Nghiên cứu bệnh do Streptococcus iniae gây ra trên cá chẽm (Lates calcarifer) và biện pháp phòng bệnh

1.1 Giới thiệu Cá chẽm (Lates calcarifer, Bloch 1790) là loài cá có giá trị kinh tế quan trọng ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới thuộc châu Á - Thái Bình Dương. Với đặc tính dễ nuôi và thời gian sinh trưởng nhanh, sau một năm thả nuôi từ cá giống cỡ 4 - 5 cm, cá có thể đạt khối lượng 1,5 - 3 kg. Hơn nữa, thịt cá chẽm thơm ngon, giá thành cao nên loài này đã được nuôi phổ biến ở nhiều nước trên thế giới như Thái Lan, Trung Quốc, Đài Loan, Ấn Độ, Indonesia, Australia… (Buendia, 1997). Trong những năm gần đây, thành công của những mô hình nuôi cá chẽm đã khẳng định đây là đối tượng nuôi có hiệu quả kinh tế cao. Nghề nuôi cá chẽm thương phẩm phát triển mạnh ở một số tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long (Lý Văn Khánh và ctv., 2016). Riêng tại tỉnh Thừa Thiên Huế, cá chẽm được nuôi khá phổ biến và mang lại hiệu quả kinh tế cao (Tôn Thất Chất và ctv., 2010; Trần Thị Cẩm Tú và ctv., 2017). Bệnh do Streptococcus iniae được báo cáo ở nhiều loài cá nước ngọt và cá biển ở 15 quốc gia khác nhau thuộc 4 châu lục, gồm châu Phi, châu Á, châu Úc và châu Âu. Bệnh đã và đang là mối đe dọa cho nhiều loài cá nuôi ở cả môi trường nước mặn, lợ và ngọt (Hossain et al., 2014). Trên cá chẽm, bệnh do S. iniae được báo cáo lần đầu tiên vào năm 1999 tại Úc (Bromage et al., 1999), sau đó bệnh tiếp tục xuất hiện trên cá chẽm nuôi tại Úc năm 2006 (Creeper và Buller, 2006), tại Thái Lan năm 2010 (Suanyuk et al., 2010). Bệnh do S. iniae trên cá chẽm gây xuất huyết trên da, vây và mắt lồi đục (Bromage et al., 1999). Một số dấu hiệu khác như lở loét ngoài da hay xuất huyết ở các gốc vây, nắp mang, hậu môn đã được quan sát trên cá chẽm và cá rô phi nhiễm S. iniae (Suanyuk et al., 2010). Bệnh do S. iniae có thể gây ra tỷ lệ chết lên đến 70% ở giai đoạn cá chẽm giống (Creeper và Buller, 2006). Ở Việt Nam, bệnh do S. iniae được báo cáo xuất hiện đầu tiên trên cá chẽm nuôi tại Khánh Hòa vào năm 2013 (Tran Vi Hich et al., 2013). Tại Thừa Thiên Huế, từ năm 2007, để hạn chế dịch bệnh và ô nhiễm môi trường do nuôi thâm canh tôm thẻ chân trắng gây ra, tỉnh đã phát triển nuôi các đối tượng cá nước mặn, lợ như cá mú, cá hồng, cá dìa, cá chẽm…, để thay thế các vùng nuôi tôm bị dịch bệnh. Trong đó, cá chẽm được người dân địa phương nuôi khá phổ biến và mang lại hiệu quả kinh tế cao (Tôn Thất Chất và ctv., 2010). Tuy nhiên, việc mở rộng diện tích mặt nước nuôi cá chẽm thiếu quy hoạch chặt chẽ đã làm nghề nuôi cá gặp rất nhiều khó khăn về môi trường và dịch bệnh, trong đó bệnh xuất huyết trên cá chẽm rất phổ biến. Thuốc kháng sinh thường được sử dụng để trị bệnh do vi khuẩn gây ra trên động vật thủy sản nuôi. Việc sử dụng kháng sinh để trị bệnh do vi khuẩn đã mang lại những thành công nhất định, nhưng cũng làm gia tăng những dòng vi khuẩn kháng thuốc (Weston, 1996; Tu Thanh Dung et al., 2008). Do đó nghiên cứu sử dụng vi khuẩn có khả năng kháng với vi khuẩn gây bệnh trên động vật thủy sản ngày càng được quan tâm. Trong đó có vi khuẩn lactic, có khả năng kháng vi khuẩn gây bệnh và có lợi với sức khỏe vật chủ khi được bổ sung đủ số lượng trong đường ruột (Nirunya et al., 2008). Vi khuẩn lactic sản xuất một số chất kháng khuẩn như axit hữu cơ, các hợp chất kháng nấm và bacteriocin để ức chế sự phát triển của mầm bệnh (Ringo et al., 2005; Gatesoupe, 2007). Vi khuẩn lactic có thể được phân lập từ nhiều nguồn khác nhau như từ các sản phẩm lên men, từ ruột gia súc và các loài động vật thủy sản. Một số nghiên cứu về vi sinh vật đường ruột của cá trong các môi trường sống khác nhau cho thấy vi khuẩn lactic tồn tại trong ruột cá nhưng không chiếm ưu thế trong hệ vi sinh đường ruột (Ringo et al., 2010). Do đó, có thể bổ sung vi khuẩn lactic vào khẩu phần ăn của cá để ức chế vi khuẩn gây bệnh và nâng cao sức đề kháng bệnh cho cá (Lauzon và Ringo, 2011). Tuy nhiên, cho đến nay vẫn chưa có các nghiên cứu về ảnh hưởng của việc bổ sung vi khuẩn lactic vào thức ăn đến các chỉ tiêu miễn dịch không đặc hiệu của cá chẽm. Xuất phát từ thực tiễn đó, thực hiện đề tài “Nghiên cứu bệnh do Streptococcus iniae gây ra trên cá chẽm (Lates calcarifer) và biện pháp phòng bệnh” nhằm cung cấp thông tin về bệnh do vi khuẩn S. iniae trên cá và góp phần phát triển nghề nuôi cá chẽm bền vững. 1.2 Mục tiêu nghiên cứu Mục tiêu chung: Cung cấp thông tin về bệnh do vi khuẩn S. iniae gây ra trên cá chẽm làm cơ sở khoa học cho việc quản lý dịch bệnh và góp phần phát triển nghề nuôi cá chẽm bền vững. Mục tiêu cụ thể: Xác định đặc điểm gây bệnh của vi khuẩn S. iniae trên cá chẽm và đề xuất giải pháp phòng bệnh làm cơ sở cho việc chẩn đoán và phòng bệnh xuất huyết trên cá chẽm.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

Mã ngành 9620301

Cần Thơ, 2019

MỤC LỤC

LỜI CẢM TẠ i

TÓM TẮT ii

ABSTRACT iv

LỜI CAM KẾT vi

MỤC LỤC vii

DANH SÁCH BẢNG xi

DANH SÁCH HÌNH xiii

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT……….… xv

Chương 1 GIỚI THIỆU 1

1.1 Giới thiệu 1

1.2 Mục tiêu nghiên cứu 3

1.3 Phạm vi nghiên cứu 3

1.4 Nội dung nghiên cứu 3

1.5 Ý nghĩa của nghiên cứu 3

1.6 Điểm mới của luận án 4

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5

2.1 Tình hình nuôi cá chẽm trên thế giới và Việt Nam 5

2.1.1 Trên thế giới 5

2.1.2 Ở Việt Nam 6

2.2 Một số bệnh thường gặp trên cá chẽm 8

2.2.1 Bệnh do virus 8

2.2.2 Bệnh do vi khuẩn 9

2.2.3 Bệnh do ký sinh trùng 10

2.3 Tổng quan về bệnh do vi khuẩn S iniae trên cá 11

2.3.1 Tình hình dịch bệnh do vi khuẩn S iniae trên cá 11

2.3.1.1 Trên thế giới 11

2.3.1.2 Ở Việt Nam 12

2.3.2 Đặc điểm hình thái, sinh lý và sinh hóa của S iniae 13

2.3.2.1 Hệ thống phân loại 13

2.3.2.2 Đặc điểm hình thái 13

2.3.2.3 Đặc điểm sinh lý và sinh hóa 15

2.3.3 Đặc điểm bệnh lý 17

2.3.4 Con đường lan truyền và xâm nhập của vi khuẩn S iniae trên cá 20

2.3.5 Độc lực và cơ chế gây bệnh 21

2.3.6 Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng gây bệnh của vi khuẩn S iniae 22

2.3.7 Phương pháp chẩn đoán 23

2.3.8 Biện pháp phòng và trị bệnh 24

2.4 Hệ miễn dịch không đặc hiệu ở cá 26

2.4.1 Hàng rào vật lý 26

2.4.2 Hàng rào hóa học 27

2.4.3 Hàng rào tế bào 27

2.5 Đặc điểm huyết học ở cá 28

2.5.1 Hồng cầu 29

2.5.2 Bạch cầu 29

2.5.3 Tiểu cầu 30

2.6 Tình hình nghiên cứu sử dụng vi khuẩn lactic để phòng bệnh trên cá 31

2.6.1 Đặc điểm hình thái, sinh lý và sinh hóa của vi khuẩn lactic 31

2.6.2 Vai trò và cơ chế tác động của vi khuẩn lactic 34

2.6.3 Tình hình nghiên cứu sử dụng vi khuẩn lactic để phòng bệnh do vi khuẩn gây ra trên cá 36

2.6.3.1 Một số vi khuẩn lactic phân lập từ ruột cá có khả năng kháng vi khuẩn gây bệnh trên cá 36

2.6.3.2 Sử dụng vi khuẩn lactic để phòng bệnh trên cá… ………… 38

Chương 3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ……… ……40

3.1 Đối tượng nghiên cứu 40

3.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 40

3.3 Phương tiện nghiên cứu 40

3.3.1 Dụng cụ và thiết bị 40

3.3.2 Hóa chất và môi trường 41

3.4 Phương pháp nghiên cứu 42

3.4.1 Phương pháp nghiên cứu đặc điểm gây bệnh của vi khuẩn S iniae trên cá chẽm 42

3.4.1.1 Phân lập và định danh vi khuẩn S iniae gây bệnh xuất huyết trên cá chẽm 42

3.4.1.2 Xác định khả năng gây bệnh thực nghiệm của vi khuẩn S iniae

48

3.4.1.3 Xác định đặc điểm mô bệnh học của cá chẽm cảm nhiễm S iniae 51

3.4.2 Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn lactic từ ruột một số loài cá nước lợ có khả năng ức chế vi khuẩn S iniae 51

3.4.2.1 Phân lập các chủng vi khuẩn lactic từ ruột cá chẽm, cá dìa và cá rô phi 52

3.4.2.2 Xác định khả năng đối kháng với vi khuẩn S iniae của vi khuẩn lactic 54

3.4.2.3 Định danh các chủng vi khuẩn lactic có khả năng đối kháng mạnh với vi khuẩn S iniae 54

3.4.3 Nghiên cứu xác định ảnh hưởng của việc bổ sung chủng vi khuẩn lactic vào thức ăn đến một số chỉ tiêu huyết học và khả năng ức chế vi khuẩn S iniae của huyết thanh cá chẽm 55

3.4.3.1 Cá chẽm thí nghiệm 55

3.4.3.2 Chuẩn bị vi khuẩn thí nghiệm……… …55

3.4.3.3 Bố trí thí nghiệm 56

3.4.3.4 Phương pháp xác định các chỉ tiêu huyết học 57

3.4.3.5 Xác định khả năng ức chế vi khuẩn S iniae của huyết thanh 59

3.4.3.6 Xác định hoạt tính lysozyme trong huyết thanh 59

3.4.3.7 Phương pháp xác định tỷ lệ sống của cá 60

3.5 Xử lý số liệu 60

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 61

4.1 Đặc điểm gây bệnh của vi khuẩn S iniae trên cá chẽm 61

4.1.1 Kết quả phân lập vi khuẩn S iniae trên cá chẽm 61

4.1.1.1 Kết quả phân lập vi khuẩn 61

4.1.1.2 Đặc điểm hình thái, sinh lý và sinh hóa của các chủng vi khuẩn gây bệnh xuất huyết trên cá chẽm 63

