nghiên cứu con đường xâm nhiễm của vi khuẩn streptococcus iniae vào cá chẽm (lates calcarifer) và đánh giá khả năng phòng bệnh do streptococcus iniae gây ra bằng cách ngâm cá trong vaccine

Trang i Đồ án tốt nghiệp Đại học Chuyên ngành BHTS LỜI CẢM ƠN Thực tập tốt nghiệp thật hội quan trọng để sinh viên nói chung, sinh viên chuyên ngành Bệnh học thủy sản nói riêng tiếp cận với thực tế nghề nghiệp, rèn luyện phương pháp nghiên cứu khoa học hoàn thiện kỹ thực hành cần thiết trước rời khỏi giảng đường đại học Những kiến thức đúc kết bước đệm vững chắc, hỗ trợ cho cơng việc thực tế sau Trong thời gian hồn thành đồ án tốt nghiệp, cố gắng thân, nhận giúp đỡ nhiều quan cá nhân Với tất chân thành lịng biết ơn sâu sắc tơi xin gởi lời cảm ơn tới: Thạc sĩ Trần Vĩ Hích-giáo viên hướng dẫn, người định hướng, động viên tạo điều kiện thuận lợi để thực đề tài Tiến sĩ Nguyễn Hữu Dũng-giám đốc trung tâm Giống Dịch bệnh thủy sản, trường Đại học Nha Trang tạo điều kiện cho học hỏi thực đề tài Ban chủ nhiệm Khoa Nuôi trồng Thủy sản, thầy cô môn Bệnh học thủy sản giúp đỡ tơi suốt q trình thực đề tài Cuối tơi xin cảm ơn gia đình, bạn bè người thương yêu bên cạnh, giúp tơi có thêm sức mạnh thực tốt đề tài Tôi xin chân thành cảm ơn! Nha Trang, tháng 06 năm 2012 Sinh viên thực Võ Thị Mỹ Dung GVHD: Th.s.Trần Vĩ Hích SVTH: Võ Thị Mỹ Dung Đồ án tốt nghiệp Đại học Trang ii Chuyên ngành BHTS MỤC LỤC Trang LỜI CẢM ƠN .i MỤC LỤC ii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT iv DANH MỤC CÁC BẢNG v DANH MỤC CÁC HÌNH vi MỞ ĐẦU PHẦN 1: TỔNG QUAN 1.1 Một số đặc điểm sinh học cá chẽm 1.2 Tình hình nghiên cứu bệnh Streptococcosis cá 1.2.1 Bệnh Streptococcosis .4 1.2.2 Bệnh vi khuẩn Streptococcus iniae gây cá 1.2.2 Bệnh Streptococcus iniea gây cá chẽm 1.3 Vaccine 1.3.1 Tình hình nghiên cứu phát triển vacxin cá giới 1.3.2 Tình hình nghiên cứu vaccine phịng bệnh Streptococcosis cá 10 1.3.3 Tình hình nghiên cứu triển vọng sử dụng vacxin Việt Nam 13 PHẦN 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 2.1 Đối tượng, thời gian địa điểm nghiên cứu 14 2.2 Vật liệu nghiên cứu 14 2.2.1 Môi trường 14 2.2.2 Hóa chất 14 2.2.2.1 Hóa chất sản xuất vaccine, xác định đặc điểm sinh hóa 14 2.2.2.2 Hóa chất nhuộm mơ hóa miễn dịch 14 2.2.3 Dụng cụ, thiết bị 15 2.2.3.1 Nuôi cấy vi khuẩn, sản xuất vaccin cắt mô 15 2.2.3.2 Xác định hiệu vaccin 15 2.3 Phương pháp nghiên cứu 15 GVHD: Th.s.Trần Vĩ Hích SVTH: Võ Thị Mỹ Dung Đồ án tốt nghiệp Đại học Trang iii Chuyên ngành BHTS 2.3.1 Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu (Hình 2.1) 15 2.3.2 Kiểm tra số đặc điểm sinh hóa hai chủng Streptococcus iniae 15 2.3.3 Nuôi cấy vi khuẩn chuẩn bị vacxin Streptococcus iniae bất hoạt 16 2.2.4.1 Bố trí thí nghiệm thu mẫu 18 2.2.4.2 Xử lý