẫu sống sống sống sống Hoàng Long 60 51 85,00 45 75,00 KTB2 60 56 93,33 50 83,33 Chiêm Dâu 60 55 91,67 49 81,67 KL5 60 45 75,00 40 66,67 Tím Nhật 60 56 93,33 52 86,67 Tím thường 60 44 73,33 38 63,33 Số liệu từ bảng 3.8 cho thấy, in vitro đưa trồng giá thể vườn thực nghiệm cho tỷ lệ sống cao Tỷ lệ sống thấp giống Tím thường đạt 73,33% môi trường giá thể 63,33% môi trường Tỷ lệ sống cao giống KTB2 giống Tím Nhật đạt 93,33% giá thể xấp xỉ 85% vườn thực nghiệm Tỷ lệ sống in vitro phụ thuộc vào chất lượng chồi, số lượng chất lượng rễ Bằng thực nghiệm cho thấy, giống Hoàng Long, KTB2, Chiêm Dâu, 71 Tím Nhật có chồi to hơn, khỏe hơn, nhiều lá, phiến rộng, rễ nhiều, dài, khỏe, nhiều lông hút cho tỷ lệ sống sót cao Giống KL5 thân cao, nhiều chất lượng rễ kém, giống tím thường vổng cao, yếu, chất lượng rễ nên cho tỷ lệ sống sót thấp Hình 3.9 Huấn luyện thích nghi giá thể sau tuần theo dõi Hình 3.10 Huấn luyện thích nghi môi trường sau tuần theo dõi 72 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ I KẾT LUẬN Ứng dụng kỹ thuật RT-PCR với cặp mồi đặc hiệu cho phép lựa chọn xác khoai lang bệnh virut đốm lông chim (SPFMV) làm nguồn mẫu nuôi cấy ban đầu cho nhân nhanh in vitro giống khoai lang bệnh virut phục vụ sản xuất Hiệu khử trùng mẫu cấy in vitrro mức độ mẫn cảm với chất điều tiết sinh trưởng khoai lang nghiên cứu phụ thuộc vào kiểu gen giống - Các giống Hoàng Long, Chiêm Dâu, Tím Nhật, Tím thường đạt hiệu khử trùng tốt xử lý khử trùng HgCl2 0,1% thời gian 8-10 phút Giống KL5 mẫn cảm hơn, thời gian khử trùng hiệu 6-8 phút Trong đó, thuốc khử trùng Ca(OC)2 10% xử lý 20 phút có hiệu khử trùng tốt cho giống KTB2 - Môi trường MS có bổ sung BAP với hàm lượng từ mg/l cần thiết cho tái sinh chồi trực tiếp giống Hoang Long, Chiêm Dâu, KL5, Tím Nhật, Tím thường, - với giống KTB2 đòi hỏi hàm lượng BAP cao mg/l Kết hợp với GA3 (1mg/l) IAA (1,5 – 2mg/l) mang lại hiệu nhân nhanh cao đa số giống nghiên cứu so với kết hợp kinetin (1mg/l) với IAA (hàm - lượng thích hợp giao động khoảng 0,5–1 mg/l) Cây khoai lang nhân nhanh in vitro bệnh virut đốm lông chim hầu hết giống nghiên cứu (ngoại trừ giống tím thường KL5) có tỷ lệ sống sót cao giai đoạn vườn ươm 3.Ứng dụng kỹ thuật RT-PCR để chọn nguồn mẫu bệnh virut đốm lông chim nhân giống in vitro môi trường thích hợp giải nguồn giống khoai lang bệnh virut cho sản xuất 73 II ĐỀ NGHỊ - Kết hợp ứng dụng kỹ thuật phân tử Rt-PCR để chọn lọc nguồn giống bệnh virut, kết hợp nhân nhanh giống kỹ thuật in vitro để cung cấp nguồn giống khoai lang bệnh virut đốm lông chim cho sản xuất - Tiếp tục theo dõi sinh trưởng phát triển giống có nguồn gốc in vitro đồng ruộng để có kết luận toàn diện hiệu áp dụng kỹ thuật công