4.1.2 Khả năng gây bệnh thực nghiệm của S iniae trên cá chẽm 67

4.1.2.1 Kết quả xác định độc lực vi khuẩn 67

4.1.2.2 Kết quả xác định LD50 của S iniae trên cá chẽm 68

4.1.2.3 Kết quả gây bệnh thực nghiệm 68

4.1.2.4 Đặc điểm mô bệnh học của cá chẽm cảm nhiễm S iniae 71

4.2 Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn lactic có khả năng đối kháng vi khuẩn S iniae từ ruột một số loài cá nước lợ 77

4.2.1 Kết quả phân lập các chủng vi khuẩn lactic 77

4.2.2 Kết quả xác định khả năng đối kháng với vi khuẩn S iniae của vi khuẩn lactic 80

4.2.3 Kết quả định danh các chủng vi khuẩn lactic có khả năng đối kháng mạnh với vi khuẩn S iniae 82

4.3 Ảnh hưởng của việc bổ sung chủng vi khuẩn lactic vào thức ăn đến một số chỉ tiêu huyết học và khả năng ức chế vi khuẩn S iniae của huyết thanh cá chẽm 83

4.3.1 Kết quả xác định các chỉ tiêu huyết học của cá chẽm 83

4.3.1.1 Số lượng hồng cầu trong máu cá chẽm 83

4.3.1.2 Số lượng tổng bạch cầu trong máu cá chẽm……… 86

4.3.1.3 Số lượng các loại bạch cầu trong máu cá chẽm 88

4.3.1.4 Số lượng tiểu cầu trong máu cá chẽm 92

4.3.2 Khả năng ức chế vi khuẩn S iniae của huyết thanh cá chẽm 94

4.3.3 Hoạt tính lysozyme trong huyết thanh 96

4.3.4 Tỷ lệ sống của cá 97

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 100

5.1 Kết luận 100

5.2 Đề xuất 100

TÀI LIỆU THAM KHẢO 101

PHỤ LỤC 115

Bảng 2.3: Một số đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn S iniae 16

Bảng 2.4 Một số giống vi khuẩn lactic và đặc điểm cơ bản để phân biệt các giống 32

Bảng 2.5 Đặc điểm sinh hóa của một số loài thuộc giống Lactobacillus được

phân lập từ động vật thủy sản 34 Bảng 2.6: Một số vi khuẩn lactic được phân lập từ ruột cá có khả năng kháng

vi khuẩn gây bệnh trên động vật thủy sản 37 Bảng 2.7: Một số vi khuẩn lactic được sử dụng trong nuôi cá nước lợ 38 Bảng 3.1: Số mẫu cá chẽm bị bệnh xuất huyết thu tại tỉnh Thừa Thiên Huế 43Bảng 3.2 Thuốc thử và cách đọc kết quả của bộ kít API 20 Strep………… 46 Bảng 3.3: Thiết kế thí nghiệm xác định LD50 của vi khuẩn S iniae trên cá chẽm 50 Bảng 3.4: Thiết kế thí nghiệm xác định khả năng gây bệnh của chủng HTA1

và HTA3 trên cá chẽm 51 Bảng 3.5: Kết quả thu mẫu để phân lập vi khuẩn lactic 52

Bảng 3.6: Thiết kế thí nghiệm xác định ảnh hưởng của L fermentum đến các chỉ tiêu huyết học và khả năng kháng S iniae 57

Bảng 4.1: Tỷ lệ % số chủng vi khuẩn phân lập từ các mô của cá chẽm bị bệnh xuất huyết nuôi tại tỉnh Thừa Thiên Huế 63 Bảng 4.2: Một số đặc điểm hình thái và sinh hóa của các chủng vi khuẩn phân lập

được từ cá chẽm và so sánh với chủng S iniae theo Bromage et al (1999) 65

Bảng 4.3: Kết quả xác định một số đặc điểm sinh hóa của các chủng vi khuẩn

phân lập được từ cá chẽm bằng bộ kít API 20 Strep, so với chủng S iniae của Bromage et al (1999) và chủng S iniae của Rahmatullah et al (2017) 66

Bảng 4.4: Kết quả thí nghiệm xác định độc lực của vi khuẩn 67 Bảng 4.5: Kết quả thí nghiệm xác định LD50 của hai chủng S iniae HTA1 và HTA3 trên cá chẽm 68

Bảng 4.6: Kết quả so sánh mức độ tương đồng trình tự vi khuẩn phân lập trên cá chẽm bị bệnh xuất huyết với vi khuẩn trong ngân hàng dữ liệu gen của NCBI 77 Bảng 4.7: Kết quả phân lập vi khuẩn lactic từ cá chẽm, cá rô phi và cá dìa 78 Bảng 4.8 Một số đặc điểm hình thái, sinh lý và sinh hóa của các chủng vi khuẩn lactic phân lập từ ruột cá dìa, cá chẽm và cá rô phi 79

Bảng 4.9: Kết quả xác định khả năng đối kháng với vi khuẩn S iniae HTA1

của các chủng vi khuẩn lactic 81

Bảng 4.10: Khả năng ức chế vi khuẩn S iniae của huyết thanh cá chẽm 95

DANH SÁCH HÌNH

Hình 2.1 Hình dạng Streptococcus sp dưới kính hiển vi điện tử 14

Hình 2.2 Hình dạng vi khuẩn S iniae sau khi nhuộm Gram (100X) 15

Hình 2.3 Dấu hiệu bệnh lý của cá hồng mỹ bị bệnh xuất huyết do S iniae 18

Hình 2.4 Dấu hiệu bệnh lý của cá chẽm bị bệnh xuất huyết do S iniae 18

Hình 2.5 Mô bệnh cá rô phi bị bệnh xuất huyết do S iniae 19

Hình 2.6 Hình dạng vi khuẩn lactic 33

Hình 2.7 Hình dạng vi khuẩn Lactobacillus plantarum 33

Hình 3.1 Sơ đồ khối các nội dung nghiên cứu 42

Hình 3.2 Bộ test sinh hóa định danh vi khuẩn 46

Hình 3.3 Sơ đồ phương pháp tuyển chọn vi khuẩn lactic……… ….52

Hình 4.1 Cá chẽm bị bệnh xuất huyết do vi khuẩn 62

Hình 4.2 Hình dạng khuẩn lạc và nhuộm Gram vi khuẩn S iniae 64

Hình 4.3 Khuẩn lạc S iniae trên môi trường BA+ sau 48 giờ nuôi cấy 64

Hình 4.4 Kết quả xác định một số đặc điểm sinh hóa của 02 chủng vi khuẩn HTA1 và HTA3 bằng bộ kít API 20Strep 66

Hình 4.5 Cá chẽm trước và sau thí nghiệm cảm nhiễm S iniae 69

Hình 4.6 Tỷ lệ chết tích lũy của cá chẽm trong 14 ngày cảm nhiễm hai chủng S iniae HTA1 và HTA3 70

Hình 4.7 Mô gan cá chẽm cảm nhiễm vi khuẩn S iniae……….72

Hình 4.8 Mô thận cá chẽm cảm nhiễm vi khuẩn S iniae……… 74

Hình 4.9 Mô lách cá chẽm cảm nhiễm vi khuẩn S iniae……… 75

Hình 4.10 Mô não cá chẽm cảm nhiễm vi khuẩn S iniae……… 76

Hình 4.11 Ảnh điện di sản phẩm PCR đoạn gen 16S rRNA tách chiết từ hai chủng vi khuẩn HTA1 và HTA3 trên gel 2% agarose 77

Hình 4.12 Hình dạng khuẩn lạc của vi khuẩn lactic trên môi trường MRS agar sau 24 giờ nuôi cấy 79

Hình 4.13 Hình dạng vi khuẩn lactic sau khi nhuộm Gram (100X) 80

Hình 4.14 Kết quả thử nghiệm khả năng đối kháng của chủng D7 với vi khuẩn S iniae sau 48 giờ nuôi cấy (A và B thể hiện đường kính vòng kháng khuẩn) 81

Hình 4.15 Ảnh điện di kiểm tra sản phẩm PCR trên gel 2% agarose 82

Hình 4.16 Cây thể hiện mối quan hệ di truyền của các chủng C21, D1 và D7

so với các chủng trên ngân hàng gen 83

Hình 4.17 Hình dạng tế bào hồng cầu trong máu cá chẽm 85

Hình 4.18 Biến động số lượng hồng cầu trong máu cá chẽm 85

Hình 4.19 Biến động số lượng tổng bạch cầu trong máu cá chẽm 86

Hình 4.20 Hình dạng tế bào lympho trong máu cá chẽm 88

Hình 4.21 Biến động số lượng tế bào lympho trong máu cá chẽm 89

Hình 4.22 Hình dạng bạch cầu đơn nhân trong máu cá chẽm 90

Hình 4.23 Biến động số lượng bạch cầu đơn nhân trong máu cá chẽm 90

Hình 4.24 Hình dạng bạch cầu trung tính trong máu cá chẽm 91

Hình 4.25 Biến động số lượng bạch cầu trung tính trong máu cá chẽm 92

Hình 4.26 Hình dạng tiểu cầu trong máu cá chẽm 93

Hình 4.27 Biến động số tiểu cầu trong máu cá chẽm 93

Hình 4.28 Hoạt tính lysozyme trong huyết thanh cá chẽm 97

Hình 4.29 Tỷ lệ sống của cá sau khi cảm nhiễm S iniae 98

Hình 4.30 Kết quả cảm nhiễm S iniae trên cá chẽm 99

BA+ Môi trường BA có bổ sung 1,5% NaCl

BLAST Basic Local Alignment Search Tool

CFU Colony forming unit

DNA Deoxyribonucleic acid

ESC Hydrolysis of Esculin

H&E Hematoxylin và Eosin

HIP Hydrolysis of Hippurate

LAP Leucine arylamidase

LCD lysine decarboxylase

MRS De Man, Rogosa and Sharpe

MRSA De Man, Rogosa and Sharpe Agar

NCBI National Center for Biotechnology Information

PCR Polymerase Chain Reaction

PYRA Pyrrolidonyl arylamidase

PAL Alkaline phosphatase

RIB Ribose

RPS Relative Percentage Survival

TBTB Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide

TSA+ Môi trường Tryptic Soy Agar có bổ sung thêm 1,5% NaCl

TSB+ Môi trường Tryptic Soy Broth bổ sung thêm 1,5% NaCl

αGAL α-Galactosidase

βGAL β-Galactosidase

Chương 1 GIỚI THIỆU

1.1 Giới thiệu

Cá chẽm (Lates calcarifer, Bloch 1790) là loài cá có giá trị kinh tế quan

trọng ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới thuộc châu Á - Thái Bình Dương Với đặc tính dễ nuôi và thời gian sinh trưởng nhanh, sau một năm thả nuôi từ cá giống cỡ 4 - 5 cm, cá có thể đạt khối lượng 1,5 - 3 kg Hơn nữa, thịt cá chẽm thơm ngon, giá thành cao nên loài này đã được nuôi phổ biến ở nhiều nước trên thế giới như Thái Lan, Trung Quốc, Đài Loan, Ấn Độ, Indonesia, Australia… (Buendia, 1997)

Trong những năm gần đây, thành công của những mô hình nuôi cá chẽm

đã khẳng định đây là đối tượng nuôi có hiệu quả kinh tế cao Nghề nuôi cá chẽm thương phẩm phát triển mạnh ở một số tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long

