Ứng dụng kỹ thuật RT - PCR xác định Macrobrachium rosenbergii nodavirus (MrNV) và Extra small virus (XSV) trên tôm càng xanh (Macrobrachium rosenbergii)

Ứng dụng kỹ thuật RT - PCR xác định Macrobrachium rosenbergii nodavirus (MrNV) và Extra small virus (XSV) trên tôm càng xanh (Macrobrachium rosenbergii)

BỘ MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC *****000*****

KHỐ LUẬN TỐT NGHIỆP

ỨNG DỤNG KỸ THUẬT RT-PCR XÁC ĐỊNH Macrobrachium

rosenbergii NODAVIRUS (MrNV) VÀ EXTRA SMALL VIRUS

(XSV) TRÊN TƠM CÀNG XANH (Macrobrachium rosenbergii)

Ngành học: CƠNG NGHỆ SINH HỌC Niên khố: 2001-2005

Sinh viên thực hiện: PHẠM DUY LÃM

Thành Phố Hồ Chí Minh 8/2005

KHỐ LUẬN TỐT NGHIỆP

ỨNG DỤNG KỸ THUẬT RT-PCR XÁC ĐỊNH Macrobrachium

rosenbergii NODAVIRUS (MrNV) VÀ EXTRA SMALL VIRUS (XSV)

TRÊN TƠM CÀNG XANH (Macrobrachium rosenbergii)

Th.S NGƠ XUÂN TUYẾN

Thành Phố Hồ Chí Minh 8/2005

iii

LỜI CẢM ƠN

Em xin chân thành cảm ơn quý thầy cô trường Đại Học Nông Lâm đã tận tình dạy sỗ, truyền đạt kiến thức cho em trong suốt thời gian em học tại trường

Với lòng biết ơn sâu sắc em xin chân thành cảm ơn thầy Nguyễn Văn Hảo, người đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn và giải đáp những vấn đề khó khăn và tạo điều kiện tốt nhất để hoàn thành luận văn tốt nghiệp

Em xin cảm ơn Anh Ngô Xuân Tuyến, chị Trì Thanh Thảo, anh Cao Thành Trung, anh Chu Quang Trọng đã nhiệt tình hướng dẫn, trợ giúp em về nguyên vật liệu, dụng cụ trong suốt thời gian em thực hiện đề tài này

Em xin cảm ơn anh chị làm việc tại Trung Tâm Quốc Gia Quan Trắc Cảnh Báo Môi Trường và Phòng Ngừa Dịch Bệnh Thuỷ Sản Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II, phòng lab DNA TRung Tâm Chẩn Đoán YKhoa Hoà Hảo, các anh chị ở Trại Thực Nghiệm Thủ Đức, đã quan tâm giúp đỡ, tạo điều kiện cho em hoàn thành đề tài này

Bước đầu làm quen với công tác nghiên cứu khoa học, bản khoá luận này không tránh khỏi những khiếm khuyết nhất định, rất mong sự giúp đỡ chỉ bảo cũng như các ý kiến đóng góp của quý thầy cô, anh chị và các bạn sinh viên

Sau cùng, em xin cảm ơn gia đình cùng bè bạn đã quan tâm, giúp đỡ, động viên em hoàn thành tốt đề tài

TpHCM, tháng 8 năm 2005 Sinh viên

Phạm Duy Lãm

iv

TÓM TẮT

Tôm càng xanh là một trong những đối tượng nuôi quan trọng của ngành nuôi trồng thủy sản Ở Châu Á tôm càng xanh được mở rộng và tăng cường nuôi với qui mô công nghiệp ở một số nước như Ấn Độ, Đài Loan, Trung Quốc, Thái Lan, các nước này chiếm sản lượng lớn tôm càng xanh của cả thế giới Sự mở rộng và tăng cường nuôi tôm càng xanh đã làm phát sinh nhiều bệnh mới Một trong những bệnh mới được ghi nhận gần đây xuất hiện trong những bể ương tôm càng xanh gây thiệt hại cho ngành công nghiệp nuôi trồng thủy sản ở Ấn Độ, sau đó xuất hiện ở Đài Loan và 5 tỉnh thuộc Trung Quốc Bệnh này có biểu hiện hơi trắng ở đuôi nên được gọi là “bệnh trắng

đuôi ” Tác nhân gây bệnh chính là phức hợp hai loại virus Macrobrachium rosenbergii nodavirus (MrNV) và Extra small virus (XSV)

Hiện nay, trong các bể ương tôm càng xanh ở Việt Nam xuất hiện dấu hiệu lâm sàng hơi trắng ở đuôi, các bể này có tỷ lệ chết rất cao Để xác định nguyên nhân

gây chết trong các bể ương có phải là do MrNV và XSV gây ra hay không Chúng tôi

tiến hành thử nghiệm qui trình Single - Step PCR của Widada và Sahul Hameed để xác

định có hay không sự hiện diện MrNV và XSV trong mẫu bệnh nghi ngờ là bệnh trắng

đuôi

Những kết quả thử nghiệm qui trình Single - Step PCR mà chúng tôi đạt được có kết quả như sau:

 Xác định được sự hiện diện đồng thời MrNV và XSV trong mẫu tôm thịt

bệnh trắng đuôi được cung cấp từ Ấn Độ bằng qui trình Single - Step RT - PCR

 Khảo sát được hai qui trình tách chiết bằng AquaPure RNA Isolation Kit và

Trizol trên mẫu tôm thịt bệnh trắng đuôi Ấn Độ bằng qui trình Single - StepRT - PCR  Khảo sát được nồng độ mồi của hai virus cho phản ứng Single - Step RT-

PCR là 20 mol cho MrNV và 20 mol cho XSV

 Khảo sát được nhiệt độ lai tối ưu của hai virus cho phản ứng Single - Step PCR là 550C

 Ứng dụng qui trình khảo sát được trên 50 mẫu tôm càng xanh thu từ thực địa, kết quả phát hiện được 6 mẫu tôm mẹ, 1 mẫu tôm postlarvae có sự hiện diện đồng

thời của MrNV và XSV trong mẫu tôm bệnh trắng đuôi

v

ABSTRACT

Freshwater prawn (Macrobrachium rosenbergii) plays an economically important role in aquaculture However, The recent report of new disease in freshwater prawn hatcheries, this disease is responsible for mortalities in hatchery - reared Freshwater Prawn which losses aquaculture industry in India The disease was reported in Guadeloupe and Martinique (India) subsequently in the five provinces of China The clinical sign of disease is whitish appearance of the tail and has given rise to the name “White tail disease” Lately, scientists have been detected a nodavirus - like particles from freshwater prawn suffering from White tail disease (WTD), named

Macrobrachium rosenbergii nodavirus Subsequently a second virus - like particle, named XSV XSV has always been found associated with the MrNV Untill, The

relationships between these two viruses remain unknown Although White tail disease