mẫu 18 2.2.4.3.Quy trình nhuộm mơ hóa miễn dịch 18 2.2.5 Phương pháp đánh giá hiệu vaccine 19 2.2.5.1 Chuẩn bị cá thí nghiệm 19 2.2.5.2 Xác định liều gây chết 50% (LD50) phương pháp ngâm 21 2.2.6 Bố trí thí nghiệm cảm nhiễm ngược, xác định tỷ lệ sinh tồn tương đối RPS (%) 21 2.2.7 Phương pháp thu thập xử lý số liệu 21 2.2.7.1 Phương pháp xác định thông số 21 2.2.7.2 Phương pháp xử lý số liệu 22 PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 23 3.1 Các đặc điểm sinh hóa hai chủng vi khuẩn Streptococcus inae 23 3.2 Kết LD50 (%) độc lực chủng vi khuẩn Strep1 25 3.3 Sự xâm nhiễm vi khuẩn S iniae cá chẽm 27 3.4 Đánh giá mức độ an toàn vaccine 31 3.5 Kết cảm nhiễm cá sau dẫn truyền vaccine tỷ lệ sinh tồn tương đối RPS (%) 33 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 38 4.1 Kết luận 38 4.2 Đề xuất ý kiến 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO 39 GVHD: Th.s.Trần Vĩ Hích SVTH: Võ Thị Mỹ Dung Đồ án tốt nghiệp Đại học Trang iv Chuyên ngành BHTS DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT API Strep Tên KIT định danh BA Blood agar CFU ( Colony forming unit) Đơn vị hình thành khuẩn lạc DAB 3,3’-Diaminobenzidinetetrahydrochloride ĐC Đối chứng g Gravity h Giờ LD50 Liều gây chết 50% Mabs (Mono-antibody) Kháng thể đơn dòng NT Nghiệm thức PBS Phosphate buffered saline ppt Nồng độ phần nghìn RPS (Relative percent survival) Tỷ lệ sinh tồn tương đối SE Sai số chuẩn SGR (specific growth rate) Tốc độ sinh trưởng đặc trưng SL (standard length) Chiều dài thân (không kể đuôi) TBS Tris Buffered Saline TSA Trypticase Soy Agar TSB Trypticase Soy Broth w/v (weight / volume ) Khối lượng / thể tích v/v (volume / volume) Thể tích / thể tích GVHD: Th.s.Trần Vĩ Hích SVTH: Võ Thị Mỹ Dung Trang v Đồ án tốt nghiệp Đại học Chuyên ngành BHTS DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1 So sánh đặc điểm sinh hóa chủng Strep1, Strep với S iniae từ nghiên cứu khác 24 Bảng 3.2 Tốc độ sinh trưởng đặc trưng theo chiều dài cá chẽm nghiệm thức 32 Bảng 3.3 Tỷ lệ chết trung bình tỷ lệ sinh tồn tương đối nghiệm thức 34 GVHD: Th.s.Trần Vĩ Hích SVTH: Võ Thị Mỹ Dung Trang vi Đồ án tốt nghiệp Đại học Chuyên ngành BHTS DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 1.1 Cá chẽm Lates calcarifer Hình 2.1: Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu 16 Hình 2.2: Sơ đồ quy trình nghiên cứu mơ hóa miễn dịch 17 Hình 2.3 Sơ đồ thí nghiệm đánh giá khả bảo vệ vaccine 20 Hình 3.1: Khuẩn lạc chủng vi khuẩn Streptococcus iniae môi trường BA bổ sung 5% máu cừu 2% NaCl (A); mẫu soi tươi vi khuẩn nuôi môi trường TSB (B) 23 Hình 3.2: Đồ thị tương quan tỷ lệ cá chết với nồng độ vi khuẩn chủng Strep1 thí nghiệm xác định LD50 (%) phương pháp ngâm 26 Hình 3.3: Tỷ lệ chết tích lũy cá chẽm nồng