(Lý Văn Khánh và ctv., 2016) Riêng tại tỉnh Thừa Thiên Huế, cá chẽm được nuôi khá phổ biến và mang lại hiệu quả kinh tế cao (Tôn Thất Chất và ctv., 2010; Trần Thị Cẩm Tú và ctv., 2017)

Bệnh do Streptococcus iniae được báo cáo ở nhiều loài cá nước ngọt và

cá biển ở 15 quốc gia khác nhau thuộc 4 châu lục, gồm châu Phi, châu Á, châu

Úc và châu Âu Bệnh đã và đang là mối đe dọa cho nhiều loài cá nuôi ở cả

môi trường nước mặn, lợ và ngọt (Hossain et al., 2014)

Trên cá chẽm, bệnh do S iniae được báo cáo lần đầu tiên vào năm 1999 tại Úc (Bromage et al., 1999), sau đó bệnh tiếp tục xuất hiện trên cá chẽm nuôi

tại Úc năm 2006 (Creeper và Buller, 2006), tại Thái Lan năm 2010 (Suanyuk

et al., 2010) Bệnh do S iniae trên cá chẽm gây xuất huyết trên da, vây và mắt

lồi đục (Bromage et al., 1999) Một số dấu hiệu khác như lở loét ngoài da hay

xuất huyết ở các gốc vây, nắp mang, hậu môn đã được quan sát trên cá chẽm

và cá rô phi nhiễm S iniae (Suanyuk et al., 2010) Bệnh do S iniae có thể gây

ra tỷ lệ chết lên đến 70% ở giai đoạn cá chẽm giống (Creeper và Buller, 2006)

Ở Việt Nam, bệnh do S iniae được báo cáo xuất hiện đầu tiên trên cá chẽm nuôi tại Khánh Hòa vào năm 2013 (Tran Vi Hich et al., 2013) Tại Thừa

Thiên Huế, từ năm 2007, để hạn chế dịch bệnh và ô nhiễm môi trường do nuôi thâm canh tôm thẻ chân trắng gây ra, tỉnh đã phát triển nuôi các đối tượng cá nước mặn, lợ như cá mú, cá hồng, cá dìa, cá chẽm…, để thay thế các vùng nuôi tôm bị dịch bệnh Trong đó, cá chẽm được người dân địa phương nuôi

khá phổ biến và mang lại hiệu quả kinh tế cao (Tôn Thất Chất và ctv., 2010)

Tuy nhiên, việc mở rộng diện tích mặt nước nuôi cá chẽm thiếu quy hoạch chặt chẽ đã làm nghề nuôi cá gặp rất nhiều khó khăn về môi trường và dịch bệnh, trong đó bệnh xuất huyết trên cá chẽm rất phổ biến

Thuốc kháng sinh thường được sử dụng để trị bệnh do vi khuẩn gây ra trên động vật thủy sản nuôi Việc sử dụng kháng sinh để trị bệnh do vi khuẩn đã mang lại những thành công nhất định, nhưng cũng làm gia tăng những dòng vi

khuẩn kháng thuốc (Weston, 1996; Tu Thanh Dung et al., 2008) Do đó nghiên

cứu sử dụng vi khuẩn có khả năng kháng với vi khuẩn gây bệnh trên động vật thủy sản ngày càng được quan tâm Trong đó có vi khuẩn lactic, có khả năng kháng vi khuẩn gây bệnh và có lợi với sức khỏe vật chủ khi được bổ sung đủ số

lượng trong đường ruột (Nirunya et al., 2008) Vi khuẩn lactic sản xuất một số

chất kháng khuẩn như axit hữu cơ, các hợp chất kháng nấm và bacteriocin để ức

chế sự phát triển của mầm bệnh (Ringo et al., 2005; Gatesoupe, 2007)

Vi khuẩn lactic có thể được phân lập từ nhiều nguồn khác nhau như từ các sản phẩm lên men, từ ruột gia súc và các loài động vật thủy sản Một số nghiên cứu về vi sinh vật đường ruột của cá trong các môi trường sống khác nhau cho thấy vi khuẩn lactic tồn tại trong ruột cá nhưng không chiếm ưu thế

trong hệ vi sinh đường ruột (Ringo et al., 2010) Do đó, có thể bổ sung vi

khuẩn lactic vào khẩu phần ăn của cá để ức chế vi khuẩn gây bệnh và nâng cao sức đề kháng bệnh cho cá (Lauzon và Ringo, 2011) Tuy nhiên, cho đến nay vẫn chưa có các nghiên cứu về ảnh hưởng của việc bổ sung vi khuẩn lactic vào thức ăn đến các chỉ tiêu miễn dịch không đặc hiệu của cá chẽm

Xuất phát từ thực tiễn đó, thực hiện đề tài “Nghiên cứu bệnh do

Streptococcus iniae gây ra trên cá chẽm (Lates calcarifer) và biện pháp phòng

bệnh” nhằm cung cấp thông tin về bệnh do vi khuẩn S iniae trên cá và góp

phần phát triển nghề nuôi cá chẽm bền vững

1.2 Mục tiêu nghiên cứu

Mục tiêu chung: Cung cấp thông tin về bệnh do vi khuẩn S iniae gây ra

trên cá chẽm làm cơ sở khoa học cho việc quản lý dịch bệnh và góp phần phát triển nghề nuôi cá chẽm bền vững

Mục tiêu cụ thể: Xác định đặc điểm gây bệnh của vi khuẩn S iniae trên

cá chẽm và đề xuất giải pháp phòng bệnh làm cơ sở cho việc chẩn đoán và phòng bệnh xuất huyết trên cá chẽm

1.3 Phạm vi nghiên cứu

Nghiên cứu tập trung tìm hiểu bệnh xuất huyết do vi khuẩn S iniae gây

ra trên cá chẽm nuôi tại tỉnh Thừa Thiên Huế, tuyển chọn vi khuẩn lactic có

khả năng đối kháng vi khuẩn S iniae từ ruột cá dìa, cá chẽm và cá rô phi, đồng thời xác định một số chỉ tiêu huyết học và khả năng kháng vi khuẩn S iniae

của cá chẽm giai đoạn giống

1.4 Nội dung nghiên cứu

Đặc điểm gây bệnh của vi khuẩn S iniae gây ra trên cá chẽm

Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn lactic có khả năng đối kháng vi khuẩn

S iniae từ ruột một số loài cá nước lợ

Xác định ảnh hưởng của việc bổ sung chủng vi khuẩn lactic vào thức ăn

đến một số chỉ tiêu huyết học và khả năng ức chế vi khuẩn S iniae của huyết

thanh cá chẽm

1.5 Ý nghĩa của nghiên cứu

Kết quả nghiên cứu của luận án cung cấp thông tin về bệnh vi khuẩn trên

cá, đặc biệt là bệnh xuất huyết do vi khuẩn S iniae gây ra trên cá chẽm Đồng

thời đánh giá ảnh hưởng của vi khuẩn lactic phân lập từ ruột một số loài cá nước lợ đến một số chỉ tiêu miễn dịch không đặc hiệu ở cá chẽm Kết quả của luận án còn có ý nghĩa trong việc sử dụng vi khuẩn lactic có tính đối kháng

với mầm bệnh vi khuẩn S iniae tạo chế phẩm sinh học phòng bệnh xuất huyết

trên cá Bên cạnh ý nghĩa khoa học và ứng dụng trong thực tiễn, luận án còn giúp nâng cao kiến thức, năng lực nghiên cứu cho người tham gia và là nguồn tài liệu tham khảo bổ sung cho nghiên cứu và giảng dạy sinh viên trong các trường đại học

1.6 Điểm mới của luận án

Bệnh xuất huyết do S iniae được nghiên cứu và mô tả về đặc điểm bệnh

học trên cá chẽm nuôi tại Thừa Thiên Huế

Đã định danh và lưu giữ được ba chủng vi khuẩn Lactobacillus

fermentum từ ruột cá dìa và cá chẽm có khả năng đối kháng mạnh với vi khuẩn

S iniae gây bệnh xuất huyết trên cá chẽm

Sử dụng chủng vi khuẩn L fermentum (C21) bổ sung vào thức ăn cho cá

chẽm làm tăng cường một số chỉ tiêu miễn dịch không đặc hiệu giúp nâng cao

khả năng đề kháng đối với vi khuẩn S iniae gây bệnh xuất huyết trên cá chẽm

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Tình hình nuôi cá chẽm trên thế giới và Việt Nam

2.1.1 Trên thế giới

Cá chẽm hay cá vược (Lates calcarifer) là loài cá sống trong nước

mặn và nước ngọt, thuộc phân họ cá chẽm (Latinae) thuộc họ Centropomidae Khu vực sinh sống bản địa của nó là vùng bắc và đông Úc tới eo biển Torres và New Guinea Hiện nay cá chẽm đã được nuôi tại nhiều nơi trên thế giới như Úc, Malaysia, Ấn Độ, Indonesia, Thái Lan,Việt Nam, Vương quốc Anh, Hoa Kỳ và Hà Lan (Buendia, 1997)

Cá chẽm đã được cho sinh sản nhân tạo thành công đầu tiên ở Thái Lan vào năm 1971 bằng phương pháp vuốt trứng từ những cá bố mẹ có tuyến sinh dục chín muồi bắt được tại bãi đẻ tự nhiên Sau đó quy trình sản xuất giống cá chẽm được mở rộng ra ở nhiều nước như Philippines, Indonesia, Malaysia, Singapore, Trung Quốc, Ấn Độ, Đài Loan và Úc Mặc dù là loài cá rộng muối nhưng cá bố mẹ nuôi trong nước mặn mới thành thục tuyến sinh dục Tương

tự, trứng và các giai đoạn ấu trùng phát triển trong môi trường nước mặn Cá chẽm đực lớn hơn 3 kg sẽ chuyển sang cá cái Một số trại sản xuất giống duy trì đàn cá bố mẹ, một số trại khác có thể mua cá bố mẹ đánh bắt ngoài tự nhiên Trứng cá sau khi thụ tinh được vớt lên đem ấp sau một ngày, nở thành

cá bột Cá bột trong 13 ngày đầu chủ yếu ăn luân trùng rotifer, từ 13 đến 20 ngày tuổi ăn artemia, từ 21-45 ngày tuổi ăn thức ăn tự chế biến hoặc thức ăn công nghiệp Khi đến 45 ngày tuổi, cá đạt chiều dài từ 2-3 cm là cá giống Trong quá trình ương cần kiểm tra kích cỡ cá hàng tuần để tránh hiện tượng cá

ăn lẫn nhau (Schipp et al., 2007)

Hiện nay có hai hình thức nuôi cá chẽm, đó là nuôi lồng và nuôi trong

ao Nuôi cá chẽm trong lồng đang được phát triển ở nhiều nước như Thái lan, Indonesia, Philippines, Hồng Kông, Ấn Độ và Singapore Thành công của việc nuôi cá chẽm trong lồng trên biển và trên sông đã có ý nghĩa trong việc phát triển nuôi cá chẽm Tuy nhiên, nghề nuôi cá chẽm đã hình thành hơn 20 năm

qua ở vùng Đông Nam Á và châu Úc, nhưng vẫn chưa phổ biến ở qui mô sản xuất thương mại Hiện nay, việc nuôi cá chẽm trong ao nước lợ ở một số quốc gia cho thấy có tiềm năng lớn về thị trường và khả năng lợi nhuận cao Với những thành công trong việc sản xuất giống cá chẽm nhân tạo, khả năng mở

rộng quy mô sản xuất và thương mại hóa sản phẩm rất lớn (Anil et al., 2010)

