3.2.3.1. Tinh dầu
Chuẩn bị dịch chấm sắc kí: 1giọt tinh dầu được pha loãng trong 1ml ether dầu hỏa ( 60 – 90 ).
Bản mỏng: Silicagel G đã hoạt hóa ở 100ºC trong khoảng 1 giờ.
Dung môi khai triển: ether dầu hỏa – EtOAc ( 9/1 ) [8].
Quan sát dưới ánh sáng tử ngoại tại bước sóng = 366 nm.
Hiện màu: bằng dung dịch vanilin 1% trong acid sulfuric ( TT ), sấy bản mỏng ở 110ºC trong 10 phút.
Kết quả: Theo Bảng 3.2
Khi chưa phun thuốc thử:
- Quan sát dưới ánh sáng tử ngoại bước sóng
=254nm : có 10 vết
( Rf = 1, 5, 7,21,23, 27, 33, 39, 55, 60 ). - Quan sát dưới ánh sáng tử ngoại bước sóng
=366nm : có 8 vết
( Rf = 1, 5, 7,21,23, 27, 33, 39 ).
Sau khi phun TT vanillin 1% quan sát dưới ánh sáng thường: có 10 vết
( Rf = 1, 5, 7,21,23, 27, 33, 39, 55, 60 ). a b
Trong các vết, nhận thấy một số vết đáng chú ý:
- Vết 9 ( Rf×100 = 55) và vết 10 ( Rf×100 = 60) chỉ quan sát được tại UV254nm
mà không quan sát được tại UV 366nm, hiện màu vàng nâu và nâu sau khi phun TT vanilin 1% ( quan sát ở ánh sáng thường ).
- Vết 6 ( Rf×100 = 27) hiện màu rõ nhất, cả ở UV254nm và UV366nm, hiện màu
xanh đen sau khi phun TT vanillin 1% ( quan sát ở ánh sáng thường ).
Bảng 3.2. Kết quả định tính bằng SKLM của tinh dầu mạn mạn kinh tử
Ghi chú: +: rất mờ; ++: mờ; +++: rõ; ++++: rất rõ.
3.2.3.2. Flavonoid
Chuẩn bị dịch chấm sắc kí: dịch chiết cồn 90º của mạn kinh tử.
Bản mỏng: Silicagel G đã hoạt hóa ở 100ºC trong khoảng 1 giờ.
Dung môi khai triển: Toluen : EtOAc : acid formic ( 5 / 4,5 /1).
Quan sát dưới ánh sáng tử ngoại tại bước sóng = 254nm, = 366 nm
STT Rf ×100 Màu sắc
UV254nm UV366nm Hiện màu
1 1 Xanh +++ XD +++ Nâu
2 5 XĐ ++++ XD +++ Nâu
3 7 Xanh ++ XD +++ Nâu
4 21 Xanh + XD +++ Xanh đen
5 23 Xanh đậm ++++ XD ++ Nâu 6 27 XD ++++ XD ++++ Xanh đen 7 33 XĐ +++ XĐ + Vàng nâu 8 39 XĐ ++ XĐ ++ Tím 9 55 XĐ +++ Vàng nâu 10 60 XĐ ++++ Nâu
Kết quả:
Bảng 3.3. Kết quả định tính bằng SKLM của flavonoid từ mạn kinh tử STT Rf×100 Màu UV254nm UV366nm 1 1 XĐ +++ XD +++ 2 30 Đen + 3 41 XĐ ++ XLC ++++ 4 48 XĐ +++ XD ++++ Ghi chú: +: rất mờ; ++: mờ; +++: rõ; ++++: rất rõ.
- Quan sát dưới ánh sáng tử ngoại bước sóng
=254nm: có 3 vết ( Rf = 1, 41, 48 ).
- Quan sát dưới ánh sáng tử ngoại bước sóng
=366nm : có 4 vết ( Rf = 1, 30, 41, 48).
3.3. Tác dụng của cao chiết cồn 90º mạn kinh tử đối với hành vi lo lắng và cải thiện trí nhớ/nhận thức
3.3.1. Tác dụng của cao chiết cồn mạn kinh tử đối với hành vi lo lắng
Đánh giá tác dụng giảm lo lắng bằng phương pháp theo dõi khả năng vận động của chuột bằng máy đếm hồng ngoại.