độ vi khuẩn khác cảm nhiễm phương pháp ngâm 26 Hình 3.4: Một số dấu hiệu bệnh lý cá chẽm bị nhiễm bệnh S iniae cảm nhiễm phương pháp ngâm (A) xuất huyết bụng, (B) màu sắc thể đen tối, xuất huyết gốc vây ngực 27 Hình 3.5: Sự diện cuả vi khuẩn () quan khác nhau: (A, B) mang, (C, D) mô thận, (E, F) lách Lách (E) thể thối hóa () 28 Hình 3.6: Mơ gan ruột cá chẽm sau cảm nhiễm với S iniae: (A, B) mô gan thể xuất vi khuẩn (), hình thành khơng bào () thối hóa (); (C, D) mơ ruột có nhiều vi khuẩn bên () 29 Hình 3.7: Sự diện cuả vi khuẩn () mắt (A, B) não (C, D) cá chẽm sau cảm nhiễm S iniae phương pháp ngâm 30 Hình 3.8 Tỷ lệ chết tích lũy (%) cá chẽm nghiệm thức khác 33 GVHD: Th.s.Trần Vĩ Hích SVTH: Võ Thị Mỹ Dung Đồ án tốt nghiệp Đại học Trang Chuyên ngành BHTS MỞ ĐẦU Nghề nuôi tơm sú vào giai đoạn thối trào làm cho nghề nuôi trồng thủy sản Việt Nam phải chuyển hướng sang đối tượng thay Trong nỗ lực thay đổi đó, cá chẽm đưa vào nghiên cứu chuyển giao cho người nuôi Với ưu tốc độ sinh trưởng nhanh, dễ nuôi, suất ni cao có giá trị kinh tế, cá chẽm đối tượng nuôi quan trọng nhiều vùng nước ta Tuy nhiên, phát triển nghề ni cá chẽm gia tăng nhanh chóng quy mơ diện tích, đồng thời thiếu quản lý, quy hoạch trình phát triển thời gian qua dẫn đến số vấn đề môi trường dịch bệnh, kết báo cáo dịch bệnh đối tượng nuôi xuất với tần số ngày tăng Một bệnh nguy hiểm thường gặp thông báo cá chẽm kể đến bệnh Streptococcosis vi khuẩn Streptococcus iniae gây Bệnh bắt gặp nhiều hệ thống nuôi cá chẽm Việt Nam số quốc gia giới với tỷ lệ gây chết lớn lên đến 70% thời gian ngắn, gây thiệt hại kinh tế nghiêm trọng cho người ni Kháng sinh, chất kích thích miễn dịch vaccine công cụ ứng dụng để kiểm sốt bệnh Tuy nhiên, so với vaccine, hai cơng cụ kháng sinh chất kích thích miễn dịch cịn thể nhiều hạn chế Sử dụng kháng sinh để lại dư lượng cá, môi trường tạo tác động tiềm ẩn gây nguy hại cho mơi trường người, từ dẫn đến sản phẩm dùng kháng sinh gặp phải e ngại người tiêu dùng, gây khó khăn tiêu thụ Sử dụng chất kích thích miễn dịch an tồn với người, với môi trường vật nuôi lại tạo bảo vệ thời gian ngắn Do đó, sử dụng vaccine phương pháp kiểm soát tối ưu nhà khoa học hướng đến để kiếm soát bệnh Trên giới, vaccine phòng bệnh Streptococcosis nghiên cứu từ năm 1980, thị trường xuất sản phẩm vaccine thương mại để phòng bệnh S iniae loài cá khác nhau, Việt Nam lĩnh vực vaccine Với mục tiêu phát triển nghề ni trồng thủy sản Việt Nam nói chung, nghề ni cá chẽm nói riêng hướng tới bền vững, thận thiện với mơi trường GVHD: Th.s.Trần Vĩ Hích SVTH: Võ Thị Mỹ Dung Đồ án tốt nghiệp Đại học Trang Chuyên ngành BHTS an toàn với người, nỗ lực nghiên cứu để hiểu tác nhân gây bệnh, từ sản xuất đưa vaccine phòng bệnh Streptococcosis cá chẽm vào ứng