Ở Đông Nam Á, cá chẽm được nuôi lồng ở Thái Lan, Malaysia và Việt Nam Cá chẽm được nuôi truyền thống trong các trang trại quy mô nhỏ, trung bình 30 lồng trên biển, lồng được đặt ở vùng ven bờ, ở những nơi có mực nước từ 5 đến 8 m hoặc 10 đến 12 m, có mái che Lồng trên biển thường có chiều dài 3 đến 5 m, 3 đến 5 m chiều rộng và sâu 2 đến 3 m Mỗi lồng được thả từ 1000-3000 cá giống Mật độ thả trung bình dưới 15-16 kg cá/m3 nước trong suốt thời gian nuôi Một số trại thả nuôi bằng lồng thép có đường kính

12, 18 hoặc 28 m và cao 10 m Những lồng này được thả từ 50.000 đến 100.000 cá giống Cá chẽm giống có kích cỡ từ 5 đến 20 g được thả vào ao hoặc lồng nuôi, sau 6 tháng có thể đạt khối lượng trung bình 350 g/con, sau 2 năm nuôi có thể đạt khối lượng đến 2 kg Kích cỡ cá chẽm thu hoạch ở các trại

khoảng từ 700-800 g/con (Anil et al., 2010)

2.1.2 Ở Việt Nam

Cá chẽm là đối tượng được nuôi ở Việt Nam từ lâu, nguồn giống được lấy từ tự nhiên hoặc nhập từ Thái Lan Tuy nhiên do thiếu chủ động nguồn giống nên nghề nuôi cá chẽm thương phẩm ít được chú ý Năm 2003, với sự thành công trong việc nghiên cứu hoàn thiện qui trình sản xuất giống nhân tạo

cá chẽm của Trường Đại học Nha Trang, nghề nuôi cá chẽm mới bắt đầu phát triển mạnh mẽ Một số vùng nuôi cá chẽm ở Việt Nam là Khánh Hòa, Bến Tre, Đồng Tháp, Kiên Giang, Quảng Ninh và Thừa Thiên Huế (Tôn Thất Chất

và ctv., 2010; Lý Văn Khánh và ctv., 2016)

Cá chẽm được nuôi trong ao và trong lồng bè, trong đó hình thức nuôi trong ao phổ biến hơn Hầu hết các ao nuôi cá chẽm là các ao nuôi tôm bị bỏ hoang do dịch bệnh Ở các ao này, người nuôi thường thả giống 5-10 cm với mật độ 0,5-1,5 con/m2 hoặc thả giống cỡ 2-3 cm với mật độ 2-3 con/m2 Ở một

số công ty chuyên nuôi cá chẽm, mật độ thả nuôi cao hơn, từ 5-10 con/m2 Năng

suất nuôi ở các cơ sở này đạt 20-25 tấn/ha Với sự phát triển mạnh mẽ của nghề nuôi cá chẽm trong những năm gần đây, những mô hình nuôi tiên tiến đã xuất hiện ở Việt Nam, điển hình như những mô hình nuôi cá chẽm đạt năng suất 25 tấn/ha ở Bình Đại, Bến Tre hoặc các lồng nuôi biển đường kính 30 m với năng suất 100 tấn/lồng ở Vạn Ninh, Khánh Hòa (Lục Minh Diệp, 2010)

Nuôi cá chẽm trong ao ở các tỉnh ven biển đồng bằng sông Cửu Long

có nhiều tiềm năng rất lớn với lợi thế dễ nuôi, điều kiện môi trường phù hợp, nguồn giống nhân tạo sẵn có với chất lượng con giống tốt, đồng đều, ít dịch bệnh và thức ăn công nghiệp chuyên cho cá chẽm Mô hình nuôi quảng canh cải tiến là mô hình bền vững cần được khuyến khích nhân rộng cho các hộ nuôi trong vùng Mô hình nuôi thâm canh thả cá giống cỡ trên 10 cm/con đạt năng suất 30,3 tấn/ha/vụ và tỉ lệ sống 70%, cao hơn so với thả giống cỡ nhỏ đồng thời rút ngắn được thời gian nuôi và chi phí thức ăn Chất lượng nước trong ao nuôi công nghiệp rất cần thiết cho sự phát triển của cá, vùng nuôi công nghiệp cần phải có nguồn nước phong phú có thể thuận tiện trao đổi khi cần thiết Thị trường đầu ra biến động lớn, tỉ lệ rủi ro trong mô hình cao Giá

cá thương phẩm và chi phí con giống có ảnh hưởng lớn nhất tới lợi nhuận của

mô hình nuôi cá chẽm công nghiệp (Lý Văn Khánh và ctv., 2016)

Ở Thừa Thiên Huế, người dân bắt đầu nuôi cá chẽm ở một số địa phương thuộc khu vực phía bắc phá Tam Giang (Điền Hương, Điền Hải, Phong Chương, Phong Hải, Quảng Công, Hải Dương) với hai hình thức nuôi chủ yếu là nuôi ao và nuôi lồng Các ao nuôi có diện tích trung bình từ 1000-

3000 m2, mật độ thả nuôi 1-3 con/m2, kích cỡ giống thả nuôi 6-8 cm Lượng cá giống chủ yếu được mua từ Nha Trang Phần lớn các ao nuôi cá chẽm tại xã Quảng Công huyện Quảng Điền là ao được chuyển từ ao nuôi tôm năng suất thấp sang nuôi cá chẽm Trong đó, mô hình nuôi cá chẽm trong ao đất tại xã Phong Điền huyện Quảng Điền khá thành công Trọng lượng trung bình của

cá sau 8 tháng nuôi là 500-600g/con, tỷ lệ sống 70% Mô hình nuôi cá chẽm trong lồng, cá có trọng lượng trung bình đạt 650g/con tỷ lệ sống 70% với thời gian nuôi khoảng 8 tháng, sử dụng thức ăn tươi cho cá ăn Do giá trị kinh tế cao, thời gian qua người dân ở vùng đầm phá Thừa Thiên Huế đã tự phát nuôi

cá chẽm trên diện rộng với thức ăn phổ biến là cá tươi Diện tích nuôi cá chẽm

trong ao đất toàn tỉnh gần 20 ha (Tôn Thất Chất và ctv., 2010)

Năm 2010, dự án hỗ trợ nhân rộng mô hình nuôi cá chẽm ở vùng nước

lợ tỉnh Thừa Thiên Huế do trường Đại học Nông Lâm Huế chủ trì, đã thực hiện thành công với mô hình nhân rộng có hiệu quả là mô hình nuôi cá chẽm bằng thức ăn tươi Mặc khác việc kết hợp thức ăn công nghiệp trong giai đoạn 1-1,5 tháng đầu của vụ nuôi đã đem lại kết quả tốt về sinh trưởng cho cá chẽm Đồng thời dự án đã xây dựng được 3 quy trình nuôi thương phẩm góp phần quảng bá nhân rộng các mô hình nuôi cá chẽm tại Thừa Thiên Huế Tôn Thất

Chất và ctv., 2010) Theo Trần Thị Cẩm Tú và ctv (2017), nuôi trồng thủy sản

nước lợ ở xã Hải Dương, tỉnh Thừa Thiên Huế phát triển mạnh, trong đó nghề nuôi cá chẽm đem lại hiệu quả kinh tế cao

2.2 Một số bệnh thường gặp trên cá chẽm

2.2.1 Bệnh do virus

Bệnh hoại tử thần kinh (Viral nervous necrosis-VNN) được phát hiện lần đầu tiên ở các trại nuôi cá mú ở Nhật Bản vào những năm 1990 Virus gây hoại tử thần kinh cũng được tìm thấy ở cá chẽm Bệnh thường xảy ra ở giai đoạn cá chẽm giống, tỷ lệ chết từ 50-100% Cá dưới 20 ngày tuổi, bệnh không thể hiện dấu hiệu bệnh lý rõ ràng Từ 45 ngày đến 4 tháng tuổi, cá bị bệnh bơi không định hướng, bơi quay tròn hoặc xoáy trôn ốc, cá kém ăn hoặc bỏ ăn, thân đen xám, đặc biệt là các vây, đuôi chuyển sang màu đen, mắt đục, bóng hơi phồng ra Cá bị bệnh hoạt động yếu, đầu treo trên mặt nước hoặc nằm dưới đáy bể, đáy lồng Cá chết sau 3-5 ngày xuất hiện dấu hiệu bệnh lý Nguyên nhân gây bệnh được xác định là do Nodavirus tấn công vào não và võng mạc mắt của cá và gây chết cá VNN là một trong những bệnh gây tỷ lệ chết cao ở

cá chẽm giống trong các trang trại của Philippines, Ấn Độ và Malaysia (Ransangan và Mannin, 2010)

Ở Việt Nam, bệnh VNN đã xuất hiện trên cá chẽm nuôi tại Khánh Hòa Bệnh thường xuất hiện chủ yếu vào mùa khô, cá nuôi ao hay lồng đều có nguy

cơ mắc bệnh hoại tử thần kinh (Trần Vĩ Hích và Lục Minh Diệp, 2010)

Bệnh khối u tế bào lympho do Iridovirus: Bệnh khối u tế bào lympho xuất hiện ở nhiều họ cá biển và cá nước ngọt, bao gồm cá trích (Clupeidae), cá

mướp (Osmeridae), cá vược biển (Serranidae), cá bơn (Paralichthidae), cá hanh (Lutjanidae), cá vược (Percidae), cá trống (Sciaenidae), cá bướm (Chaetodontidae), cá vây cứng nước ngọt (Cichlidae), cá bống (Gobiidae) và

cá bơn (Soleidae) Cá sống tự nhiên có mức độ nhiễm bệnh thấp và bệnh

không gây nguy hiểm Bệnh thường gây tác hại lớn ở giai đoạn cá hương và cá giống từ 1 – 4 tháng tuổi, cỡ cá giống từ 4 – 7 cm, (100 – 200 g/con) và cá thịt (2 – 4 kg/con) Phụ thuộc nhiệt độ môi trường nước: Virus gây bệnh có khả năng tồn tại và cảm nhiễm trong môi truờng nước từ 5 – 12 ngày ở 20 đến

250C, có thể lên đến 6 tuần ở điều kiện thích hợp từ 10 – 150C (Đỗ Thị Hòa và

ctv., 2008)

Ở Việt Nam bệnh do Iridovirus thường gặp ở một số loài cá biển như

cá mú (Epinephelus spp), cá chẽm nuôi lồng trên biển Bệnh do Iridovirus xảy

ra trên cá chẽm ở các giai đoạn nuôi Cá bị bệnh thường xuất hiện các khối u màu trắng đục, màu phớt hồng hay màu vàng có thể quan sát thấy bằng mắt

thường trên vây, da, đầu của cá bệnh Bệnh do Iridovirus thường ảnh hưởng

đến giá trị thương phẩm nhưng khi bệnh ở dạng cấp tính tỷ lệ chết có thể lên

đó bệnh do Streptococcus iniae khá phổ biến trên cá chẽm Dấu hiệu bệnh lý

bên ngoài thường gặp ở cá nhiễm bệnh là màu sắc thân cá đen tối, xuất huyết ở mắt, các gốc vây, hậu môn hoặc trên thân, mắt lồi, đục Cá bơi lội bất thường ở gần mặt nước hoặc bơi xoắn Dấu hiệu bệnh lý bên trong là sự tích dịch ở xoang bụng Cá bệnh thường có biểu hiện sưng phù ở gan, thận Các dấu hiệu như xuất

huyết ở gan, não cũng được bắt gặp ở các mẫu bệnh phẩm (Bromage et al., 1999; Suanyuk et al., 2010)