(WTD) caused by Macrobrachium rosenbergii nodavirus (MrNV) and virus-like

particle (XSV) which hasn’t reported in Viet Nam Therefore In this study, process of Single - Step RT - PCR of Widada and Sahul Hameed et al was use to identify whether this disease existed in Viet Nam

To optimal of Single - Step RT-PCR of Widada and Sahul Hameed et al for the laboratory, positive control from India was used We experimented successful process of Single-Step RT-PCR of Widada and Sahul Hameed The suitable condition for a Single-Step RT-PCR RT-PCR reaction is 1,5 mM Mg2+, 20 mol primer and 550C annealing temperature

Based on this method, 50 samples of freshwater prawn collected in the Thu Duc and other provinces in Mekong Delta were extracted RNA and amplified with two

couples of primer MrNV-RNA2-F, MrNV-RNA2-R for MrNV and XSV-F, XSV-R for XSV Seven samples were confirmed to be infected by MrNV and XSV

In short, MrNV and XSV have been detected in Viet Nam It is essential to

carry out further studies to identify the outbreak conditions and to suggest the treatment methods so that the freshwater prawn farming can be developed

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VÀ SẢN XUẤT GIỐNG TÔM CÀNG XANH TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM 3

2.1.1 Tình hình nghiên cứu sản xuất giống tôm càng xanh trên thế giới 3

2.1.2 Tình hình nghiên cứu sản xuất giống tôm càng xanh ở Việt Nam 3

2.2 MỘT SỐ BỆNH TRÊN ẤU TRÙNG TÔM CÀNG XANH 5

2.3.2 Phương pháp lai Dot-lot 10

2.3.3 Phương pháp lai tại chỗ (in situ hybridization) 11

2.3.4 Phương pháp Sandwich - ELISA (A sandwich enzyme linked immunosorbent assay) 12

2.3.5 Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) 12

2.3.6 Phương pháp RT - PCR (Reverse Transcription Polymerase Reaction) 15

vii PHẦN 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

3.1 NỘI DUNG, THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 18

3.2 VẬT LIỆU 18

3.2.1 Mẫu tôm 18

3.2.2 Mồi sử dụng cho qui trình 18

3.2.3 Hạt Bead RT - PCR: Ready - To - Go (Chế phẩm sử dụng ngay) 19

3.2.4 Bộ Kit AquaPure RNA Isolation Kit 19

3.2.5 Thang DNA X174 RF Hae III (Boehringer Mannheim) 20

3.2.6 Hoá chất khác 20

3.2.7 Dụng cụ và thiết bị 21

3.3 PHƯƠNG PHÁP 21

3.3.1 Phương pháp tách chiết RNA virus 21

3.3.1.1 Tách chiết RNA bằng Trizol 21

3.3.1.2 Tách chiết bằng AquaPure RNA Isolation kit (Bio-Rad) 22

3.3.2 Phương pháp Single - Step RT - PCR trên RNA của MrNV, XSV 22

3.3.3 Phương pháp điện di nucleic acid trên gel agarose 23

3.4 BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM 24

3.4.1 Thử nghiệm qui trình Single - Step RT-PCR phát hiện MrNV, XSV từ mẫu tôm bệnh (chứng dương) được cung cấp từ Ấn Độ 24

3.4.2 Khảo sát một số điều kiện của qui trình Single - Step RT-PCR 24

3.4.2.1 So sánh hai qui trình tách chiết RNA bằng Trizol (Peter Walker) và AquaPure RNA Isolation Kit (Bio-Rad) 24

3.4.2.2 Khảo sát nồng độ mồi 25

3.4.2.3 Khảo sát nhiệt độ lai của mồi 25

3.4.3 Ứng dụng qui trình khảo sát được kiểm tra một số mẫu tôm càng xanh thu thực địa 25

viii PHẦN 4 KẾT QUẢ - THẢO LUẬN

4.1 KẾT QUẢ THỬ NGHIỆM QUI TRÌNH SINGLE - STEP RT - PCR PHÁT

HIỆN MrNV, XSV TỪ MẪU TÔM BỆNH ĐƢỢC CUNG CẤP TỪ ẤN ĐỘ 26

4.2 KẾT QUẢ KHẢO SÁT MỘT SỐ ĐIỀU KIỆN CỦA QUI TRÌNH SINGLE - STEP RT - PCR 27

4.2.1 Kết quả so sánh hai qui trình tách chiết 27

4.2.2 Kết quả khảo sát nồng độ mồi 30

4.2.3 Kết quả khảo sát nhiệt độ lai của mồi 30

4.3 KẾT QUẢ ỨNG DỤNG QUI TRÌNH KHẢO SÁT ĐƢỢC KIỂM TRA MỘT SỐ MẪU TÔM CÀNG XANH THU THỰC ĐỊA 32

PHẦN 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận 36

ix

Danh mục hình và các bảng

Hình 2.1: Biểu hiện bệnh trắng đuôi ở tôm càng xanh 8

Hình 2.2: Vị trí của MrNV trong họ gia đình Nodavirus 8

Hình 2.3: Lai tại chỗ bằng cách sử dụng probes MrNV 11

Hình 2.4: Phương pháp Single - Step RT - PCR để khuếch đại RNA bằng PCR 17

Hình 4.1: Kết quả điện di các sản phẩm khuếch đại từ mẫu tôm càng xanh nhiễm MrNV, XSV 26

Hình 4.2: Kết quả điện di các sản phẩm RT - PCR từ mẫu chứng dương được tách bằng bộ Kit và Trizol 28

Hình 4.3: Kết quả điện di sản phẩm RT-PCR từ mẫu chứng dương ở các nồng độ mồi khác nhau 29

Hình 4.4: Kết quả điện di khảo sát nhiệt độ lai của mồi trên hai virus MrNV, XSV 30

Hình 4.5: Kết quả điện di phát hiện MrNV và XSV trên một số mẫu tôm càng xanh 33

Hình 4.6: Kết quả điện di mẫu tôm mẹ thu tại Trại Thực Nghiệm Thủ Đức 34

Biểu đồ 2.1: Số lượng trại giống và sản lượng tôm càng xanh ở ĐBSCL từ 1999 - 2003 .4

Bảng 3.1: Các mồi sử dụng cho phản ứng RT- PCR 18

Bảng 3.2: Thang DNA X174 RF Hae III 20

Bảng 3.3: Thành phần hai Mix sử dụng Single - Step RT - PCR 22

Bảng 3.4: Bảng khảo sát nhiệt độ lai của các mồi 25

Bảng 3.5: Các loại mẫu tôm càng xanh thu ở các giai đoạn khác nhau 25

Bảng 4.1: Kết quả điện di các sản phẩm RT - PCR được tách chiết bộ Kit và Trizol 28