dụng thực Được cho phép khoa Nuôi trồng thủy sản, trường Đại học Nha Trang định hướng, giúp đỡ thầy Trần Vĩ Hích, tơi thực đề tài tốt nghiệp với tiêu đề: “Nghiên cứu đường xâm nhiễm vi khuẩn Streptococcus iniae vào cá chẽm (Lates calcarifer) đánh giá khả phòng bệnh Streptococcus iniae gây cách ngâm cá vaccine” Nội dung thực hiện: Nghiên cứu đường xâm nhiễm vi khuẩn Streptococcus iniae vào cá chẽm Đánh giá khả phòng bệnh Streptococcus iniae gây cách ngâm cá vaccine Mục tiêu đề tài: Xác định đường xâm nhập, phát triển S iniae vào cá chẽm Lates calcarifer hiệu vaccine dẫn truyền phương pháp ngâm phòng trị bệnh S iniae gây đối tượng này, từ làm sở khoa học cho nghiên cứu tiến tới hồn thiện quy trình sản xuất sử dụng vaccine phòng bệnh Streptococcosis cá chẽm Việt Nam Vì thời gian thực đề tài có hạn, kiến thức hạn chế bước đầu làm quen với phương pháp nghiên cứu khoa học nên đồ án khó tránh khỏi sai xót Kính mong thầy bạn đọc đóng góp ý kiến để đồ án hồn thiện GVHD: Th.s.Trần Vĩ Hích SVTH: Võ Thị Mỹ Dung Trang Đồ án tốt nghiệp Đại học Chuyên ngành BHTS PHẦN 1: TỔNG QUAN 1.1 Một số đặc điểm sinh học cá chẽm Cá Chẽm có hệ thống phân loại sau: Ngành: Chordata Lớp: Actinopterygii Bộ: Perciformes Họ: Centropomidae Giống: Lates Hình 1.1 Cá chẽm Lates calcarifer Loài: Lates calcarifer (Bloch, 1790) Tên tiếng Việt: Cá chẽm, cá vược Tên tiếng Anh: Sea bass, Barramundi, Giant seaperch [9] Cá chẽm có thân hình thon dài dẹp bên, cuống đuôi khuyết sâu Chiều dài thân 2,7 – 3,6 lần chiều cao Đầu nhọn, nhìn bên cho thấy phía lõm xuống lồi lưng Miệng rộng so le, hàm kéo dài đến phía sau hốc mắt Răng dạng nhung, khơng có nanh, nắp mang có gai cứng, vây lưng gồm có vi: vi trước có 7-9 gai cứng vi sau có 10-11 tia mềm Vi hậu mơn có gai cứng, vi trịn có hình quạt Vẩy dạng lược có kích cỡ vừa phải, có 61 vẩy đường bên Khi cá cịn khoẻ, mặt lưng có màu nâu, mặt bên bụng có màu bạc sống môi trường nước biển, màu nâu vàng sống môi trường nước Khi cá giai đoạn trưởng thành có màu xanh lục hay vàng nhạt lưng màu vàng bạc mặt bụng Cá chẽm phân bố rộng vùng nhiệt đới cận nhiệt đới thuộc tây Thái Bình Dương Ấn Độ Dương, từ Đông Phi đến Papua New Guinea, từ nam Trung Quốc, Đài Loan đến Bắc Úc Tại Việt Nam, cá chẽm tìm thấy vịnh Bắc bộ, GVHD: Th.s.Trần Vĩ Hích SVTH: Võ Thị Mỹ Dung Đồ án tốt nghiệp Đại học Trang Chuyên ngành BHTS vùng biển Trung Nam Bộ Về khả thích ứng với yếu tố sinh thái, cá chẽm lồi có khả thích ứng rộng với thay đổi độ mặn, cá giai đoạn giống trưởng thành sống độ mặn từ – 35 ppt chịu đựng tốt với thay đổi độ mặn đột ngột Thực tế cho thấy cá giống cỡ – cm hóa từ độ mặn 30 – 32 ppt xuống – 10 ppt – (Kungvankij et al 1984; Tucker, 2000) [1] Vì vậy, lồi thích hợp cho phát triển ni nước ngọt, nước lợ nuôi biển (Kungvankij et al 1984; Schipp, 1996) [1] Cá chẽm thích ứng với nhiệt độ từ 21 – 39oC, thích hợp 27 – 30oC Nhiệt độ thay đổi đột ngột – 3oC gây sốc cho cá giống (Tucker, 2000) [ 1] Độ pH thích hợp cho cá từ 7,0 – 8,5; DO -9 ppm; NH3-N < 0,025 ppm, H2S < 0,3 ppm (Kungvankij et al 1984) [9] Cá chẽm loài cá dữ, ăn mồi sống có khả ăn thịt đồng loại, đặc biệt tỉ lệ chết ăn cao giai đoạn từ – 10 cm Ngoài tự nhiên, thức ăn cá chẽm gồm cá nhỏ, tôm, cua, mực… Cá chẽm lồi có kích thước lớn, khối lượng tối đa đạt 60 kg Cá tăng trưởng chậm giai đoạn đầu, đạt 20 – 30 g tốc độ tăng trưởng nhanh chậm lại đạt khoảng kg Cá bột nở có chiều dài 1,49 mm, sau 40 ngày đạt cỡ 17,4 mm, 50 ngày đạt 28,9 mm, 90 ngày đạt chiều dài 93 mm, khối lượng g (Kungvankij et al 1984) [1] Trong điều kiện nuôi, cá giống cỡ – 2,5 cm sau thời gian ương từ 30 – 45 ngày đạt cỡ – 11 cm, sau từ đến 24 tháng nuôi thương phẩm cá đạt 0,35 – kg (Schipp, 1996) [1] Cá chẽm nuôi Úc dễ dàng đạt > 0,6 kg sau 12 tháng ni Tại vùng có nhiệt độ cao, cá đạt 0,8 kg sau 12 tháng, kg sau 18 – 24 tháng (Tucker et al 2002) [1] 1.2 Tình hình nghiên cứu bệnh Streptococcosis cá 1.2.1 Bệnh Streptococcosis Streptococcosis bệnh thường gặp người, động vật cạn động vật thủy sản Ở cá, Streptococcosis xem phức hợp bệnh giống GVHD: Th.s.Trần Vĩ Hích SVTH: Võ Thị Mỹ Dung Trang 32 Đồ án tốt nghiệp Đại học Chuyên ngành BHTS thể xảy với cá chết dẫn truyền vaccine, ảnh hưởng đến tốc độ sinh trưởng ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm thu hoạch Tuy nhiên, nghiên cứu này, tác nhân gây bệnh gây hại cho môi trường, cho cá nuôi vaccine từ vi khuẩn bất hoạt; ảnh hưởng vaccine tới sản phẩm thông báo xảy với phương pháp tiêm xoang bụng vaccine có bổ sung chất bổ trợ, tỷ lệ chết dẫn truyền ảnh hưởng vaccine tới tốc độ sinh trưởng hai thông số chọn để đánh giá tính an tồn vaccine thí nghiệm Kết cho thấy tỷ lệ sống sau dẫn truyền vaccine ngày đạt 100% tất nghiệm thức, sau 25 ngày, tỷ lệ sống nghiệm thức ngâm vaccine Strep1, vaccine Strep2, vaccine Strep Si đạt 97% ± 1.00, 96.5% ± 0.50, 96% ± 1.00; nghiệm thức đối chứng đạt 96% ± 2.00 Sự chênh lệch tỷ lệ sống nghiệm thức sai khác có ý nghĩa (p > 0,05) Bảng 3.2:Tốc độ sinh trưởng đặc trưng theo chiều dài cá chẽm nghiệm thức khác Chỉ tiêu Ngày Nghiệm thức sau Vaccine Vaccine Vaccine dùng Strep1 Strep2 Strep Si 2.98±0.07 2.53±0.12 2.76±0.04 2.54±0.37 SGRL 11 2.03± 1.40 2.46±0.96 1.74±0.27 2.23±0.29 (%/ngày) 16 1.87± 0.76 2.48±0.69 2.57±0.35 1.7± 0.95 21 0.73±0.19 0.84±0.44 0.73±0.47 1.66±0.59 25 1.21±0.83 1.00±0.39 1.00±0.24 1.46±0.07 Đối chứng vaccin Các giá trị bảng giá trị trung bình ± sai số chuẩn (SE) Tốc độ sinh trưởng đặc trưng theo chiều dài (SGRL) thể bảng 3.2 Dựa vào bảng thấy khơng có khác biệt tốc độ tăng