Bệnh do vi khuẩn Vibrio: Vibrio luôn là mối nguy hiểm cho các đối tượng nuôi nước mặn, lợ (Zhang và Austin, 2000) Vi khuẩn Vibrio harveyi, V

alginolyticus và V anguilarum được xem là tác nhân chính gây bệnh ở cá

chẽm trong khi các loài vi khuẩn khác thuộc giống Vibrio được xem là tác nhân thứ cấp Cá chẽm bị bệnh do Vibrio thường thể hiện một số dấu hiệu như

bơi lội bất thường, mắt mờ đục, xuất huyết ngoài da và ở trường hợp nặng có thể nhìn thấy các vết loét ngoài da Hiện tượng tích dịch ở xoang bụng, hoại tử hoặc xuất huyết ở một số cơ quan như gan, thận, lách (Tendencia, 2002)

Bệnh chướng bụng: bệnh chướng bụng xuất hiện ở cá chẽm nuôi ở một

số nước Đông Nam Á như Indonesia, Singapore và Malaysia Đến nay bệnh chỉ được tìm thấy ở cá chẽm Dấu hiệu chính của bệnh là cá chuyển màu đen sậm và cá thường tập trung thành từng đàn, bơi lội ở tầng mặt hoặc tập trung ở tầng đáy Cá giảm ăn, bụng căng tròn, phần cơ teo tóp gây mất cân đối Tác

nhân gây bệnh là trực khuẩn Bacillus, kí sinh nội bào Việc chẩn đoán bệnh

thường dựa trên dấu hiệu bệnh như đã mô tả và khối kết dính của ruột Ngoài

ra, có thể dựa vào sự hiện diện của dạng vi khuẩn gây bệnh đặc trưng ở mẫu

mỡ nội tạng hoặc các chất khác trong ruột hay kiểm tra bằng phương pháp PCR Bệnh không gây chết nhanh nhưng tỉ lệ chết tích lũy lên đến 90-95% cá thể trong quần đàn (Wendover, 2010)

Bệnh do vi khuẩn Tenacibaculum maritimum: bệnh xảy ra trên một số loài cá biển như cá chẽm, cá hồng bạc, cá mú và cá bớp Tenacibaculum

maritimum là vi khuẩn dạng sợi, Gram âm và là tác nhân gây bệnh nguy hiểm

ở cá Cá bị bệnh thường xuất hiện những vết loét nhỏ ở mang và vùng bụng Sau đó, các vết loét này lan rộng ra khắp cơ thể và cả vùng đầu, hiện tượng rụng vảy cũng xuất hiện ở cá nhiễm vi khuẩn này Tỉ lệ chết tích lũy của cá bệnh có thể lên đến 60% (Wendover, 2010)

2.2.3 Bệnh do ký sinh trùng

Một số giống loài kí sinh trùng là tác nhân gây bệnh cho cá chẽm như

trùng đơn bào, sán lá đơn chủ, sán lá song chủ (Ruckert et al., 2008) Một số loài trùng đơn bào thường gây bệnh trên cá chẽm như Cryptocaryon irritans

gây bệnh đốm trắng trên cá, bệnh gây ra tỷ lệ chết đến 50% Ichthyobodo,

Trypanosoma, Henneguya và Trichodina cũng được báo cáo gây bệnh trên cá

chẽm Bệnh do trùng đơn bào có thể gây chết đáng kể trong các hệ thống nuôi với mật độ cao Nếu cá chẽm bị nhiễm ký sinh trùng đơn bào với cường độ cao có thể gây ra các phản ứng mô như tăng sản, phù nề, hoại tử da và mang

Bệnh do sán lá đơn chủ Neobenedenia melleni là một trong những nguyên

nhân gây chết cá chẽm nuôi lồng tại Úc Cá bị bệnh có dấu hiệu mắt lồi, sán

ký sinh trên da và cơ gây hoại tử dẫn đến hôi thối, tỷ lệ chết tích lũy từ

30-40% Neobenedenia melleni được coi là loài ký sinh trùng gây bệnh nghiêm

trọng trên cá chẽm nuôi lồng ở Đông Nam Á (Leong, 1997)

Một số bệnh phổ biến do ký sinh trùng gây ra trên cá chẽm nuôi tại

Thừa Thiên Huế là bệnh do trùng bánh xe Trichodina, bệnh do sán lá đơn chủ

Pseudohabdosynochus và bệnh do sán lá song chủ Carassotrema Trong đó

bệnh do trùng bánh xe Trichodina gây chết cá ở giai đoạn giống và tỷ lệ chết tích lũy lên đến 70% (Trương Thị Hoa và ctv., 2012)

2.3 Tổng quan về bệnh do vi khuẩn S iniae trên cá

2.3.1 Tình hình dịch bệnh do vi khuẩn S iniae trên cá

2.3.1.1 Trên thế giới

Năm 1976, S iniae lần đầu tiên được phân lập trên cá heo (Inia

geoffrensis) nuôi tại Nam Mỹ (Pier và Madin, 1976) Trên cá chẽm (Lates calcarifer), bệnh do S iniae được báo cáo lần đầu tiên vào năm 1999 tại Úc

(Bromage et al., 1999) Năm 2006 bệnh tiếp tục được báo cáo xuất hiện trên

cá chẽm nuôi tại Úc (Creeper và Buller, 2006) Năm 2010, bệnh xảy ra trên cá

chẽm nuôi tại Thái Lan (Suanyuk et al., 2010) Ngoài cá chẽm, bệnh do S

iniae còn xảy ra ở một số loài cá khác như cá chỉ vàng (Seriola quinqueradiata), (Kaige et al., 1984); cá rô phi (Oreochromic niloticus),

(Hossain et al., 2014); cá rô phi (Oreochromic sp.), (Rahmatullah et al., 2017);

cá hồng Mỹ (Sciaenops ocellatus), (Mmanda et al., 2014); cá tráp vây vàng (Sparus aurata), (Aamri et al., 2015) (Bảng 2.1)

Bảng 2.1: Lịch sử xuất hiện và đặc điểm phân bố của bệnh do S iniae trên cá ở trên

thế giới

Loài cá bị bệnh Địa điểm xuất hiện,

năm công bố bệnh Nguồn tài liệu

Cá heo (Inia geoffrensis) Nam Mỹ, 1976 Pier và Madin, 1976

Cá dìa (Siganus fuscescen) Nhật Bản, 1996 Sugita, 1996

Cá chẽm châu Âu (Dicentrarchus

labrax)

Israel, 1998 Zlotkin et al., 1998

Cá chẽm (Lates calcarifer) Úc, 1999 Bromage et al., 1999

Cá bơn Nhật Bản (Paralichthys

olivaceus)

Nhật Bản, 2002 Nguyen Huu Thinh et al.,

2002

Cá ong (Pomadasys stridens) Israel, 2002 Colorni et al., 2002

Cá hồng Mỹ (Sciaenops ocellatus) Nhật Bản, 2005 Shen et al., 2005

Cá chẽm (Lates calcarifer) Úc, 2006 Creeper và Buller, 2006

Cá chẽm (Lates calcarifer) Thái Lan, 2010 Suanyuk et al., 2010

Cá hồng Mỹ (Sciaenops ocellatus) Trung Quốc, 2014 Mmanda et al., 2014

Cá tráp vây vàng (Sparus aurata)

Cá tráp (Pagrus pagrus)

Tây Ban Nha, 2015 Aamri et al., 2015

Cá rô phi (Oreochromis spp) Malaysia, 2017 Rahmatullah et al., 2017

2.3.1.2 Ở Việt Nam

Năm 2013, S iniae lần đầu tiên được phân lập trên cá rô đồng (Anabas

testudineus) nuôi tại các tỉnh đồng bằng sông Cửu Long Vi khuẩn S iniae là

tác nhân gây bệnh đen thân trên cá rô đồng Cá bệnh có dấu hiệu bệnh lý như

cơ thể cá có màu đen bất thường, mắt mờ đục và lồi, các cơ quan nội tạng

sưng và xuất huyết (Từ Thanh Dung và ctv., 2013) Theo Trần Vĩ Hích (2014), bệnh do S iniae xảy ra trên cá chẽm nuôi tại Khánh Hòa Trong thời gian từ tháng 11/2008 đến tháng 12/2009, có 8 chủng vi khuẩn S iniae đã được phân

lập từ cá chẽm nuôi tại Khánh Hòa Các chủng vi khuẩn này đều có độc tính

khá cao đối với cá chẽm với liều gây chết 50% (LD50) biến thiên từ 104,8 đến

105,8 CFU/cá Trong điều kiện gây nhiễm thực nghiệm cá chẽm bằng phương

pháp ngâm, vi khuẩn S iniae tiếp cận cơ thể cá từ mang, đi vào xoang tĩnh

mạch rồi theo máu đến thận, lách, sau đó theo máu lan tỏa đến các cơ quan khác và gây nhiễm toàn thân Đồng thời, nghiên cứu này đã bổ sung các hiểu biết về hệ miễn dịch và đáp ứng miễn dịch của cá chẽm bao gồm sự phát triển hoàn thiện của tuyến ức, cơ quan lympho trung ương đóng vai trò quan trọng trong đáp ứng miễn dịch đặc hiệu; đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu thể hiện qua hoạt tính của đại thực bào và lysozyme; và đáp ứng miễn dịch dịch thể đặc

hiệu khi bị hoạt hóa bởi kháng nguyên vi khuẩn S iniae (Trần Vĩ Hích, 2014) Bảng 2.2: Lịch sử xuất hiện và đặc điểm phân bố của bệnh do S iniae trên cá

ở Việt Nam

Loài cá bị bệnh Địa điểm xuất hiện,

năm công bố bệnh Nguồn tài liệu

Cá rô đồng (Anabas testudineus) Các tỉnh đồng bằng

sông Cửu Long, Việt Nam, 2013

Cấu trúc tế bào của vi khuẩn Streptococcus gồm lớp ngoài cùng là lớp

màng nhầy, tiếp đến là vách tế bào, màng nguyên sinh chất, nguyên sinh chất,

chất nhiễm sắc thường tập trùng ở giữa tế bào Vi khuẩn có tiên mao, không

có tiêm mao, sinh sản theo hình thức phân đôi tế bào Trên môi trường TSA,

sau 24 giờ nuôi cấy ở nhiệt độ 30oC, tạo thành các khuẩn lạc nhỏ, màu trắng

đục, không sinh sắc tố (Hình 2.1), (Đồng Thanh Hà và ctv., 2011)

Hình 2.1 Hình dạng Streptococcus sp dưới kính hiển vi điện tử

(A-vi khuẩn đang phân chia trong gan của cá rô phi; B-cấu trúc điển hình của

vi khuẩn Streptococcus sp; C, D-hình ảnh quét bề mặt của vi khuẩn

Streptococcus sp), (Đồng Thanh Hà và ctv., 2011)

S iniae là vi khuẩn Gram dương, có dạng hình cầu hoặc liên cầu, không

sinh bào tử và không di động S iniae có đường kính khoảng 1µm Trong môi trường TSA, S iniae thường liên kết với nhau thành cặp hoặc chuỗi, trên môi trường TSB, S iniae thường liên kết với nhau thành chuỗi dài (Hình 2.2), (Facklam et al., 2005)

Hình 2.2 Hình dạng vi khuẩn S iniae sau khi nhuộm Gram (100X) (A- S iniae từ môi trường TSA; B- S iniae từ môi trường TSB), (Facklam et

al., 2005) 2.3.2.3 Đặc điểm sinh lý và sinh hóa

Vi khuẩn S iniae cho phản ứng âm tính với oxidase, catalase và

Voges-Proskauer, thủy phân tinh bột và esculin, cho phản ứng dương tính với pyrrolidonylarylamidase, alkaline phosphatase, leucine arylamidase

(Kayansamruaj et al., 2017) S iniae có khả năng lên men các loại đường

glucose, mannitol, mannose, ribose sucrosen, tuy nhiên trong các điều kiện

sống khác nhau, khả năng lên men đường của các chủng S iniae có thể thay đổi (Bromage et al., 1999; Kayansamruaj et al., 2017) (Bảng 2.3)