Bảng 4.2: Kết quả biểu hiện tín hiệu của sản phẩm của hai dãy nhiệt độ 31

Bảng 4.3: Kết quả thực hiện phản ứng RT - PCR trên 50 mẫu tôm càng xanh 35

x

Danh mục các từ viết tắt

DNA: Deoxyribonucleic acid

ss-DNA: Single strand - Deoxyribonucleic acid RNA: Ribonucleic acid

mRNA: Messenger ribonucleic acid

cDNA: Complementary deoxyribonucleic acid Bp: Base pair (cặp base)

dATP: 2’-deoxyadenosine-5’-triophosphate dCTP: 2’-deoxycytosine-5’-triophosphate dGTP: 2’-deoxyguanine-5’-triophosphate dTTP: 2’-deoxythymine-5’-triophosphate UV: Ultra Violet- tia cực tím

DIG: Digoxigenin DEPC: Diethyl Prycacbonat

ĐBSCL: Đồng Bằng Sông Cửu Long FAO: Food and Agrculture Organization

NoV: Nodamura virus BoV: Boolaara virus

AhNNV: Atlantic halibut nervous necrosis virus GGNNV: Greasy grouper nerous necrosis virus SJNNV: Striped jack nervous necrosis virus PaV: Pariacoto virus

MrNV: Macrobrachium rosenbergii nodavirus

XSV: Extra small virus

PCR: Polymerase Chain Reaction

RT-PCR: Reverse Transcription Polymerase Reaction RFLP: Restriction fragment lenght polymorphism

S - ELISA: A sandwich enzyme linked immunosorbent assay Tm: Nhiệt độ lai của mồi

PHẦN 1 MỞ ĐẦU

1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ

Kể từ năm 1990 đến nay, bên cạnh sự phát triển của nghề nuôi tôm sú thì tôm

càng xanh (Macrobrachium rosenbergii) được xác định là một trong những đối tượng

nuôi thủy sản quan trọng đối với thủy vực nước ngọt Việt Nam, đặc biệt là Đồng Bằng Sông Cửu Long, với lợi thế có diện tích mặt nước ngọt gần 600.000 ha, nhiều sông ngòi, kênh rạch, ao, vườn, ruộng ĐBSCL được xem là vùng có tiềm năng rất lớn cho nghề nuôi tôm càng xanh Ở các tỉnh Trà Vinh, Bến Tre, Vĩnh Long, An Giang và Cần Thơ là những tỉnh có nghề nuôi tôm càng xanh phát triển Theo số liệu thống kê của Bộ Thủy Sản năm 1999, ĐBSCL có 6000 ha diện tích nuôi tôm càng xanh với tổng sản lượng trên 2500 tấn và đến 2002 sản lượng tôm càng xanh đã tăng nhanh đáng kể với tổng sản lượng lên đến 10.000 tấn (Bộ Thủy Sản, 2003) Tuy nhiên, trở ngại lớn nhất hiện nay đối với nghề nuôi tôm càng xanh ở nước ta nói chung và ĐBSCL nói riêng là vấn đề con giống Từ lâu, người nuôi vẫn quen sử dụng nguồn giống tự nhiên được thu gom từ sông rạch, vì thế nguồn giống ngày càng khan hiếm, chất lượng không đảm bảo Do đó, đã có nhiều công nghệ sản xuất giống tôm càng xanh được đẩy mạnh như: công nghệ sản xuất giống tôm càng xanh trong ao đất ở vùng nhiễm mặn, sản xuất giống nước xanh và nước xanh cải tiến ở vùng nội đồng, sản xuất tôm càng xanh toàn đực bằng con cái giả thông qua kỹ thuật vi phẫu

Sau những thành công của các công nghệ sản xuất giống, nối tiếp là hàng loạt những trang trại sản xuất giống nuôi thâm canh ra đời, sự khai khác tối đa nguồn nước tự nhiên, sự đáp ứng không đủ về mặt năng lực chuyên môn, nghiêm trọng hơn là áp dụng mô hình nuôi bừa bãi dẫn đến sự giảm thiểu về môi trường, phá vỡ môi trường sinh thái làm phát triển nhanh chóng sự lây lan dịch bệnh Trong số những tác nhân gây bệnh tìm thấy trên tôm nuôi, virus là một tác nhân quan trọng nhất gây nên sự bùng nổ dịch bệnh (Lightner, 1993)

Một trong những virus được ghi nhận gần đây xuất hiện đầu tiên ở Ấn Độ (Arcier và cộng sự, 1999) gây thiệt hại nghiêm trọng trên các đàn postlarvae ở các trại sản xuất giống (Bonami và cộng sự, 2005), tỷ lệ chết lên đến 100% (Vijayan và cộng

sự, 2003) Bệnh do hai loại virus là Macrobrachium rosenbergii nodavirus (MrNV)

(Vijayan và cộng sự, 2003) và Extra small virus (XSV)(Qian và cộng sự, 2003) gây bệnh trắng đuôi (White tail disease)

Ở Việt Nam chưa tìm thấy một công bố nghiên cứu nào về hai loại virus trên nhiễm trên tôm càng xanh Chính vì vậy được sự đồng ý của Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học và Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II, chúng tôi tiến hành đề tài “ Ứng

dụng kỹ thuật RT - PCR xác định Macrobrachium rosenbergii nodavirus (MrNV) và Extra small virus (XSV) trên tôm càng xanh (Macrobrachium rosenbergii) ” với:

Mục đích

 Xác định sự hiện diện hai loại virus MrNV và XSV trên tôm càng xanh

bằng kỹ thuật RT-PCR

Nội dung nghiên cứu

 Thử nghiệm qui trình Single - Step RT - PCR phát hiện MrNV, XSV

từ mẫu chứng dương được cung cấp từ Ấn Độ

 Khảo sát một số điều kiện của qui trình Single - Step RT - PCR

 Ứng dụng qui trình khảo sát được kiểm tra sự hiện diện MrNV, XSV ở

một số mẫu tôm càng xanh thu thực địa

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VÀ SẢN XUẤT GIỐNG TÔM CÀNG XANH TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM

2.1.1 Tình hình nghiên cứu sản xuất giống tôm càng xanh trên thế giới

Tôm càng xanh (Macrobrachium rosenbergii) là một loài có giá trị kinh tế

cao trong nghề nuôi thủy sản nước ngọt Theo số liệu thống kê của FAO năm 1998, Đài Loan 14.000 tấn (1991), Thái Lan 10.000 tấn Đến năm 2002 Trung Quốc chiếm 58% về sản lượng tôm càng xanh của thế giới

