Trong phản ứng RT - PCR cơng đoạn tách chiết RNA đƣợc xem là một trong những bƣớc quyết định. Do đĩ chúng tơi tiến hành hai phƣơng pháp tách chiết khác nhau trên 1 mẫu tơm thịt bệnh trắng đuơi đƣợc cung cấp từ Ấn Độ theo bộ Kit và theo phƣơng pháp Trizol để cĩ thể đánh giá đƣợc hiệu quả của hai phƣơng pháp tách chiết này.
Hình 4.2: Kết quả điện di các sản phẩm khuếch đại RT-PCR từ mẫu chứng dƣơng đƣợc tách chiết bộ Kit và Trizol.
Phần A, C: sản phẩm khuếch đại RNA tách chiết bằng bộ Kit. Phần B, D: sản phẩm khuếch đại RNA tách chiết bằng Trizol.
Giếng 1, 2, 3, 4, 5, 6: sản phẩm RT - PCR từ mẫu tơm nhiễm MrNV. Giếng 8, 9, 10, 11, 12, 13: sản phẩm RT - PCR từ mẫu tơm nhiễm XSV. Giếng 7, 14: mẫu chứng âm.
Giếng M: Thang DNA X174 RF Hae III.
Bảng 4.1: Kết quả điện di các sản phẩm RT - PCR đƣợc tách chiết bộ Kit và Trizol Tách chiết Virus Lần 1 Lần 2 Lần 3 Kết quả
Bộ Kit MrNV giếng 1 giếng 2 giếng 3 ++++ XSV giếng 8 giếng 9 giếng 10 ++
Trizol
MrNV giếng 4 giếng 5 giếng 6 +++ XSV giếng 11 giếng 12 giếng 13 +
(+): biểu hiện mức độ sáng của sản phẩm.
Qua 3 lần thử nghiệm trên mẫu chứng dƣơng, chúng tơi nhận thấy vạch sản phẩm từ RNA tách chiết bằng bộ Kit cĩ độ sáng đậm hơn vạch sản phẩm của RNA tách chiết theo phƣơng pháp Trizol.
Nhìn chung cả hai qui trình tách chiết đều đạt yêu cầu. Tuy nhiên mỗi phƣơng pháp cĩ ƣu và nhƣợc điểm riêng:
MrNV
1 2 3 M 4 5 6 7
XSV
8 9 10 M 11 12 13 14
Phƣơng pháp Trizol là phƣơng pháp tách chiết RNA tổng số phƣơng pháp này đơn giản ít tốn thời gian, hố chất cĩ thể tƣ pha. Lƣợng RNA thu đƣợc dễ bị lẫn phenol và các tạp chất khác trong quá trình tách chiết nếu thao tác khơng cẩn thận, phƣơng pháp Trizol sử dụng phenol và chloroform, hai chất này rất độc đối với ngƣời tách chiết. Hố chất Trizol cĩ thể tự pha nên cĩ thể sai sĩt trong quá trình pha, nhƣ việc hút phenol khơng đúng cách, khơng đủ thể tích, cân khơng đủ lƣợng, dễ nhiễm RNAase, các vi sinh vật. Các yếu tố đĩ ảnh hƣởng lớn đến quá trình tách chiết.
Phƣơng pháp tách chiết theo bộ Kit địi hỏi theo điều kiện tách chiết của bộ Kit, hố chất sử dụng trong bộ Kit tuân theo qui trình sản xuất nghiêm ngặt, khơng nhiễm RNAase, các vi sinh vật nên lƣợng RNA thu đƣợc sẽ rất nhiều và khơng gãy vụn, khơng cĩ sử dụng phenol và chloroform nên khơng độc đối với ngƣời tách chiết. Trong quá trình tách chiết khơng bị lẫn tạp chất nhiều. Tuy nhiên tách chiết phải ủ trên đá trong suốt quá trình tách chiết. Nếu thực hiện trong thời gian dài thì lƣợng đá phải đƣợc bổ sung, cơng việc này làm ngắt quảng quá trình tách chiết và làm mất thời gian.
Nhƣ vậy, qua hai quá trình tách chiết từ mẫu tơm bệnh đƣợc cung cấp từ Ấn Độ. Chúng tơi nhận thấy rằng trong dịch tách chiết của mẫu tơm thịt bị nhiễm bệnh luơn tồn tại hai virus MrNV và XSV.