S iniae có hoạt tính dung huyết β (tan huyết mạnh), hoạt tính dung huyết

này tạo ra các vùng tan máu khi nuôi cấy trên môi trường thạch máu do sự phân tán thấp của enzim haemolysin có trọng lượng phân tử cao vào môi

trường nuôi cấy (Williams và Lawrence, 2005) S iniae có 2 kiểu huyết thanh

serotype I và serotype II Kiểu serotype I với chủng là ATCC 29178 phân lập

từ cá heo (Pier và Madin, 1976) và kiểu serotype II với chủng ATCC 29177

cũng được phân lập từ cá heo (Pier et al., 1978) Kiểu huyết thanh của vi

khuẩn được xác định bằng phương pháp ngưng kết miễn dịch bằng kit B-Latex (GBS), (Statens Serum Institut, Đan mạch) Kết quả dương tính khi

Strep-sử dụng Strep-B-Latex giúp xác định vi khuẩn Streptococus có kiểu huyết thanh II (serotype II) (Đặng Thị Hoàng Oanh và ctv., 2012)

Bảng 2.3: Một số đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn S iniae

+

- +

2.3.3 Đặc điểm bệnh lý

Trên cá chẽm, bệnh xuất huyết do S iniae gây ra làm màu sắc thân cá

chuyển sang tối, mắt cá bị lồi, mờ đục, ở những trường hợp nặng, cầu mắt của

cá bị hủy hoại (Bromage et al., 1999; Agnew và Barnes, 2007)

Dấu hiệu điển hình của bệnh do S iniae gây ra ở cá còn biểu hiện ở tình

trạng bơi bất thường của cá Cá bơi xoắn, bơi không định hướng khi bị nhiễm

S iniae Hiện tượng bơi bất thường của cá nhiễm vi khuẩn S iniae được mô tả

ở nhiều báo cáo về bệnh này ở cá tự nhiên, cá nuôi hoặc cá cảm nhiễm thực nghiệm Nguyên nhân gây ra triệu chứng bơi bất thường được giải thích là do

sự thoái hóa của mô não do vi khuẩn S iniae có khả năng xuyên qua màng não

và gây chứng viêm não (Bromage et al., 1999; Agnew và Barnes, 2007; Suanyuk et al., 2010) Một số dấu hiệu khác như lở loét ngoài da hay xuất

huyết ở các gốc vây, nắp mang, hậu môn cũng đã được quan sát ở một số

loài cá nuôi nhiễm S iniae (Suanyuk et al., 2010)

Cá hồng mỹ bị bệnh xuất huyết do vi khuẩn S iniae có dấu hiệu xuất

huyết trên da và vây, mắt bị mờ đục, giải phẫu bên trong cho thấy cá có hiện

tượng tích dịch trong xoang bụng, lách, thận bị sưng lên (Mmanda et al., 2014), (Hình 2.3) Cá chẽm bị bệnh do S iniae cũng có các biểu hiện tương tự

như trên cá hồng mỹ nhưng gan của cá còn có hiện tượng xuất huyết (Trần Vĩ Hích, 2014) (Hình 2.4)

Vi khuẩn S iniae thường cảm nhiễm hệ thống, trong tổ chức mô của ký

chủ, có thể tìm thấy vi khuẩn ở nhiều cơ quan khác nhau như gan, lách, thận,

não và trong máu (Hossain et al., 2014) Vi khuẩn S iniae thường được phân

lập từ lách, thận, não của cá bệnh Trong nhiều trường hợp có thể tìm thấy vi

khuẩn S iniae ở tất cả các cơ quan của cá bệnh, điều này do S iniae thường cảm nhiễm hệ thống khi xâm nhập vào cơ thể cá (Bromage et al., 1999; Agnew và Barnes, 2007; Suanyuk et al., 2010)

Hình 2.3 Dấu hiệu bệnh lý của cá hồng mỹ bị bệnh xuất huyết do S iniae

(A-lách, thận bị sưng lên, B-mắt bị mờ đục, C-xuất huyết trên da và vây, D-

vây lưng và vây đuôi bị mòn cụt), (Mmanda et al., 2014)

Hình 2.4 Dấu hiệu bệnh lý của cá chẽm bị bệnh xuất huyết do S iniae

(A-xuất huyết ở thân, các gốc vây và miệng; B-lồi và xuất huyết ở mắt;

C-xuất huyết ở gan ; D-thận sưng), (Trần Vĩ Hích, 2014)

Nghiên cứu mô học của cá rô phi nhiễm S iniae cho thấy vi khuẩn tồn

tại trong mạch máu, niêm mạc ruột bị hoại tử, viêm ở tim, màng não bị xuất huyết, melanomacrophage tăng lên trong thận, niêm mạc ruột bị hoại tử (Dewi

et al., 2015) Vi khuẩn S iniae tác động tới hầu hết các cơ quan nội quan của

cá Gan của cá bệnh thường bị hoại tử cùng với sự thoái hóa của tế bào gan với một số lượng lớn không bào và sự thoái hóa của tế bào acinar, nơi sản xuất các men tiêu hóa Thận và lách của cá bệnh cũng bị hoại tử và có thể nhìn thấy

nhiều không bào ở thận (Bromage et al., 1999; Suanyuk et al., 2010) Ngoài

ra, bạch cầu trung tính xâm nhập vào các mô quanh hốc mắt, gây áp lực lên

màng mạch, gây hoại tử và dịch phù viêm làm mờ đục giác mạc (Filho et al.,

2009) Các biểu hiện bệnh lý trong não và mắt cá bị bệnh tương quan với việc bơi bất thường của cá do sự hiện diện của vi khuẩn gây viêm màng não và gây

ra hiện tượng bơi bất thường của cá (Filho et al., 2009)

Hình 2.5 Mô bệnh cá rô phi bị bệnh xuất huyết do S iniae

(A-màng não xuất huyết; B-viêm cơ tim; C-đám vi khuẩn trong macrophage ở

thận; D-hoại tử niêm mạc ruột) (thước đo: 20 µm), (Dewi et al., 2015)

2.3.4 Con đường lan truyền và xâm nhập của vi khuẩn S iniae trên cá

Thông tin về con đường lan truyền của vi khuẩn S iniae trên cá còn hạn

chế, tuy nhiên vi khuẩn này có thể tồn tại trong nước, trong bùn trong nhiều ngày và có thể xâm nhập, gây bệnh trên ký chủ phù hợp khi gặp điều kiện môi trường thuận lợi (Bromage và Owens, 2002)

Vi khuẩn S iniae có thể lây truyền qua nguồn nước hay qua thức ăn chứa mầm bệnh Bệnh do S iniae có thể lây truyền khi nuôi chung cá khỏe với cá bệnh, cá mang vi khuẩn trong tự nhiên vào ao nuôi (Perera et al., 1994); có sự lan truyền mầm bệnh từ cá tự nhiên vào cá nuôi (Zlotkin et al., 1998) Việc nhiễm bệnh tự nhiên trong các hệ thống nuôi trồng thủy sản cho thấy S iniae

có thể tồn tại trong môi trường nước và xâm nhập vào cá khỏe Bệnh xảy ra nghiêm trọng khi nuôi cá với mật độ cao (Nguyen Huu Thinh, 2000)

S iniae được đào thải ra môi trường nước qua phân của cá bị nhiễm mầm

bệnh và nhiễm lên cá khỏe qua đường miệng Ngoài ra, mầm bệnh xâm nhập vào cơ thể cá khỏe qua việc ăn cá bệnh chết hoặc ăn cá đang hấp hối Việc sử dụng cá tạp bị nhiễm bệnh làm thức ăn làm bùng phát dịch bệnh trên cá bơn

Nhật Bản (Nguyen Huu Thinh et al., 2002) Ngoài ra còn có sự lan truyền

mầm bệnh giữa các loài khác nhau của cá tự nhiên và cá nuôi có thể xảy ra

trong môi trường nước (Colorni et al., 2002; Bromage và Owen, 2002)

Một số nghiên cứu được thực hiện để xác định khả năng lây nhiễm của vi

khuẩn S iniae trên cá khỏe Kết quả nghiên cứu cho rằng có sự lây nhiễm bệnh khi thả cá bị bệnh với cá khỏe Theo Nguyen Huu Thinh et al (2002), khi thả cá bơn Nhật Bản (Paralichthys olivaceus) khỏe với cá bệnh, S iniae

xâm nhập vào cơ thể của cá thông qua những vị trí thương tổn của da và vây của cá; mắt, mũi và mang cá là nơi vi khuẩn cảm nhiễm sau khi đã vào bên

trong cơ thể Trên cá rô phi (Oreochromis sp.), S iniae lan truyền qua chiều ngang (Pradeep et al., 2016) Theo Trần Vỹ Hích (2014), trong điều kiện gây nhiễm thực nghiệm cá chẽm bằng phương pháp ngâm, vi khuẩn S iniae tiếp

cận cơ thể cá từ mang, đi vào xoang tĩnh mạch rồi theo máu đến thận, lách, đến các cơ quan khác và gây nhiễm toàn thân

tổn thương tế bào và mô Bệnh do Streptococcus gây ra trên cá có thời gian ủ bệnh

khoảng 24 - 48 giờ ở nhiệt độ 25 - 350C (Plumb và Hanson, 2011)

Vi khuẩn S iniae sau khi xâm nhập vào cơ thể cá đã gia tăng số lượng và

bị thực bào bởi các đại thực bào Đại thực bào mang vi khuẩn theo máu trở về thận và lách Vi khuẩn không bị tiêu diệt bởi đại thực bào gia tăng số lượng tại hai cơ quan trên và khi vượt quá sức chống chịu của cơ thể cá, vi khuẩn sẽ tiếp tục nhiễm vào máu, sau đó được di chuyển đến khắp nơi trong cơ thể gây

nhiễm khuẩn toàn thân (Romalde et al., 1999)

Đặc tính gây bệnh của S iniae phụ thuộc vào khả năng xâm nhập và

nhân lên của chúng trong tế bào vật chủ, cũng như sự xâm nhập, tồn tại và sinh sản trong bạch cầu trung tính, trong các đại thực bào và trong các tế bào

vật chủ khác (Buchanan et al., 2008; Baiano và Barnes, 2009) Mặc dù những nghiên cứu về độc lực của vi khuẩn S iniae gây bệnh trên cá còn hạn chế

nhưng những tiến bộ trong lĩnh vực sinh học phân tử đã giúp cho các nghiên cứu xác định đặc tính gây bệnh, các yếu tố độc lực và xác định vai trò của các

yếu tố gây độc trong sự tiến triển của bệnh do S iniae gây ra trên cá

(Baiano và Barnes, 2009)

Thành phần protein M (SiM) ở thành tế bào vi khuẩn S iniae có vai trò

quan trọng trong việc gây bệnh trên cá, protein M kháng lại quá trình thực bào

và giúp vi khuẩn xâm nhập nhanh vào mô Vi khuẩn S iniae tiết ra ngoại độc

tố là streptolysin S, là một polypeptid gây độc cho nhiều tế bào, bao gồm cả tế bào lympho, hồng cầu, bạch cầu trung tính và tế bào của các mô (Baiano và Barnes, 2009)