Vì tôm càng xanh mang lại lợi nhuận cao, dễ nuôi, ít bị bệnh hơn so với các loại tôm nuôi khác nên từ lâu đã có nhiều công trình nghiên cứu về nuôi và ngày càng hoàn thiện về quy trình kỹ thuật nuôi (Nguyễn Thị Thanh Thủy, 2000) Sau thành công của Ling (1969) về sinh sản nhân tạo tôm càng xanh ở Malaysia Năm1972, Fujimura và Okamoto đã cải tiến thành công phương pháp sản xuất tôm càng xanh đại trà Năm 1974, cũng Fujimura đưa ra qui trình nước xanh Sau đó hàng loạt các tác giả khác đã cố công nghiên cứu việc sinh sản nhân tạo và phát triển nuôi chúng như Adisukressno (1980), Liao (1980), Malecha (1980), Sandifer (1977), Smith (1879) (Trần Thanh Phục, 2001) Hiện nay, trên thế giới có ba qui trình sản xuất giống tôm càng xanh đã được phổ biến là qui trình nước trong hở (clear open water system), qui trình nước trong kín (clear closed water system), và qui trình nước xanh (green water system) (Nguyễn Việt Thắng, 1993)

2.1.2 Tình hình nghiên cứu sản xuất giống tôm càng xanh ở Việt Nam

Ở Việt Nam tôm càng xanh cũng được nghiên cứu từ năm 1974, sau năm 1980 tiếp tục được nghiên cứu tại Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II Đến năm 1982, Trung Tâm Nghiên Cứu Sản Xuất Tôm Vũng Tàu (Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II) đã cho tôm càng xanh sinh sản nhân tạo thành công (Phạm Văn Tình, 2000)

Từ 1987-1992, Trung Tâm Nghiên Cứu Sản Xuất Tôm Vũng Tàu đã sản xuất tổng cộng được 2.1 triệu postlarvae (Trần Thanh Phục, 2001)

Ngoài ra còn nhiều tác giả: Trần Đức Can (1987), Phan Hữu Đức (1988), Nguyễn Quang Ly (1988), Nguyễn Việt Thắng (1995), Phạm Văn Tình (1999) đã nghiên cứu về đặc điểm sinh học, vùng phân bố, mùa vụ sinh sản của tôm càng xanh, cũng như kỹ thuật sản xuất giống và nuôi tôm càng xanh thương phẩm ở các thủy vực ao, đầm, ruộng, lúa và mương vườn (Trần Thanh Phục, 2001)

Nguyễn Việt Thắng (1993), đã khảo nghiệm một số qui trình sản xuất giống tôm càng xanh và đạt kết quả khả quan: quy trình nước trong hở đạt tỷ lệ sống trung bình 35,46% (10,5% - 66%), ương với mật độ từ 60 - 100 ấu trùng/l; quy trình nước trong tuần hoàn kín đạt tỷ lệ sống trung bình 38,67% với mật độ 60 - 110 ấu trùng/l và quy trình nước xanh đạt tỷ lệ sống trung bình 40,16% với mật độ 40 - 55 ấu trùng/l

Năm 1997, Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II đã chuyển giao thành công các công nghệ sản xuất giống và nuôi tôm càng xanh thương phẩm ở một số tỉnh phía Nam như: Cần Thơ, Trà Vinh, Vĩnh Long, TPHCM (Nguyễn Việt Thắng, 1997)

Biểu đồ 2.1: Số lượng trại giống và sản lượng tôm càng xanh ở ĐBSCL từ năm

1999- 2003 (Đại Học Cần Thơ, 2003; trích từ Bộ Thủy Sản, 2004)

Từ năm 1998 đến nay, Viện Hải Sản - Trường Đại Học Cần Thơ đã tiến hành nghiên cứu ương nuôi ấu trùng tôm càng xanh theo mô hình “nước xanh cải tiến” và đang triển khai ứng dụng tại một số tỉnh như: Tiền Giang, Bến Tre, Trà Vinh, An Giang (Trần Ngọc Hải, 2000)

Từ 1999 - 2003, số lượng trại sản xuất giống cũng như sản lượng tôm giống sản xuất ở ĐBSCL không ngừng gia tăng theo thời gian, năm 2003 có 97 trại giống tăng 95 trại so với năm 1999 và tổng sản lượng tôm giống sản xuất được trong năm 2003 là 76.5 triệu con (Đại Học Cần Thơ, 2003; trích từ Bộ Thủy Sản, 2004)

2.2 MỘT SỐ BỆNH XẢY RA TRÊN ẤU TRÙNG TÔM CÀNG XANH 2.2.1 Bệnh hoại tử cơ cá thể (Idiopathic Muscle Necrosis-IMN)

Bệnh hoại tử cơ đó là nguyên nhân gây tử vong hàng loạt cho tôm ấu trùng trong trại giống Nash và cộng sự (1987) đã báo cáo rằng bệnh hoại tử cơ là nguyên nhân gây tử vong nhanh chóng đến 60% số hậu ấu trùng 28 ngày tuổi trong hệ thống ương tôm thâm canh ở Thái Lan Bệnh này biểu hiện với nhiều điểm trắng lan rộng trên cơ (Akiyama và cộng sự, 1982; Nash và cộng sự, 1987; Brock, 1988)

2.2.2 Bệnh giữa chu kỳ ấu trùng (Larvae Mid Cycle Disease-MCD)

Bệnh này thường xảy ra trong các giai đoạn ấu trùng từ IV-XI Anderson và cộng sự (1990) đã báo cáo hiện tượng tử vong hàng loạt ấu trùng tôm càng xanh ở Malaysia khoảng 16 ngày sau khi nở Bệnh này tương tự như bệnh hoại tử do vi khuẩn Ấu trùng bỏ ăn và những cá thể bệnh sẽ bị các con khỏe ăn thịt Ấu trùng nhiễm bệnh thường có màu xám xanh lơ, bơi lội yếu ớt và thường bơi theo hình xoắn ốc Nguyên nhân gây bệnh vẫn chưa xác định được nhưng có lẽ do nhiễm tự nhiên

Nguyên nhân có thể là vi khuẩn Enterobacter aerogenes (vi khuẩn sinh bọt khí trong

đường ruột) (Johnson, 1978; Brock, 1988)

2.2.3 Bệnh hoại tử do vi khuẩn

Triệu chứng cấp tính của bệnh này là ấu trùng chuyển sang màu xanh lơ nhạt, dạ dày rổng, ấu trùng chìm xuống đáy bể và có những chấm nâu trên râu và các phụ bộ mới hình thành Các quan sát cho thấy có sự nhiễm phức hợp vi khuẩn dạng sợi

Leucothix spp, trực khuẩn và cầu khuẩn trên các tơ lông, mang, và các phụ bộ Ấu

trùng càng nhỏ thì bệnh càng nghiêm trọng Theo tạp chí Aquacop (1977) cho biết bệnh này ảnh hưởng đến ấu trùng tôm càng xanh (giai đoạn IV-V) ở Tahiti dẫn đến tử vong 100% trong 48 giờ

2.2.4 Bệnh phát sáng

Ấu trùng ở giai đoạn nhỏ rất mẫn cảm đối với bệnh do Vibrio harveyi gây

ra Bệnh này rất phổ biến trong các trại giống đối với tôm càng xanh nước ngọt và tôm biển Biểu hiện của bệnh này là sự phát sáng có thể quan sát dễ dàng vào ban đêm Ấu trùng nhiễm bệnh bị đóng rong, đục cơ và bơi lội chậm chạp, cắn xé nhau, tỷ lệ chết