Kết quả ở bảng 3.4 cho thấy không có sự khác biệt về khả năng vận động đạt ý nghĩa thống kê giữa nhóm OVX so với nhóm Sham hoặc OVX + VT (1,6 g/kg ) hoặc OVX + progynova. Tuy nhiên, giảm khả năng vận động ở nhóm OVX + VT ( 3,2 g/kg ) so với nhóm OVX, đạt ý nghĩa thống kê ( p < 0,05 ). Hình 3.4. Sắc kí đồ của flavonoid từ mạn kinh tử quan sát dưới ánh sáng tử ngoại ở bước sóng = 254nm (a),=366nm (b) a b
Bảng 3.4. Tác dụng của cao chiết cồn mạn kinh tử trên thử nghiệm đánh giá hoạt động tự nhiên của chuột
*: p < 0,05 so với nhóm OVX
3.3.2. Tác dụng cải thiện trí nhớ/nhận thức của cao chiết cồn mạn kinh tử
Đánh giá trên thời gian tiềm ẩn tìm thấy platform:
Bảng 3.5. Thời gian tiềm ẩn tìm thấy platform
Lô thí nghiệm
Thời gian tiềm ẩn tìm thấy platform (s)
Ngày 1 Ngày 2 Ngày 3 Ngày 4 Ngày 5 Ngày 6 Ngày 7 Sham 33,1±2,6 27,4±4,4 23,7±4,1 17,7±3,9* 15,0±2,5** 15,8±3,0** 14,3±2,5** OVX 35,7±3,2 35,5±5,3 32,4±5,3 32,6±5,6 27,3±7,0 28,8±7,9 23,7±4,7* OVX + VT 1,6 g/kg 31,8±4,8 24,3±2,9 33,4±4,7 28,3±1,6 25,8±2,4 20,7±9,0* 21,0±3,4 OVX + VT 3,2 g/kg 37,6±3,6 23,2±3,1 25,0±4,6 26,4±4,4 20,6±4,2 18,6±3,2 18,8±3,7* OVX + Progynova 30,9±3,6 26,9±3,2 28,2±3,0 25,4±4,1 23,6±4,9* 23,2±4,9 19,2±5,8*
*: p < 0,05; **: p < 0,01 so với ngày 1 trong cùng một nhóm
Lô thí nghiệm N Liều (g/kg) Thời gian vận động (s)
Sham 10 - 119,25 ± 7,15 OVX 11 - 120,01 ± 6,39 OVX + VT 11 1,6 111,48 ± 8,14 OVX + VT 11 3,2 104,29 ± 8,45* OVX + Progynova 11 0,0005 117,71 ± 11,61 0.0 10.0 20.0 30.0 40.0 50.0 1 2 3 4 5 6 7 Sham OVX OVX + Progynova OVX + VT 1,6 g/kg OVX + VT 3,2 g/kg Th ời gi an t iề m ẩn ( giây ) Ngày
Ở bài tập không có platform: chuột ở các nhóm khác nhau đều có khả năng tìm thấy platform nằm dưới mặt nước 1 cm, với thời gian tiềm ẩn ngắn dần ở các ngày luyện tập kế tiếp. Ở nhóm Sham, giảm thời gian tiềm ẩn có ý nghĩa thống kê từ ngày thứ 4 đến ngày thứ 7 ( p < 0,01; p < 0,05 ). Thời gian tiềm ẩn của nhóm OVX cũng giảm qua các bài tập, tuy nhiên cần thời gian dài hơn để tìm thấy platform so với nhóm Sham (p < 0,05 ở ngày thứ 7). Thời gian tiềm ẩn của nhóm OVX + VT và OVX + Progynova cũng đã được rút ngắn từ ngày thứ 7 qua các ngày tập (p < 0,05 ở ngày thứ 7). Nếu so sánh thời gian tiềm ẩn để tìm thấy platform giữa các nhóm ở ngày thứ 7, kết quả cho thấy nhóm Sham, OVX + VT và OVX + Progynova có thời gian tiềm ẩn để tìm thấy platform ngắn hơn nhóm OVX.
Tỷ lệ thời gian chuột ở cung phần tư đích ( % )
Sau 7 ngày luyện tập, đến ngày thứ 8, chuột được đánh giá khả năng củng cố lại trí nhớ.