Kết quả nghiên cứu của Buchanan et al (2008) cho thấy nếu sử dụng những chủng S iniae thiếu hoạt tính của streptolysin S, vi khuẩn không có khả năng gây chết cá Morone saxatilis ngay cả khi sử dụng nồng độ cảm nhiễm

cao (liều LD90), trong khi sử dụng chủng vi khuẩn có hoạt tính của streptolysin

S, vi khuẩn gây chết cả ở nồng độ 2x105 CFU/mL Tương tự nghiên cứu của

Locke et al (2007), sử dụng chủng S iniae mật độ 3x105 CFU/mL tiêm vào

xoang bụng cá Morone saxatilis và chủng đã gây đột biến mất hoạt tính của

streptolysin S với nồng độ gấp 1000 lần so với nồng độ trên cảm nhiễm trên, sau 6 ngày thí nghiệm, tỷ lệ chết của cá cảm nhiễm với chủng có streptolysin S

là 80% trong khi chủng không có streptolysin S tỷ lệ chết chỉ 10%

2.3.6 Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng gây bệnh của vi khuẩn S iniae

Trong tất cả các bệnh do vi khuẩn gây ra, các điều kiện môi trường xung quanh có thể ảnh hưởng đến sự xâm nhập và bùng phát bệnh do vi khuẩn trên các loài cá nhạy cảm (Dilok, 2012) Đáp ứng miễn dịch đặc hiệu và không đặc hiệu của cá đều giảm đáng kể khi cá bị stress (Dilok, 2012; Trần Vĩ Hích, 2014) Do đó, stress đóng một vai trò quan trọng trong sự bùng phát của bệnh

do S iniae trong ao nuôi Một số yếu tố môi trường có thể gây stress cho cá

như nhiệt độ nước cao hoặc thấp, độ mặn cao, nồng độ oxy hòa tan thấp, chất lượng nước kém (như nồng độ amoniac hoặc nitrit cao), mật độ nuôi cao Các thông số chất lượng nước thay đổi đột ngột hoặc không thích hợp có thể làm cho bệnh bùng phát (Yanong và Floyd, 2002)

Một số nghiên cứu cho thấy các yếu tố môi trường như nhiệt độ nước cao,

lượng oxy hòa tan thấp góp phần vào sự bùng phát bệnh do S iniae ở cá rô phi

Khi cá bị stress do nhiệt độ nước cao hoặc nhiệt độ nước vượt ngưỡng giới hạn của cá, đáp ứng miễn dịch đặc hiệu và không đặc hiệu của cá giảm Nhiệt độ nước trên 27C ảnh hưởng đến sự cảm nhiễm và gây chết cá của S iniae ở cả cá

rô phi tự nhiên và cá thí nghiệm (Amal và Saad., 2011) Do đó, nhiệt độ nước

cao, có lợi cho sự phát triển của vi khuẩn và đây cũng là yếu tố làm tăng tính

nhạy cảm của cá rô phi với vi khuẩn S iniae Tuy nhiên, mức độ nghiêm trọng

của bệnh liên quan đến mật độ, độc lực của vi khuẩn và điều này cũng bị ảnh hưởng do nhiệt độ nước tăng Do vậy sự biến động của nhiệt độ ảnh hưởng đến

sự tiến triển của bệnh, đến mật độ, độc lực của vi khuẩn và làm cho cá dễ bị

nhiễm bệnh (Rodkhum et al., 2011) Theo Hossain et al (2014), giảm mật độ là chiến lược quản lý để hạn chế việc lây nhiễm S iniae trong các trại nuôi thâm

canh Khi nuôi với mật độ cao, hàm lượng các độc tố trong nước vượt ngưỡng cho phép, glucose và ammonium trong huyết tương tăng Việc giảm mật độ nuôi, nhiệt độ nước thích hợp, dừng cho ăn và thay nước là những biện pháp để

hạn chế sự lây lan bệnh S iniae ở cá rô phi nuôi thâm canh

Ngoài các yếu tố môi trường, một số nghiên cứu về sự đồng nhiễm trên

cá liên quan đến sự bùng phát bệnh do Streptococcus sp Sự nhiễm đồng thời của Gyrodactylus niloticus hoặc Ichthyophthirius với Streptococcus sp làm tăng tính nhạy cảm của cá với vi khuẩn S iniae Tỷ lệ chết của cá tăng khi đồng nhiễm Trichodina sp và S iniae Điều này có thể do ký sinh trùng gây ra

các vết thương tổn trên da, tạo điều kiện cho vi khuẩn dễ dàng xâm nhập và

gây bệnh (Evans et al., 2010)

2.3.7 Phương pháp chẩn đoán

Chẩn đoán bệnh do vi khuẩn gây ra ở cá cũng theo nguyên tắc như đối với các động vật có xương sống khác Khi bệnh bùng nổ, cần nắm rõ lịch sử xuất hiện bệnh, nhận biết các dấu hiệu bệnh lý, dấu hiệu đặc trưng của bệnh và

sự hiện diện của vi khuẩn gây bệnh Vi khuẩn S iniae thường được phân lập

từ lách, thận và não của cá bệnh trên môi trường TSA có bổ sung từ 1,5 – 2% NaCl và định danh bằng các phản ứng sinh hóa và giải trình tự gen 16S rRNA

(Rahmatullah et al., 2017)

Phương pháp mô bệnh học: lấy mô thận, lách, não cá bị bệnh, cố định trong formalin 10%, nhuộm với haematoxylin và eosin có thể quan sát được vi

khuẩn trong các mẫu mô và biến đổi mô bệnh do S iniae gây ra trên cá (Dewi

et al., 2015) Ngoài ra, phương pháp miễn dịch huỳnh quang được sử dụng để

phát hiện và xác định S iniae từ mẫu cá bệnh và từ môi trường nuôi cấy vi khuẩn (Evans et al., 2010) Sử dụng kính hiển vi điện tử quan sát mẫu mô tươi

cá tráp vây vàng (Sparus aurata) và cá tráp (Pagrus pagrus) bị bệnh có thể xác định được vi khuẩn S iniae tồn tại trong các mẫu mô (Aamri et al., 2015)

Phương pháp khuếch đại gen (PCR - polymerase chain reaction) cũng

được áp dụng trong chẩn đoán bệnh do vi khuẩn S iniae gây ra trên cá và cho

kết quả chẩn đoán chính xác với độ nhạy cao Phương pháp này giúp chẩn đoán

để xác nhận sự hiện diện của các vi khuẩn gây bệnh trên động vật thủy sản

(Aamri et al., 2015; Rahmatullah et al., 2017) Trần Thị Tuyết Hoa và ctv (2016), đã phát triển qui trình PCR đa mồi phát hiện đồng thời vi khuẩn S iniae

và S agalactiae trực tiếp từ mẫu mô cá bị bệnh, phương pháp này giúp phát

hiện chính xác vi khuẩn gây bệnh trong thời gian ngắn, góp phần quan trọng

trong chẩn đoán bệnh do S iniae gây ra trên cá Kỹ thuật khuếch đại gen bằng Real-time PCR đã được ứng dụng trong chẩn đoán bệnh do S iniae gây ra trên

cá rô phi (Oreochromis spp.) nuôi tại Malaysia (Rahmatullah et al., 2017)

2.3.8 Biện pháp phòng và trị bệnh

Thuốc kháng sinh được sử dụng rất phổ biến để trị bệnh do vi khuẩn gây

ra trên động vật thủy sản bằng cách trộn vào thức ăn và người nuôi thường sử dụng kết hợp nhiều loại kháng sinh và hóa chất để trị bệnh Tuy nhiên, việc sử dụng thuốc kháng sinh và hóa chất không đúng qui định và lặp đi lặp lại trong thời gian dài sẽ dẫn đến tình trạng kháng thuốc của vi khuẩn làm cho việc điều

trị ngày càng kém hiệu quả (Crumlish et al., 2010)

Streptomycin là loại thuốc có khả năng kháng cao với S iniae và S

agalactiae (Nguyễn Ngọc Phước và ctv., 2015) Tuy nhiên, nghiên cứu trước

đó chỉ ra rằng S iniae có khả năng kháng lại loại thuốc này (Musa et al., 2009) Theo Saleh et al (2017), ampicillin, penicilin và tetracyline trị bệnh do

S iniae gây ra trên cá rô phi (Oreochromis niloticus) có hiệu quả Tuy nhiên

việc điều trị bằng kháng sinh không nên được xem là cách quản lý dịch bệnh trên cá tốt nhất vì việc sử dụng kháng sinh không phù hợp có thể gây ra hiện tượng kháng thuốc Bên cạnh sự kháng thuốc thì vấn đề dư lượng thuốc trong sản phẩm thủy sản còn gây ảnh hưởng đến sức khỏe người tiêu dùng

Một trong những biện pháp thông thường để phòng bệnh do

Streptococcus sp hiệu quả trên cá là cải thiện chất lượng nước và điều kiện

môi trường Cho ăn vừa đủ, tránh dư thừa, tránh gây stress cho cá, loại bỏ kịp thời cá bệnh ra khỏi ao Định kỳ làm sạch ao nuôi và khử trùng toàn bộ dụng

cụ trong quá trình nuôi để giảm nguy cơ bùng phát dịch bệnh Ngoài ra cần tiêm phòng vắc xin cho cá, sử dụng một số loại thảo dược, chất kích thích

miễn dịch và chế phẩm sinh học để tăng cường miễn dịch cho cá (Austin và

Austin, 2007)

Vắc xin được xem là một trong những phương pháp tốt nhất để phòng bệnh truyền nhiễm Một số vắc xin được sử dụng để phòng bệnh do vi khuẩn

S iniae gây ra trên cá Bercovier et al (1997), đã tiêm vắc xin bất hoạt

formalin dẫn truyền bằng phương pháp tiêm vào xoang bụng để phòng bệnh

do vi khuẩn S iniae gây ra trên cá rô phi, với tỷ lệ bảo hộ (Relative Percentage

Survival – RPS) đạt 80 - 90% Trên cá chẽm, vắc xin phòng bệnh S iniae

được nghiên cứu đầu tiên ở Úc vào năm 2006 (Creeper và Buller, 2006), nghiên cứu này đã đạt được kết quả rất khả quan về khả năng đáp ứng miễn dịch dịch thể trên cá chẽm khi sử dụng phương pháp tiêm vắc xin bất hoạt vào xoang bụng với một lượng lớn kháng thể đặc hiệu được tìm thấy trong cả dịch nhầy và huyết thanh sau 21 ngày Tuy nhiên khi sử dụng vắc xin trong thực tế

ao nuôi, vắc xin phòng bệnh S iniae trên cá vài tuần sau đó cá bị bệnh Như

vậy, vắc xin có hiệu quả trong nghiên cứu nhưng trong quá trình thử nghiệm

sử dụng cho thấy hiệu quả vắc xin phụ thuộc vào loài cá cũng như loài vi khuẩn cảm nhiễm, chủng loại vắc xin, phương pháp sử dụng và tuổi của cá

(Agnew và Barnes, 2007) Sử dụng chủng vi khuẩn S iniae (VN091211R) bất

hoạt bằng formalin 0,5% phân lập từ cá bệnh tại Khánh Hòa đối với cá chẽm

giống và có tác dụng bảo vệ đặc hiệu cho cá thí nghiệm đề kháng bệnh do S

iniae gây ra trên cá chẽm, tỷ lệ bảo hộ đạt 76 - 89% tương ứng với liều công

cường lần lượt là 3x107 CFU/cá và 3x106 CFU/cá (Trần Vĩ Hích, 2014)

Một số chất kích thích miễn dịch không đặc hiệu như inositol,

levalmisole và β-glucan cũng đã được thử nghiệm trong việc phòng bệnh do S

iniae gây ra ở cá Tuy nhiên, inositol không có hiệu quả trong việc nâng cao tỉ

lệ sống hay đáp ứng miễn dịch của cá rô phi (Oreochromis niloticus) nhiễm S

iniae (Peres et al., 2004) β-glucan có hiệu quả trong việc phòng bệnh do S iniae gây ra trên cá rô phi (Salah et al., 2017)