nghệ sinh học phát triển nghề trồng khoai lang nước ta 74 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Lê Trần Bình (1997) Công nghệ sinh học thực vật cải tiến giống trồng Giáo trình cao học nông nghiệp NXB ĐH Nông nghiệp, Hà Nội, tr 62-79 Hà Thị Dung (2012) Đa hình RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) cảm ứng tạo củ in vitro số giống khoai môn sọ địa phương (Colocasia esculenta (L.) schott) Luận văn thạc sỹ sinh học, ĐHSP Hà Nội, tr18-27 Mai Thạch Hoành, Nguyễn Thị Lan (2003), Kết nghiên cứu số giống khoai lang vùng đất cát biển Thanh Hóa vụ đông, vụ xuân 2000-2001, Tuyển tập công trình khoa học kỹ thuật nông nghiệp, Viện Khoa học kỹ thuật Nông nghiệp Việt Nam, NXB Nông nghiệp, Hà Nội Nguyễn Như Khanh (1996) Sinh trưởng phát triển thực vật NXB Giáo dục, tr 62 Dương Công Kiên, Lê Lý Thùy Trâm, Hồ bảo Thùy Quyên (2003) Nuôi cấy mô thực vật II, NXB Đại học Quốc gia TP HCM, tr 10,89,97 Phạm Văn Linh, Nguyễn Đức Anh, Trần Thị Quỳnh Nga cs, Kết nhân nhanh giống khoai lang phương pháp nuôi cấy in vitro, tạp chí khoa học Nghệ An, số 7, tr 1-5 Lê Đình Lương, Quyền Đình Thi (2002) Kỹ thuật di truyền ứng dụng NXB Đại học quốc gia Hà Nội, tr 24-55 Trịnh Xuân Ngọ, Đinh Thế Lộc (2004), Cây có củ kỹ thuật thâm canh Khoai lang, – khoai lang NXB Lao động xã hội, Hà Nội, tr 1- 30 Nguyễn Quang Thạch, Nguyễn Thị Lý Anh, Nguyễn Phương Linh (2005) 10 Giáo trình công nghệ sinh học nông nghiệp NXB Nông nghiệp, tr 38-63 Nguyễn Đức Thành(2000) Nuôi cấy mô tế bào thực vật - nghiên cứu ứng 11 dụng NXB Nông nghiệp, tr 22-31, 19-20, 63-61 Nguyễn Sỹ Tuấn, Hứa Mỹ Ngọc (2008), Sự phát sinh phôi vô tính khoai lang (Ipomoea batatas L.) ống nghiệm Tạp chí khoa học số 1, tr 12 75 12 Nguyễn Mỹ Uyên (2007), Khảo sát tăng trưởng in vitro khoai lang Ipompea batatas L điều kiện chiếu sáng tự nhiên Hội nghị khoa học công nghệ 2007, tr 56 Tiếng Anh 13 Chee, R.P., J.R Schultheis, and D.J Cantliffe 1990 Plant recovery sweet potato somatic embryos Hort.sci 25 (7): 795 – 797 14 Hwang L.S., Skirvin, RM., Casayo, J and Bouwkamp, J 1983 advent shoot formation from sections of sweet potato grown in vitro Scientia 20: 119 – 129 15 Liu J R and Cantliffe D J (1984), “Somatic embryogenic and plant regeneration in tissue cultures of sweetpotato (Ipomoea batatas Poir.)” Plant Cell Reports.Vol 3, pp 112-115 16 Murashige T, Skoog F 1962 arevised medium for rapid growth and bioassays with tobaco tissue culture Physiologia Plantarum 17 Otani M., Shimada T., Nizeki H (1987) Mesophyll protoplast culture of sweet potato (Ipomoea batatas L.) Plant Sci 53, 157 – 160 18 Sullivan J N., Asher C J and Blamey F.P (1997), Nutrient disorder of sweetpotato Australian Centre