Hình 3.5. Biều đồ cột biểu diễn tỷ lệ thời gian chuột ở cung phần tư đích (%)
*p<0,05 so với nhóm Sham không được điều trị
a â 0 10 20 30 40 50 0 0 1,6 0,005 VT (g/kg) Progynova (mg/kg) Sham 3,2 * * * * OVX Sham Tỷ lệ t hờ i g ia n c huộ t ở cung phầ n tƣ đí ch (%)
Ở bài tập này, platform đã được lấy ra khỏi bể bơi. Thời gian chuột ở cung phần tư đích (cung phần tư mà trong những bài tập trước có platform) sẽ được ghi lại để đánh giá khả năng củng cố trí nhớ của chuột.
Kết quả ở hình 3.5 cho thấy: nhóm chuột OVX có tỷ lệ thời gian ở cung phần tư đích ít hơn so với nhóm Sham (p < 0,05). Chuột OVX được uống Progynova hoặc cao chiết VT (1,6 g/kg và 3,2 g/kg) có tỷ lệ thời gian ở cung phần tư đích nhiều hơn so với nhóm chuột OVX và gần tương đương với nhóm Sham.
Như vậy, cao chiết VT với liều 1,6 g/kg và 3,2 g/kg có tác dụng cải thiện trí nhớ/nhận thức trên chuột OVX
3.3.3. Trọng lượng tử cung – vòi trứng
Kết thúc các bài tập đánh giá hành vi sau 2 tuần điều trị, sẽ bóc tách tử cung – vòi trứng của chuột và cân trọng lượng.
Bảng 3.6. Tác dụng của cao chiết cồn mạn kinh tử trên trọng lượng tử cung – vòi trứng của chuột OVX
**: p < 0,01; *: p < 0,05 so với nhóm OVX
Kết quả được trình bày ở bảng 3.6 và cho thấy: sau 2 tuần được điều trị bằng mẫu nghiên cứu/thuốc chuẩn, trọng lượng tử cung – vòi trứng của chuột đều tăng. Trong đó, nhóm OVX + Pronovgya tăng trọng lượng tử cung
Lô thí nghiệm N Liều
(g/kg) Trọng lƣợng tử cung – vòi trứng (mg %) % tăng Sham 13 - 139,26 ± 15,49 - OVX 11 - 78,26 ± 8,94 - OVX + VT 9 1,6 134,67 ± 19,66* 72,08 OVX + VT 9 3,2 117,65 ± 15,54* 50,33 OVX + Progynova 10 0,0005 366,69 ± 50,76** 359,24
lên đến 359,24% ( p < 0,01 ), nhóm OVX + VT 1,6 g/ kg và 3,2 g/kg có trọng lượng tử cung – vòi trứng tăng 72,08 % và 50,33 % ( p < 0,05 ) so với nhóm OVX.
Như vậy, nhóm OVX + VT 1,6 g/kg và 3,2 g/kg có tác dụng làm tăng trọng lượng tử cung – vòi trứng.
3.4. Bàn luận
Trong giai đoạn mãn kinh ở phụ nữ, chức năng của buồng trứng suy thoái và hàm lượng hormone sinh dục nữ ( estrogen ) trong cơ thể hạ thấp gây nên các triệu chứng như bốc hỏa, mất ngủ, lo lắng, stress, dễ thất vọng, trầm cảm, nổi cáu, mệt mỏi, giảm trí nhớ….Theo kinh nghiệm dân gian, mạn kinh tử được sử dụng để điều trị các bệnh như cảm mạo phong nhiệt, đau đầu, chóng mặt, nhức bên thái dương, tối tăm mặt mũi, đau mắt, đỏ mắt, nhiều nước mắt, hoa mắt, mắt mờ nhìn không rõ…Do đó mạn kinh tử có thể có tác dụng trong điều trị một số triệu chứng của hội chứng mãn kinh.