100% Vi khuẩn phát sáng (Vibrio harveyi) ở Thái Lan đã được phân lập được trên

tôm ấu trùng càng xanh được xem là loại bệnh khá phổ biến (Tonguthai,1997)

2.2.5 Bệnh lột xác dính vỏ

Bệnh này ảnh hưởng đến các giai đoạn hậu ấu trùng và các giai đoạn đầu của hậu ấu trùng gây tử vong khi tôm lột xác Ấu trùng nhiễm bệnh không thể rút các phụ bộ, mắt hoặc chủy ra khỏi vỏ lột Nếu thoát ra được vỏ lột thì phụ bộ bị dị tật và không lâu sau thì chết (Brock, 1983, 1988) Sự tử vong do bệnh này thường không nghiêm trọng Nguyên nhân của bệnh vẫn chưa biết nhưng chất lượng nước kém hoặc dinh dưỡng thiếu có khả năng dẫn đến bệnh

hiệu quả và an toàn trong việc trị bệnh Zoothamnium trên ấu trùng ( Roegge và cộng

sự,1979)

2.2.7 Bệnh virus

Anderson và cộng sự (1990) đã báo cáo một loại Parvo - like virus ở hậu ấu trùng tôm càng xanh trong các trại giống ở Malaysia Đây là loại virus được báo cáo đầu tiên trên tôm càng xanh Hậu ấu trùng bị nhiễm virus với triệu chứng như sự mờ đục ở các mô, gây hoại tử cơ

2.2.8 Bệnh trắng đuôi

Bệnh trắng đuôi (White tail disease ) gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến đàn ấu

trùng Tác nhân gây bệnh chính là phức hợp hai loại virus Macrobrachium rosenbergii nodavirus (MrNV) và Extra small virus (XSV)

Sự mở rộng và tăng cường nuôi trồng thủy sản nhiều và nhiều bệnh mới sẽ xuất hiện Những báo cáo gần đây về bệnh trắng đuôi (White tail disease) xuất hiện trong những bể ương tôm càng xanh và những trang trại vừa gây thiệt hại cho ngành công nghiệp nuôi trồng thủy sản ở Ấn độ Thông tin này được đưa ra từ hội nghị “Freshwater Prawn 2003 International Symposium” ở Cochin (Ấn Độ) (Sahul Hameed, 2003)

Bệnh được ghi nhận đầu tiên ở Guadeoupe năm 1997 (Arcier và cộng sự,1999) sau đó ở Martinique (Ấn Độ), Đài Loan (Tung và cộng sự, 1999) và 5 tỉnh khác thuộc Trung Quốc (Qian và cộng sự, 2003)

Trong những bể ương tôm càng xanh bị nhiễm bệnh, dấu hiệu chủ yếu của đàn hậu ấu trùng (postlarvae) là lờ đờ, biếng ăn và mờ đục ở vùng cơ đuôi Trong những trường hợp bệnh nặng sự mờ đục khắp cơ thể và dẫn đến thoái hoá phần phụ bộ đuôi Khoảng 2 - 3 ngày, tỷ lệ chết lên đến 100% Tôm bệnh có dấu hiệu hơi trắng ở đuôi nên được gọi là “bệnh trắng đuôi ” (Sahul Hameed, 2003; Salin và Nair, 2003; Vijayan và cộng sự, 2003)

Khi làm thí nghiệm cảm nhiễm virus gây bệnh trắng đuôi vào tôm postlarvae và tôm trưởng thành, các nhà khoa học nhận thấy dấu hiệu bệnh và tỷ lệ chết ở tôm postlarvae cảm nhiễm giống như tôm postlarvae được nghi ngờ là bệnh trắng đuôi trong tự nhiên Nhưng ở tôm trưởng thành khi cảm nhiễm có những dấu hiệu như vùng đầu ngực phình to chứa đầy chất lỏng (Sahul Hameed và cộng sự, 2004) Tuy nhiên dấu hiệu lâm sàng hơi trắng ở đuôi không là dấu hiệu đặc trưng cho bệnh trắng đuôi ở giai đoạn sớm của postlarvae (Yoganadhan và cộng sự, 2005)

Khi quan sát tổ chức học trên mẫu tôm bệnh cho thấy sự hiện diện các thể

virus có kích thước nhỏ (25 nm - 30 nm) (Tung và cộng sự, 1999) Theo Acier và cộng

sự (1999) bệnh này gây bởi nodavirus - like virus được đặt tên là Macrobranchium rosenbergii nodavirus (MrNV) Một dạng virus khác được phát hiện là cộng hưởng với Macrobranchium rosenbergii nodavirus (MrNV) là Extra small virus (XSV) (Qian và

cộng sự, 2003)

Hai virus Macrobrachium rosenbergii nodavirus (MrNV) và Extra small

virus (XSV) vừa được tìm thấy liên quan đến bệnh trắng đuôi (Bonami và Widada, 2003) Hiện nay chưa có một biện pháp điều trị nào cho bệnh trắng đuôi Vì vậy, các nông trại và bể ương phải được quản lý tốt để giảm thiểu sự lan rộng của bệnh trắng đuôi

Hình 2.1: Biểu hiện bệnh trắng đuôi ở tôm càng xanh

MrNV có dạng lập thể 20 mặt (icosaherdral), trần không có vỏ bọc, thường định

vị trong tế bào chất của tế bào chủ, phát triển trong tất cả các bộ phận của tôm càng

xanh bị bệnh ngoại trừ gan và tụy tạng, MrNV có kích thước lớn hơn XSV và có

đường kính 20 - 30 nm được quan sát trong kính hiển vi điện tử (Acier và cộng

sự,1999) MrNV có vật liệu di truyền là hai sợi đơn RNA (RNA -1 và RNA - 2), với

kích thước tương ứng là 2,9 kb và 1,3 kb, và tham gia cấu trúc capsid với một chuỗi polypeptide có kích thước 43 kDa Dựa vào đặc tính và kết quả giải trình tự đoạn

RNA1 của MrNV, Bonami và cộng sự (2005) đề nghị MrNV là thành viên của họ Nodaviridae, nhưng khác biệt với hai loài Alphanodavirus và Betanodavirus

Hình 2.2: Vị trí của MrNV trong họ gia đình Nodavirius (Bonami và cộng sự, 2005)