for International Agricultural Research, pp – 15 Websites 19.http://keys.lucidcentral.org/keys/sweetpotato 20.http://www.ndrs.org.uk 22.http://apsjournals.apsnet.org 23.http://www.fao.org.vn Phụ lục Thành phần môi trường Murashige – Skoog, 1962 Nhóm nguyên tố 76 Tên hóa chất Nồng độ (mg/l) môi trường 77 Đa lượng Vi lượng Dung dịch sắt Inositol Vitamine NH4NO3 1650 KNO3 MgSO4 7H2O 1900 370 CaCl2 2H2O KH2PO4 CuSO4 H2O MnSO4 H2O KI COCl2 6H2 O ZnSO4 7H2O H3BO3 Na2M0O4 2H2O FeSO4 7H2O 440 170 0.025 22.3 0.83 0.025 10.6 6.2 0,25 27.85 Na2EDTA 2H2O Myo - inositol Nicotinic acid Glycine Thiamine HCl Pyridoxine HCl 37.25 100 0,5 0,1 0,5 [...]... Phạm Văn Linh, Nguyễn Đức Anh, Trần Thị Quỳnh Nga và cs (Viện khoa học kỹ thuật nông nghiệp Bắc Trung Bộ) nghiên cứu kết quả nhân nhanh giống khoai lang bằng phương pháp nuôi cấy in vitro Trong đó, có giai đoạn kiểm tra virut đốm lông chim bằng công nghệ RT- PCR Kết quả cho thấy sau khi sử dụng công nghệ RT- PCR chọn giống sạch bệnh để vào mẫu, những cây con in vitro tiếp tục được kiểm tra bằng RT- PCR Kết... SPFMV) Ø Một số chủng virut: Vi rút gây bệnh đốm lá cho cây khoai lang (Sweetpotato chlorotic leaf spot virus); Virut gây nốt sần cho cây khoai lang (Sweetpotato internal cork virus); Virut gây màu nâu đỏ nứt cho cây khoai lang (Sweetpotato russet crack virus); Sweetpotato vein mosaic virus; Vi rút A cây khoai lang (Sweetpotato virus A); Sweetpotato vein clearing virus; Khoai lang bị virut đốm vòng... 8 khoai lang đều sinh trưởng bình thường Về dinh dưỡng, khoai lang cần nhiều nhất kali rồi mới đến đạm và lân Kali cần nhiều từ khi bắt đầu làm củ Đạm cần nhiều trong thời kỳ phát triển thân, lá Lân thúc đẩy hình thành tinh bột của củ 1.2.4 Kỹ thuật trồng và chăm sóc khoai lang Phần lớn các giống khoai lang nổi tiếng, có chất lượng hiện nay là các giống khoai lang cổ truyền ở các vùng, miền Giống khoai. .. thích Khoai lang được sử dụng rất phổ biến trong đời sống hằng ngày và được sử dụng nhiều trong công nghiệp chế biến thực phẩm như sản xuất bột dinh dưỡng cho trẻ em, bột nấu súp, khoai chiên, đồ ăn chay… Các phế phẩm của khoai lang sau khi thu hoạch được sử dụng làm thức ăn chăn nuôi 2 PCR và ứng dụng kỹ thuật PCR trong nghiên cứu di truyền học 2.1 PCR 2.1.1 Định nghĩa Phương pháp PCR (polymerase chain... tiết sinh trưởng thực vật là auxin và cytokinin Tùy vào tỷ lệ hàm lượng 2 nhóm chất này trong môi trường sẽ tạo ra sự phát sinh hình thái khác nhau, có thể nhìn thấy qua một số đường hướng phát sinh hình thái của mô nuôi cấy (Phụ lục 1) 3.3 3.3.1 • - Quy trình sản xuất cây nuôi cấy mô (vi nhân giống) Ý nghĩa của vi nhân giống Đặc điểm ưu việt: Nhân nhanh với hệ số nhân giống cao, đưa ra sản