Trong chi Vitex có 2 loài là Vitex agnus – catus L. và Vitex rotundifolia
L. đã được nghiên, đánh giá tác dụng như estradiol và ở giai đoạn mãn kinh. Từ dịch chiết chloroform của quả Vitex agnus – catus L. đã phân lập được casticin, vitexilactone, pinnatasterone and 17 – OH – progesterone và thử tác dụng dược lý trên mô hình OVX thu được kết quả: dịch chiết chloroform từ quả tăng đáng kể trọng lượng tử cung và tăng tổng nồng độ estrogen, progesterone trong huyết tương, đồng thời làm giảm prolactin huyết tương; có tác dụng giảm các triệu chứng tiền mãn kinh [17]. Tiếp đến là nghiên cứu trên loài Vitex rotundifolia L. Từ dịch chiết cồn của quả Vitex rotudinfolia L. thu được 4 thành phần chính là: casticin,luteolin, rotundifuran và agnuside đã được thử nghiệm và cho hoạt động giống như estrogen[23]. Các nghiên cứu về thành phần hóa học của quả Vitex trifolia L. (mạn kinh tử) đã chứng minh nó có chứa các thành phần: casticin, luteolin (flavonoid ), rotundifuran
(diterpen), vitexilactone (lactone)… và được biết đến là các chất có cấu trúc phytoestrogen. Các chất này cũng được phân lập từ quả của Vitex agnus – catus L., Vitex rotundifolia L. và cho tác dụng như estrogen. Từ những bằng chứng trong kinh nghiệm y học dân gian và các bằng chứng thực nghiệm của y học hiện đại,chúng tôi dự đoán quả của Vitex trifolia L. (mạn kinh tử) có thể có tác dụng ở phụ nữ giai đoạn mãn kinh và đã tiến hành nghiên cứu “tác dụng giảm lo lắng, cải thiện trí nhớ của mạn kinh tử trên mô hình OVX“
Trong nghiên cứu này chúng tôi đã sử dụng mô hình OVX là mô hình động vật thực nghiệm để đánh giá tác dụng hướng estrogen, cải thiện trí nhớ / nhận thức, giảm lo lắng, chống loãng xương, đánh giá trên than nhiệt, tim mạch, hô hấp… ở phụ nữ giai đoạn mãn kinh. Mô hình này hiện đang được sử dụng phổ biến trên thế giới tuy nhiên chưa có nghiên cứu nào áp dụng mô hình OVX để đánh giá tác dụng giảm lo lắng, cải thiện trí nhớ ở phụ nữ mãn kinh và cũng chưa có nghiên cứu về tác dụng của Mạn kinh tử ở phụ nữ giai đoạn mãn kinh.
Kết quả thực nghiệm cho thấy cao chiết cồn mạn kinh tử ở liều 3,2g/kg có tác dụng làm giảm khả năng vận động và cải thiện trí nhớ ở chuột OVX bằng thử nghiệm đánh giá hoạt động tự nhiên và thử nghiệm mê lộ nước Morris. Mặc dù trên thế giới đã có một số nghiên cứu về thành phần hóa học và tác dụng sinh học của mạn kinh tử, nhưng kết quả nghiên cứu của chúng tôi là hoàn toàn mới và hiện chưa có kết quả nghiên cứu nào về tác dụng giảm lo lắng, cải thiện trí nhớ ở phụ nữ mãn kinh của mạn kinh tử được công bố. Đây là những kết quả ban đầu và là tiền đề cho các nghiên cứu sâu hơn về thành phần hóa học cũng như tác dụng hướng estrogen của mạn kinh tử.
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 1. KẾT LUẬN
Trong khuôn khổ khóa luận tốt nghiệp với đề tài “ Nghiên cứu thành phần hóa học và tác dụng cải thiện trí nhớ, giảm lo lắng của cây Mạn kinh tử Vitex trifolia L“ đã thu được các kết quả sau:
Về đặc điểm vi học: Kết quả soi đặc điểm bột dược liệu ( mạn kinh tử ) và
vi phẫu của quả Mạn kinh phù hợp với đặc điểm được mô tả trong DĐVN IV.
Về thành phần hóa học: Định tính các nhóm chất hữu cơ bằng phản ứng
hóa học và sắc ký lớp mỏng đã xác định được thành phần của Mạn kinh tử gồm có tinh dầu ( phát hiện 10 vết trên sắc kí đồ ), flavonoid ( phát hiện 3 vết trên sắc kí đồ ), alkanoid, acid hữu cơ.
Về tác dụng dược lý: cao chiết cồn mạn kinh tử ở liều 3,2g/kg có tác
dụng làm giảm khả năng vận động và cải thiện trí nhớ/nhận thức ở chuột OVX bằng thử nghiệm đánh giá hoạt động tự nhiên và thử nghiệm mê lộ nước Morris. Ngoài ra còn có tác dụng tăng trọng lượng tử cung – buồng trứng.
2. ĐỀ XUẤT
Do thời gian có hạn, kết quả nghiên cứu của chúng tôi mới chỉ là những bước đầu, chúng tôi đề xuất:
Nghiên cứu sâu hơn về thành phần hóa học của mạn kinh tử. Định lượng các thành phần có tác dụng dược lý như tinh dầu, flavonoid. Phân lập các thành phần ở các dung môi khác nhau.