Họ Nodaviridae chia làm hai nhóm: Alphanodavirus gây bệnh chủ yếu cho côn trùng và Betanodavirus gây nhiễm cho cá Thể virus này không có màng bao, hình đa

mặt, đường kính 25 - 30 nm, bộ gen gồm hai sợi RNA(+) đơn Trong đó, RNA - 1 (3,1 kb) mã hoá cho một protein không cấu trúc có kích thước 100 kDa với chức năng như là RNA polymerase RNA - 2 (1,4 kb) mã hoá cho hai phân tử protein vỏ lớn có kích thước lớn khoảng 43 kDa và 41 kDa được hình thành do quá trình đồng sao chép một chuỗi polypeptide Một RNA - 3 cũng được phát hiện trong các tế bào bị nhiễm nhưng không tồn tại trong thể virus Hiện nay, sản phẩm của RNA phụ này (0,4 kb) vẫn chưa xác định chức năng (Mori và cộng sự, 1992)

XSV là một satellite virus có kích thước nhỏ hơn virus MrNV với đường kính

15 nm, có vật liệu di truyền là RNA với chiều dài khoảng 0,8 - 0,9 kb (Qian và cộng sự, 2003) Sau khi giải trình tự bộ gen của XSV cho thấy virus có chiều dài sợi đơn RNA dài 796 nucleotide và đuôi ngắn poly (A) khoảng 15 - 20 nucleotide kết thúc ở đầu 3’(GenBank acc.no.AY247793) Phân tích protein bằng SDS - PAGE cho thấy thể XSV chứa hai polypeptide là capsid 17 kDa (CP - 17) và capsid 16 kDa (CP - 16) (Qian và cộng sự, 2003) So sánh trình tự của CP - 17 của XSV với cấu trúc protein của họ satellite virus đã biết từ trước, kết quả cho thấy có sự khác biệt rất xa với họ satellite virus (Ban,1995; Zhang và cộng sự, 1991)

Sự hiện diện đồng thời của XSV và MrNV trong bệnh trắng đuôi đặt ra giả

thuyết là vai trò mỗi virus như thế nào trong việc phát triển cũng như trong sự phát

SjNNV

AhNNV GNNV

sinh mầm bệnh Theo Widada và Bonami (2004) giả thuyết rằng XSV không có gen mã hoá cho RNA polymerase Vậy yếu tố nào cung cấp và cần cho XSV cộng hưởng Hay XSV cộng hưởng và làm giảm mức độ nghiêm trọng của bệnh Sự cộng hưởng này ít thấy trong những virus Những virus cộng hưởng (dependovirus) này vừa được biết trong khoảng thời gian gần đây (Van Regenmortel và cộng sự, 2000), và chúng phụ thuộc vào hiệu quả sự sao chép của những virus giúp đỡ (helper virus) như adenovirus hoặc herpes virus Những virus giúp đỡ này có đường kính 20 nm, có vật liệu di truyền là ss - DNA (4,7 kb), chứa một gen DNA polymerase Một nhóm virus khác là thể satellite virus, nhóm virus này thì sống sót khi thiếu một gen polymerase cần cho sự sao chép của chúng (Van Regenmortel và cộng sự, 2000) Điều này cho

thấy là XSV sử dụng enzym RNA polymerase của MrNV nhưng XSV sẽ mã hoá một chức năng cần thiết cho sự phát triển của MrNV hay làm phát sinh thêm mầm bệnh của MrNV thì không biết được (Widada và Bonami, 2004) Nhưng XSV thiếu một

enzym sao chép thì XSV thật sự là một satellite virus (Widada và Bonami, 2004) XSV liên quan gần phân nhóm 2 (tobacoo nercrosis satellite virus - like) hơn là phân nhóm 1 (chronic bee - paralysis associated satellite virus - like) của satellite virus Đến bây giờ các nhà khoa học chỉ quan sát được những satellite virus trong những ký chủ là thực vật XSV là kiểu virus satellite đầu tiên được báo cáo là gây bệnh trong động vật XSV cũng được ghi nhận là satellite-nodavirus cộng hưởng đầu tiên (Widada và Bonami, 2004)

2.3 NHỮNG PHƯƠNG PHÁP DÙNG TRONG CHẨN ĐOÁN BỆNH ĐUÔI TRẮNG DO VIRUS GÂY RA TRÊN TÔM CÀNG XANH

2.3.1 Phương pháp mô học

Mẫu phải được cố định trong Davidson trong 24 giờ Cắt thành từng lát mỏng rồi đặt trên lam kính, nhuộm bằng Pryonin methyl green, đậy lam và quan sát tiêu bản trên kính hiển vi thấy thể vùi của virus có hình mắt lưới trong mô tế bào kế cận của tất

cả các cơ quan và các mô (Tung và cộng sự, 1999) Thể vùi của virus MrNV nằm

trong nhân tế bào hồng cầu bắt màu xanh với thuốc nhuộm Pryonin methyl green (Tung và cộng sự, 1999)

2.3.2 Phương pháp lai Dot - blot

Probe sử dụng trong phương pháp lai Dot - blot là một đoạn DNA thu được

từ RNA - 1 của MrNV Đoạn DNA được đánh dấu bằng phương pháp PCR với tác

nhân digoxygenine Probe này lai với đoạn RNA - 1 từ mô bị nhiễm hoặc từ dịch chiết virus Mỗi mẫu (1 l) là mỗi điểm trên màng lai Sau khi qua các công đoạn xử lý bằng dung dịch lai (hybridization) và tiền lai (prehybridization), mẫu dò được thêm vào để quá trình lai xảy ra, rửa phần mẫu dò không lai ra khỏi màng lai Tiếp đó thêm vào phản ứng kháng thể kháng DIG (anti digoxygenine antibody) có gắn enzyme alkaline phosphatase, ở quá trình này nếu có sự hiện diện của mẫu dò thì kháng thể sẽ kết hợp với mẫu dò Cuối cùng loại bỏ phần kháng thể không phản ứng và thêm cơ chất của enzyme alkaline phosphatase để thực hiện phản ứng tạo màu ngay trên màng

lai Phản ứng dương tính (tạo màu) chỉ xảy ra khi có RNA của MrNV trên màng lai

(Widada và cộng sự, 2003)

2.3.3 Phương pháp lai tại chỗ (in situ hybridization)

Mẫu tôm càng xanh được cố định Davidson và đưa vào trong paraffin Mẫu tôm được cắt khoảng 7 m và được đặt trên lam kính và được làm khô trong tủ sấy ở (600C) Lát cắt qua nhiều bước xử lý, cho lai với mẫu dò DNA được đánh dấu digoxigenin có gắn Alkaline phosphatase (AP), Anti - Digoxigenin sẽ kết hợp với Digoxigenin theo nguyên tắc phản ứng kháng nguyên - kháng thể Sau bước này những phân tử lai đặc hiệu giữa DNA/RNA của mẫu đính trên lame và mẫu dò được gắn thêm Anti - DIG kết hợp với enzyme Alkaline phosphatase Sau bước rửa Anti - DIG thừa và nhuộm màu, quan sát dưới kính hiển vi thấy những tế bào kết tủa màu tím