phẩm nhanh. .. các ứng dụng thực tế Có 5 nhóm chất điều hòa quan trọng trong nuối cấy mô thực vật: auxin, cytokinin, gibberillin, abscisic acid và etylen Ø Auxin 29 Auxin là hợp chất có nhân indole, gồm có 2 loại là auxin có nguồn gốc nội sinh do thực vật tạo ra ( IAA) và auxin tổng hợp do con người tạo ra (IBA, NAA, 2,4-D, …) Auxin can thiệp vào nhiều hiện tượng sinh lý, hoạt động của nó tùy thuộc vào nồng độ và. .. lệ sống sót cao, còn ở cường độ ánh sáng thấp, cây cao và xanh nhưng tỉ lệ sống sót thấp hơn 3.5 Ứng dụng của nuôi cấy mô tế bào thực vật trong nuôi cấy các giống khoai lang trên thế giới và ở Việt Nam 3.5.1 Tình hình nuôi cấy giống khoai lang trên thế giới Ø Hướng nghiên cứu tạo cây khoai lang in vitro sạch virus: Năm 1975, Alconero và cộng tác viên đã kết hợp phương pháp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng và. .. hoà sinh trưởng đến sự nuôi cấy đỉnh sinh trưởng và nhân giống khoai lang, Iftekhar Alam và cộng tác viên (2010) đã cho thấy hơn 75% tạo chồi khi sử dụng môi trường MS có bổ sung 2 mg/l KI và 0,5 mg/l GA3 Và các chồi này hình thành trực tiếp thành cây mà không phát triển mô sẹo Ø Vi nhân giống: Nghiên cứu sớm nhất ở cây khoai lang do Yamaguchi và cộng sự công bố vào năm 1974 về tái sinh khoai lang. .. khoai 3 tháng ở Đồng bằng sông Cửu Long, khoai Chiêm Dâu ở các tỉnh miền Trung, khoai Yên Thuỷ Hoàng Long (nhập nội từ Hồ Nam - Trung Quốc), và một số giống khoai mới như: K51, VT1, H-1-2, KL5, KB-1, VĐ1, KB4 Ø Giống dài ngày: Thời gian sinh trưởng trên 120 ngày như: Khoai Lim, Khoai Thuyền, Khoai Nghệ, Khoai ruột tím 15 Ở một số nơi đã đưa vào sử dụng một số giống mới như: VĐ1 (Đồng bằng sông Hồng),... tính với PCR Phát hiện các khiếm khuyết gene Định type các mô Phát hiện các vi sinh vật gây bệnh Recombinant PCR Kỹ thuật footprinting DnaseI HLA ADN (các kháng nguyên bạch cầu người) 2.2 Phương pháp RT- PCR 22 2.2.1 Khái niệm RT- PCR (Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction) là một phương pháp dùng để khuyếch đại cADN được tạo ra từ ARN dựa vào đặc tính phiên mã ngược RT- PCR thường được sử dụng ... thng nh hoc khụng cú Mc hin th triu chng trờn ph thuc tớnh mn cm ca ging cõy trng, giai on phỏt trin v mc c t ca virut Cỏc triu chng trờn c ph thuc chng SPFMV v ging khoai lang Virus cng cú th... mc r ph di t ph thuc vo ging Cn c vo di thõn chớnh ngi ta chia lm hai loi: Loi thõn di khong 2- m , loi thõn ngn: 0,5 -1 m Thõn phỏt trin di ngn ngoi yu t chớnh l ging cũn ph thuc nhiu vo ch... v nhy cỏi, nh c thp hn nhy cỏi ỉQu v ht Qu khoai lang thuc loi qu súc hỡnh trũn mu nõu en, sau th phn mt n hai thỏng thỡ qu chớn v cũn tựy thuc ging v v Mt qu cú t n ht, ht cú v cng, ht d b rng