Tiếp tục nghiên cứu tác dụng của cao chiết cồn mạn kinh tử ở các liều khác và nghiên cứu tác dụng trên các phân đoạn chiết khác nhau.
Nghiên cứu các tác dụng dược lý khác như: tác dụng trên tế bào ung thư, tác dụng kháng Histamin.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt
1. Bộ môn Dược liệu trường đại học Dược Hà Nội (2003), Thực tập dược liệu, Trung tâm thông tin – Thư viện trường đại học Dược Hà Nội.
2. Bộ Y tế (2004), Bài giảng dược liệu tập 1 và tập 2, NXB Y học, Hà Nội. 3. Bộ Y tế (2009), Dược điển Việt Nam IV , NXB Y học, Hà Nội, tr. 183 – 184.
4. Nguyễn Văn Bởi (2004), Thành phần hóa học của tinh dầu cây mạn kinh ( Vitex trifolia L.f, ) ở Thừa Thiên Huế, Trường đại học sư phạm – Đại học Huế.
5. Võ Văn Chi, Dương Đức Tiến ( 1978 ), Phân loại thực vật bậc cao, NXB ĐH và THCN, Hà Nội.
6. Võ Văn Chi (1997), Từ điển cây thuốc Việt Nam, NXB Y học, Hà Nội, tr. 714 – 715.
7. Nguyễn Viết Đàn, Nguyễn Viết Tựu (1985), Phương pháp nghiên cứu hóa học cây thuốc, NXB Y học, Hà Nội.
8. Trịnh Thanh Huyền ( 1997 ), Khóa luận dược sĩ “ Sơ bộ nghiên cứu thành phần hóa học và tác dụng kháng khuẩn của Mạn kinh tử “.
9. Đỗ Tất Lợi ( 1999 ), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB Y học, Hà Nội, tr. 618 – 619.
10. Vũ Xuân Phương ( 2000 ), Thực vật chí Việt Nam – tập 6, NXB Khoa học - kĩ thuật, Hà Nội.
11. Viện dược liệu (2006), Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam – tập 2, NXB Khoa học – kĩ thuật, Hà Nội, tr. 224 – 225.
Tiếng Anh
12. Alam G, Wahyuono S, Ganjar IG, Hakim L, Timmerman H, Verpoorte R. (2002), “Tracheospasmolytic activity of viteosin – A and vitexicarpin isolated from Vitex trifolia “, Planta Med, 68, 1047 – 1049.
13. Chen YS, Xie JM, Yao H, Lin XY, Zhang YH (2010), “Studies on the triterpenoids of Vitex trifolia”, Zhong Yao Cai.33(6), 908 – 910.
14. Danilovich N, Babu PS, Xing W, Gerdes M, Krishnamurthy H, Sairam MR (2000), “Estrogen deficiency, obesity, and skeletal abnormalities in ffollicle – stimulating hormone receptor knockout ( FORKO ) female mice,
Endocrinology 141, 4295 – 4308.
15. Geetha V, Doss A, Doss AP (2004), “Antimiceobial potential of Vitex trifolia L.”, Ancient science of life, Vol XXWIII (4), 30 – 32.
16. Gu Q, Zhang XM, Zhou J, Qiu SX, Chen JJ (2008), “One new dihydrobenzofuran lignan from Vitex trifolia”, Journal of Asian Natural Products Research, 10:6, 499 – 502.
17. Ibrahim NA, Shalaby AS, Farag RS, Elbaroty GS, Nofal S and Hassan E ( 2006), “Phytochemical Investigation and Hormonal Activity of Vitex agnus- castusFruits growing in Egypt”, JASMR VOL.NO.1.
18. Ikram M, Khattak SG, Gilani SN (1987), “Antipyretic studies on some indigenous Pakistani medicinal plants: II.”, Journal of Ethnopharmacology, 19(2), 185 – 192.
19. Ikawati Z, Wahyuono S, Maeyama K (2001), “Screening of several Indonesian medicinal plants for their inhibitory effect on histamine release from RBL-2H3 cells”, Journal of Ethnopharmacology, 75(2 – 3), 249 – 256. 20. Heikkinen T, Puolivali J, Tanila H (2004): Effects of long-term ovariectomy and estrogen treatment on maze learning in aged mice,
21. Hernández MM, Heraso C, Villarreal ML, Vargas-Arispuro I, Aranda E (1999), “Biological activities of crude plant extracts fromVitex trifolia L.