Tuy nhiên vẫn còn nhiều vấn đề cần nghiên cứu trong việc phòng và trị

bệnh do S iniae gây ra trên cá Tính hiệu quả của các loại vắc xin, thảo dược

và chất kích thích miễn dịch phụ thuộc vào loài vi khuẩn, loài cá, cách sử dụng, nồng độ, các phương thức nuôi và các yếu tố khác Do đó, các biện pháp

phòng bệnh do S iniae gây ra trên cá có hiệu quả thấp, đặc biệt bệnh thường

xuất hiện khi nuôi với mật độ cao và chất lượng nước nuôi kém Hơn nữa mầm bệnh rất phổ biến trong môi trường nuôi nên rất khó loại bỏ mầm bệnh

trên cơ thể cá và trong môi trường Do đó việc phòng bệnh do S iniae gây ra

trên cá là vấn đề cần quan tâm nghiên cứu để hạn chế thiệt hại do bệnh gây ra trên cá chẽm

2.4 Hệ miễn dịch không đặc hiệu ở cá

2.4.1 Hàng rào vật lý

Hàng rào vật lý bao gồm da và các niêm mạc ngăn cách môi trường bên ngoài và bên trong cơ thể mà mọi yếu tố phải vượt qua khi muốn vào bên trong cơ thể Da gồm nhiều lớp tế bào, trong đó có lớp tế bào ngoài cùng đã sừng hóa luôn được bong ra và đổi mới nên tạo ra được một hàng rào cản trở các tác nhân xâm nhập khá vững chắc Niêm mạc chỉ có một lớp tế bào nhưng

có tác dụng cản trở tốt vì có tính đàn hồi cao hơn da và được bao phủ bởi lớp màng nhầy Niêm dịch là dịch nhầy do những tuyến ở dưới niêm mạc tiết ra, tạo nên một màng bảo vệ làm cho vi sinh vật và các vật lạ không bám được vào tế bào (Przybylska và Nielsen, 2012)

Dịch nhầy ở da và mang được xem là rào cản đầu tiên giúp ngăn chặn sự xâm nhiễm của các tác nhân gây bệnh Dịch nhầy ngăn ngừa sự xâm nhập của các tác nhân gây bệnh bằng cách bao bọc chúng và liên tục rửa trôi ra môi trường Mức độ sản sinh dịch nhầy có thể được gia tăng dưới sự kích thích của các yếu tố vật lý hoặc hóa học hay sự hiện diện của tác nhân gây bệnh Chất nhầy của cá có tính độc đối với một số vi sinh vật Tính chất này là do trong chất nhầy chứa lectin, pentraxin, lysozyme, bổ thể, peptide kháng khuẩn và globulin miễn dịch lớp M (IgM), thành phần quan trọng trong việc ức chế sự xâm nhập của các mầm bệnh (Ellis, 2001)

Kháng thể tự nhiên là một thành phần chính của đáp ứng miễn dịch tự nhiên Kháng thể tự nhiên này tồn tại chủ yếu ở huyết thanh của cá nhằm chống lại sự xâm nhập của vi khuẩn hoặc virus gây bệnh Ở cá có khả năng sản sinh ra kháng thể tự nhiên IgM để chống lại các kháng nguyên khác nhau Tuy nhiên cường độ của đáp ứng này mạnh hay yếu tùy thuộc vào từng loài cá và điều kiện

môi trường nuôi (Przybylska và Nielsen, 2012)

2.4.2 Hàng rào hóa học

Ngay trên da và niêm mạc của cá còn được tăng cường một số yếu tố hóa học tạo ra một hàng rào ngăn cản Trên da nhờ có các chất tiết tạo ra acid lactic, acid béo của tuyến mở dưới da làm cho một số vi khuẩn không tồn tại lâu được Tại niêm mạc, chất nhầy có khả năng tiết ra một số chất ức chế sinh trưởng của vi sinh vật như lysozyme, là loại enzym muramidase có tác dụng phân giải thành tế bào vi khuẩn (Boes, 2000; Przybylska và Nielsen, 2012) Trong huyết thanh có chứa lysozyme, các thành phần của bổ thể, interferon và các protein liên kết (Boes, 2000; Przybylska và Nielsen, 2012) Lysozyme là enzyme dung giải vi khuẩn được phân bố rộng trong cơ thể và là một phần của các cơ chế đáp ứng không đặc hiệu ở hầu hết động vật Các tế bào sản xuất lysozyme chủ yếu là bạch cầu đơn nhân và bạch cầu trung tính (Crosbie, 2001) Hoạt tính diệt khuẩn của lysozyme có liên quan đến việc phá hủy cấu trúc peptidoglycan của vách tế bào vi khuẩn, gây dung giải tế bào Mặt khác, enzyme này cũng đóng vai trò là opsonin làm hoạt hóa hệ thống bổ thể và các tế bào thực bào (Magnadottir, 2010)

Bổ thể là một hệ thống gồm nhiều thành phần do nhiều loại tế bào sản xuất nhưng lại tương tác với nhau để được hoạt hóa theo một chương trình nhất định Trong đáp ứng miễn dịch tự nhiên, bổ thể được hoạt hóa theo con đường không đặc hiệu (không cần kháng thể) bởi các chất như carbon hydrat, lipopolysaccharic của vi khuẩn, nhờ đó mà làm thủng màng tế bào và làm dung giải vi khuẩn (Yano, 1996)

Trên bề mặt tế bào và trong huyết thanh có những protein liên kết như lipopolysaccharide, lectin, lipit, mannose của vi khuẩn gây bệnh Sự liên kết này làm hạn chế sự phát triển của vi khuẩn, đặc biệt là protein liên kết sắt như lactoferrin hay transferrin có trong các chất tiết Do bị liên kết nên nồng độ sắt

tự do trong máu và trong các mô thấp hơn so với nhu cầu cần cho sự phát triển của vi sinh vật, làm cho chúng không sinh trưởng được (Crobie, 2001)

2.4.3 Hàng rào tế bào

Trong hệ thống miễn dịch ở cá hàng rào tế bào là hàng rào quan trọng và phức tạp nhất trong hệ thống miễn dịch Có nhiều loại tế bào tham gia vào đáp

ứng miễn dịch không đặc hiệu, tuy nhiên giữ vai trò quan trọng nhất là các thực bào có khả năng nuốt và tiêu hóa các vi sinh vật Trên niêm mạc có rất nhiều tế bào di tản ra từ nội môi bao gồm tiểu thực bào và đại thực bào có đặc tính chung là tiếp cận với các yếu tố lạ, nuốt và tiêu hóa chúng gọi là quá trình thực bào Tiểu thực bào là bạch cầu trung tính hoạt động mạnh với những vi khuẩn ngoài tế bào Đại thực bào là các tế bào mono ở máu di chuyển đến các

mô có tác dụng mạnh với các vi sinh vật có kích thước lớn (Przybylska và Nielsen, 2012)

Ở cá, chức năng của đại thực bào trong đáp ứng miễn dịch của cá bao gồm khả năng thực bào, tiêu diệt tế bào vi khuẩn nhờ vào phản ứng oxy hoá khử và tổng hợp nitric oxide, khả năng sản xuất interleukin-1, có chức năng xử

lý và trình diện kháng nguyên Sự bùng nổ các phản ứng oxy hoá khử hình thành trong quá trình thực bào đã tạo nên các sản phẩm có hoạt tính oxy hoá cao, có tính diệt khuẩn mạnh, chúng có thể bắt và tiêu hoá nhiều dạng mảnh nhỏ, kể cả các hạt carbon, vi khuẩn và nấm (Przybylska và Nielsen, 2012) Trong túi lysosome của các đại thực bào của cá có các túi nhỏ chứa melanin Vai trò của melanin vẫn chưa được chứng minh rõ, có thể chúng đóng vai trò quan trọng trong cơ chế tiêu diệt tế bào vi khuẩn hoặc làm chất xúc tác cho việc sản sinh các gốc tự do của đại thực bào (Magnadottir, 2010)

Ngoài ra, một số yếu tố bên trong và bên ngoài cơ thể có thể ảnh hưởng đến hệ thống miễn dịch không đặc hiệu Sự thay đổi một số yếu tố môi trường nuôi như nhiệt độ có thể ức chế đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu Việc bổ sung vào thức ăn một số chất kích thích miễn dịch và chế phẩm sinh học có thể làm tăng đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu ở cá (Magnadottir, 2010; Przybylska và Nielsen, 2012)

2.5 Đặc điểm huyết học ở cá

Trong máu cá có 5 loại tế bào phổ biến, đó là hồng cầu, tế bào lympho,

bạch cầu đơn nhân, bạch cầu trung tính và tiểu cầu (Zinkl et al., 1991) Trong máu cá chẽm cũng có 5 loại tế bào trên (Anderson, 1996) Số lượng tế bào

trong máu cá biến động phụ thuộc vào tuổi, tình trạng sức khỏe và các nhân tố

tác động bên trong và bên ngoài cơ thể cá (Kumar et al., 2007; Phạm Tân

Tiến, 2010)

2.5.1 Hồng cầu

Tế bào hồng cầu cá chẽm có dạng hình bầu dục và nhân hình tròn ở giữa

(Zinkl et al., 1991) Số lượng tế bào hồng cầu ở cá chẽm dao động từ 3,25 –

5,2x1012 tb/L và trung bình là 4,39x1012 tb/L (Anderson, 1996) Số lượng tế

bào hồng cầu trong cơ thể cá bị ảnh hưởng do nhiều nguyên nhân như tập tính sống của từng loài, cá sống ở tầng mặt sẽ có số lượng hồng cầu thấp hơn so với các loài cá sống ở tầng giữa và tầng đáy; ở cá đực có số lượng hồng cầu cao hơn cá cái, ngoài ra số lượng hồng cầu còn phụ thuộc vào chất lượng thức

ăn và tình trang sức khỏe của cá (Phạm Tân Tiến, 2010)

2.5.2 Bạch cầu

Bạch cầu là thành phần cơ bản của hệ thống miễn dịch, với chức năng bảo vệ giúp cơ thể chống lại các tác nhân gây bệnh, ảnh hưởng của các yếu tố bên trong và bên ngoài môi trường sống Quá trình tạo bạch cầu trong cơ thể đáp ứng cho việc bảo vệ cơ thể trong suốt thời kỳ cơ thể gặp tình trạng sốc hoặc nhiễm bệnh Bạch cầu là những tế bào máu có nhân, kích thước khác nhau tùy thuộc vào từng loại bạch cầu Các loại bạch cầu phổ biến trong máu

cá là tế bào lympho, bạch cầu đơn nhân và bạch cầu trung tính (Zinkl et al., 1991) Theo Anderson et al (1996), số lượng tổng bạch cầu trong máu cá

chẽm dao động từ 0,65 – 5,6x105 tb/mm3 và trung bình là 4,48x105 tb/mm3 Số lượng tổng bạch cầu trong máu cá bống kèo khỏe dao động từ 34 – 50x104tb/mL, trên cá bống kèo bệnh dao động từ 73 - 85x104 tb/mL, tăng so với cá khỏe (Nguyễn Thu Dung, 2016)

Bạch cầu đơn nhân là tế bào bạch cầu tham gia vào hệ thống miễn dịch không đặc hiệu với vai trò thực bào, tiêu diệt kháng nguyên và đặc biệt là khả năng trình diện kháng nguyên và để thực hiện bước khởi đầu của quá trình đáp

ứng miễn dịch đặc hiệu (Zinkl et al., 1991) Bạch cầu đơn nhân được hình

thành trong thận và là tiền thân của đại thực bào, số lượng bạch cầu đơn nhân giảm khi cá bị bệnh nặng, những con cá khỏe trong ao cá bị bệnh, số lượng bạch cầu đơn nhân tăng (Ellis, 2001)

Bạch cầu trung tính có khả năng thực bào các vật có kích thước nhỏ như vi khuẩn và có khả năng di chuyển xuyên qua các mao mạch đến những nơi bị