đen, màu này cho biết sự hiện diện tương ứng RNA của MrNV, mẫu âm tính có màu

vàng cam sau quá trình lai Việc kết tủa đã được quan sát trong tế bào chất, vài phản ứng dương thì cũng được quan sát xung quanh vùng cơ hoại tử Không có dấu hiệu của virus được quan sát trong mang, gan, tụy tạng hoặc biểu mô ống tiêu hoá và biểu bì cơ (Widada và cộng sự, 2003)

Hình 2.3: Lai tại chỗ bằng cách sử dụng probes MrNV (Widada và cộng sự, 2003)

Hình a: tổng thể phần đầu ngực của tôm postlarvae bị nhiễm MrNV

Phần 1a: vùng mang không bị nhiễm có màu vàng cam

Phần 2a: vùng đầu ngực bị nhiễm MrNV có màu tím đen

Phần 3a: vùng tụy tạng không bị nhiễm có màu vàng cam Hình b: lai dương tính với những sợi cơ

phần 1b: vùng cơ bị nhiễm MrNV có màu tím đen

2.3.4 Phương pháp Sandwich - ELISA (A sandwich enzyme linked immunosorbent assay)

Kỹ thuật này phát triển bởi Romestand và Bonami (2003) để chẩn đoán bệnh

trắng đuôi của tôm càng xanh, nguyên nhân gây ra bởi MrNV Kháng thể đa dòng sản

xuất bằng gây sự miễn dịch trên chuột Balb/C và sau đó tinh sạch dung dịch nổi của

virus và kháng thể kháng MrNV, dịch nổi chứa kháng thể kháng MrNV được tinh sạch

từ dịch tràng ở màng bụng của chuột Kháng thể đầu tiên bắt kháng nguyên và kháng thể thứ hai có gắn cơ chất, dưới tác dụng của enzym avidin - peroxidase conjugate phản ứng với cơ chất tạo màu, sự tạo màu này cho thấy phản ứng xảy ra Đây là một phương pháp chẩn đoán bệnh trắng đuôi nhanh, độ đặc hiệu và độ nhạy cao

2.3.5 Phương pháp PCR

2.3.5.1 Nguyên tắc của phương pháp PCR 2a

3a 1a

1b

Phương pháp PCR do Karl Mullis và cộng sự phát minh năm 1985 cho phép làm tăng bội DNA cần được nghiên cứu PCR được thực hiện in vitro theo con đường enzyme (Bùi Trang Việt, 2002)

Tất cả các DNA polymerase khi hoạt động tổng hợp một mạch DNA mới từ mạch khuôn đều cần hiện diện của những mồi chuyên biệt Mồi là những đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn và DNA polymerase sẽ nối dài mồi để hình thành mạch mới Phương pháp PCR đã được hình thành dựa vào cấu trúc đặc tính đó của các DNA polymerase Thực vậy, nếu ta cung cấp hai mồi chuyên biệt bắt cặp bổ sung với hai đầu của một trình tự DNA, ta sẽ chỉ tổng hợp đoạn DNA nằm giữa hai mồi Điều đó có nghĩa là để khuếch đại một trình tự DNA xác định, ta phải có thông tin tối thiểu về trình tự đó đủ để tạo các mồi bổ sung chuyên biệt, các mồi này gồm mồi xuôi (sens primer), mồi ngược (antisnes primer)

2.3.5.2 Phản ứng PCR

Phản ứng PCR là một chuỗi những chu kỳ nối tiếp nhau Mỗi chu kỳ gồm ba bước: Bước 1: giai đoạn biến tính (denaturation), trong một dung dịch phản ứng bao gồm các thành phần cần thiết cho sự sao chép, phân tử DNA được biến tính cao hơn Tm của phân tử; thường là 94 - 950

C trong 30 - 60 giây Mạch đôi DNA tách thành mạch đơn

Bước 2: giai đoạn lai (anealation) nhiệt độ được hạ thấp hơn Tm của các mồi, cho phép các mồi bắt cặp với mạch khuôn Trong thực nghiệm nhiệt độ này dao động trong khoảng 40 - 700C, tùy thuộc Tm của các mồi sử dụng và kéo dài từ 30 - 60 giây

Bước 3: giai đoạn tổng hợp (elongation), nhiệt độ được tăng lên 720C giúp cho DNA polymerase (polymerase chịu nhiệt) hoạt động tổng hợp tốt nhất Thời gian của bước này tùy thuộc vào độ dài trình tự DNA cần khuếch đại, thường kéo dài từ 30 giây đến nhiều phút

Một phản ứng PCR không vượt quá 50 chu kỳ Vì phản ứng PCR diễn tiến qua hai giai đoạn, trong giai đoạn đầu số lượng bản sao tăng theo cấp số nhân, tỷ lệ với lượng mẫu ban đầu, sau đó kết quả khuếch đại giảm hẳn nên số chu kỳ cho một phản ứng tuỳ thuộc vào số lượng bản mẫu ban đầu

2.3.5.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng PCR

DNA mẫu:

Phản ứng khuếch đại tối ưu xảy ra trên DNA thật tinh sạch, nhiều kỹ thuật chẩn đoán bằng PCR vẫn đạt kết quả tốt với DNA thu nhận trực tiếp từ dịch chiết tế bào Ngoài ra phương pháp PCR còn có một số ưu điểm là có thể khuếch đại cả những mẫu DNA không được bảo quản tốt

Enzyme

Taq - polymerase chịu nhiệt được tách chiết từ vi khuẩn suối nước nóng Thermus aquaticus Enzym này không bị phá huỷ bởi nhiệt biến tính và xúc tác sự tổng hợp từ đầu đến cuối quá trình phản ứng Tth polymerase là một enzym tách chiết từ Thermus thermophilus, có khả năng hoạt động như một enzym phiên mã ngược khi

có mạch RNA khuôn và ion Mn++, nhưng với sự hiện diện của của DNA khuôn và ion Mg++, Tth - polymerase lại xúc tác cho phản ứng khuếch đại DNA Enzym này cho

phép khuếch đại bản mẫu là RNA thông qua sự hình thành cDNA

Nồng độ enzyme tối ưu trong khoảng 1 -> 5 đơn vị trên một phản ứng

Mồi và nhiệt độ lai:

Mồi là chỉ tiêu quan trọng để đạt được sự khuếch đại đặc trưng, chuyên biệt và có đặc hiệu cao Việc chọn mồi phải tuân theo một số nguyên tắc:

 Trình tự của mồi được chọn sao cho không thể có sự bắt cặp bổ sung giữa mồi “xuôi” và mồi “ngược”, cũng không có những cấu trúc kẹp tóc do sự bắt cặp khác nhau của một mồi

 Nhiệt độ nóng chảy của mồi “xuôi” và mồi “ngược”, không cách nhau quá xa Thành phần nucleotide của các mồi cân bằng, tránh các cặp G - C lặp lại quá nhiều lần

 Các mồi chọn cần phải đặc trưng cho trình tự DNA cần khuếch đại, không trùng với trình tự lặp lại trên gen

 Trình tự nằm giữa mồi “xuôi” và mồi “ngược” không quá lớn, phản ứng PCR sẽ tối ưu trên những trình tự nhỏ hơn 1kb

2.3.5.4 Các thành phần khác của phản ứng PCR

Bốn loại nucleotide thường được sử dụng ở nồng độ 20 - 200 M/mỗi nucleotide Nồng độ cao hơn dễ dẫn đến sự khuếch đại “ký sinh” Sự mất cân bằng trong các thành phần trong thành phần các nucleotide lại làm tăng các lỗi sao chép của polymerase

Mg2+ là cofactor cho hầu hết các DNA polymerase, đặc biệt là các DNA polymerase chịu nhiệt Nồng độ Mg2+ ảnh hưởng mạnh tới quá trình chạy PCR Nồng độ Mg2+ quá thấp (< 0,5 mM) sẽ làm giảm phản ứng kéo dài mạch DNA do hoạt động

của Taq polymerase bị ức chế Nồng độ Mg2+ quá cao tuy ổn định mạch kép DNA nhưng lại hạn chế sự biến tính hoàn toàn sản phẩm trong mỗi chu kỳ dẫn đến giảm sản phẩm cuối cùng Quá thừa Mg2+ dẫn đến sự bắt cặp sai giữa mồi và khuôn, kết quả là tạo ra nhiều sản phẩm không đặc hiệu Nồng độ tối ưu Mg2+

phải được xác định cho từng phản ứng qua nhiều thử nghiệm

2.3.5.5 Số lượng chu kỳ phản ứng PCR

Trong thực tế sử dụng, số lượng chu kỳ phản ứng PCR không vượt quá 40 chu kỳ do sự phân hủy và cạn kiệt các thành phần của phản ứng, sự xuất hiện các sản phẩm phụ ức chế phản ứng, các bản sao vừa được tổng hợp thường có khuynh hướng kết hợp với nhau, kết quả là hiệu quả khuếch đại càng về sau càng giảm vì những nguyên nhân sau:

 Sự phân huỷ cạn kiệt các thành phần phản ứng  Sự xuất hiện sản phẩm phụ ức chế phản ứng  Các bản sao kết hợp với nhau

2.3.6 Phương pháp RT - PCR (Reverse Transcription Polymerase Reaction)

Phương pháp RT - PCR là sự kết hợp giữa phương pháp phiên mã ngược và phương pháp PCR Phương pháp này có thể phát hiện các mRNA tồn tại với lượng rất thấp, mà không thể phát hiện bằng phương pháp như Northern blot Ngoài ra, RT-PCR kết hợp với kỹ thuật RFLP có thể dễ dàng phát hiện ra các đột biến và sự đa hình trong đoạn khuếch đại và xác định độ dài của gen biểu hiện khi một mRNA quan tâm biểu hiện ở mức độ rất thấp Nhờ RT - PCR sẽ khuếch đại mRNA bình thường và mRNA đột biến tạo thành các DNA, sau đó dùng cùng loại men cắt giới hạn, DNA bình thường phân biệt với DNA đột biến qua sự sai biệt trọng lượng phân tử (Bùi Trang Việt, 2002)

Do Taq polymerase sử dụng trong bước PCR không hoạt động trên RNA nên

trước hết cần chuyển RNA thành cDNA nhờ enzym phiên mã ngược (reverse

transcriptase) Sau đó cDNA sẽ được nhân bản nhờ Taq polymerase (Walker, 2000)

Dấu hiệu xác định bệnh là sản phẩm nhân bản một đoạn gene đặc hiệu của virus Sự hiện diện của sản phẩm được nhận biết qua điện di trên gel agarose

Các phương pháp khuếch đại RNA bằng PCR

 Oligo (dT) bắt cặp với đuôi poly (A) trên mRNA của động vật hữu nhũ , có thể dùng như mồi ngược không đặc hiệu để tổng hợp sợi cDNA đầu tiên Sau đó, phản ứng khuếch đại bằng PCR sẽ rất có hiệu quả khi bổ sung thêm một hoặc nhiều mồi xuôi đặc hiệu cho vùng gen mong muốn (Frohman, 1995 ; Schaefer, 1995 ; Bespalova và cộng sự, 1998)

 Sự tổng hợp sợi cDNA đầu tiên có thể được thực hiện bằng một đoạn mồi oligonucleotide bắt cặp đặc hiệu (gene - specific priming, GSP) với vùng đã được chọn trên sợi RNA hoặc mRNA đặc trưng GSP được gọi là mồi ngược, sự khuếch đại sau đó sẽ được bổ sung thêm một mồi xuôi tương thích với trình tự đặc hiệu trên cDNA (Frohman, 1995 ; Schaefer, 1995 ; Bespalova và cộng sự, 1998)

 Một đoạn gồm 6 nucleotide ngẫu nhiên có thể dùng làm mồi để tổng hợp cDNA tại nhiều điểm dọc theo sợi RNA mẫu, tạo ra nhiều đoạn bản sao khác nhau trên toàn bộ phân tử RNA Phương pháp này rất hữu dụng để khuếch đại sợi RNA quá dài hoặc chứa nhiều cấu trúc bậc hai không thể tổng hợp bằng oligo (T) hoặc GSP (Lee và Caskey, 1990)

Trong việc chẩn đoán bệnh trắng đuôi, phương pháp Single - Step RT - PCR dùng để khuếch đại RNA của hai virus ở trong cùng dung dịch tách chiết (Widada , 2003, 2004 ; Sahul Hameed, 2004a và cộng sự) Phương pháp này được tiến hành bằng cách phiên mã ngược và khuếch đại đoạn gen mong muốn trong một ống phản ứng đơn cho mỗi virus (single reaction tube) bằng một chu kỳ nhiệt không liên tục Kỹ

thuật này phát hiện MrNV bằng cách sử dụng một cặp mồi MrNV - RNA2 - F và MrNV - RNA2 - R đặc hiệu cho RNA - 2 của MrNV được thiết kế từ trình tự của bộ gen MrNV (Genbank accession no AY222840) (Widada, 2003; Sahul Hameed và

cộng sự, 2004a) Phát hiện XSV bằng cách cặp mồi XSV - F và XSV - R được công bố (Widada và cộng sự, 2004) Nguyên tắc phản ứng giống (hình 2.4) sử dụng hai mồi

MrNV - RNA2 - R và XSV - R là hai mồi ngược sẽ bắt cặp với tương ứng với RNA

của từng virus, sau đó sẽ tạo cDNA trong một thời gian, rồi gia nhiệt để bất hoạt

enzym phiên mã ngược, chu kỳ tiếp tục được thực hiện cùng với hai mồi MrNV - RNA2 - F và MrNV - RNA2 - R và XSV - F và XSV - R cho từng virus Kích thước sản phẩm khuếch đại 681 bp là MrNV và 500 bp là XSV