trưởng đặc trưng nhóm cá nghiệm thức sau đợt kiểm tra sau tồn thời gian thí nghiệm Như vậy, vaccine bất hoạt formallin hai chủng Strep1, Strep2, GVHD: Th.s.Trần Vĩ Hích SVTH: Võ Thị Mỹ Dung Trang 33 Đồ án tốt nghiệp Đại học Chuyên ngành BHTS vaccine thương mại Strep Si phương pháp dẫn truyền vaccine ngâm loại vaccine không ảnh hưởng đến sinh trưởng cá Khi xét hai thông số tỷ lệ chết dẫn truyền ảnh hưởng vaccine lên tốc độ sinh trưởng, vaccine xem an toàn tỷ lệ chết dẫn truyền < 0.2% phải không ảnh hưởng đến tốc độ sinh trưởng cá Với kết thu từ thí nghiệm, tỷ lệ chết dẫn truyền 0%, tốc độ sinh trưởng nghiệm thức kết luận vaccine Strep1 bất hoạt formalin, vaccine Strep2 bất hoạt formallin, vaccine Strep Si vaccine an toàn 3.5 Kết cảm nhiễm cá sau dẫn truyền vaccine tỷ lệ sinh tồn tương đối RPS (%) 45% Tỷ lệ chết tích lũy (%) 40% 35% 30% Strep1 25% Strep Si 20% Strep2 15% DC 10% 5% 0% 10 Ngày sau cảm nhiễm Hình 3.8 Tỷ lệ chết tích lũy (%) cá chẽm nghiệm thức khác thí nghiệm xác định hiệu bảo vệ vaccine Tỷ lệ chết tích lũy nghiệm thức thể hình 3.8 Cá bắt đầu chết sau 24h cảm nhiễm thí nghiệm kết thúc 10 ngày Nghiệm thức ngâm vaccine Strep1 bất hoạt formalline thể tỷ lệ chết thấp 21.25%, nghiệm thức ngâm vaccine Strep Si có tỷ lệ chết 25.63%, tiếp đến nghiệm thức ngâm vaccine chủng Strep2 với 33.75%, nghiệm thức đối chứng có tỷ lệ chết tích lũy cao 39.38% Tương ứng, tỷ lệ sinh tồn RPS (%) cao nghiệm thức ngâm GVHD: Th.s.Trần Vĩ Hích SVTH: Võ Thị Mỹ Dung Trang 34 Đồ án tốt nghiệp Đại học Chuyên ngành BHTS vaccine Strep1 46.03%, tiếp đến nghiệm thức ngâm vaccine Strep Si 34.92% nghiệm thức ngâm vaccine Strep2 14.29% (bảng 3.3) Bảng 3.3 Tỷ lệ chết trung bình tỷ lệ sinh tồn tương đối (RPS) nghiệm thức Nghiệm thức Trung bình tỷ lệ chết (%) RPS (%) Strep 21.25 ± 2.96 46.03 Strep 33.75 ± 3.10 14.29 Strep Si 25.63 ± 2.31 34.92 ĐC 39.38 ± 2.06 - S iniea tác nhân nguy hiểm cho cá chẽm, việc nghiên cứu phát triển vaccine phòng bệnh tác nhân gây cần thiết cho phát triển nghề nuôi cá chẽm Theo kết thu từ thí nghiệm, có hiệu bảo vệ nghiệm thức sử dụng vaccine, hiệu cịn thấp có khác tùy theo vaccine Sự khác hiệu bảo vệ vaccine thể loài vi khuẩn S iniea hiệu thu lại khác nghiệm thức Vaccine bất hoạt chủng Strep1 vaccine Strep Si cho hiệu bảo vệ tương RPS đạt 46.03% 34.92 %, vaccine Strep2 cho hiệu bảo vệ thấp RPS đạt 14.29% Nguyên nhân khác khác biệt đặc điểm kháng nguyên chủng vi khuẩn để tạo vaccine Hiệu bảo vệ cao đạt từ vaccine Strep1 kháng thể cá tạo đặc hiệu với kháng nguyên Với vaccine bất hoạt formaline Strep2, thể cá sản xuất lượng kháng thể định sau ngâm vaccine chủng Strep2 có đặc điểm kháng nguyên bề mặt khác với chủng Strep1 nên kháng thể sinh không đặc hiệu để ngăn chặn xâm nhập công chủng Strep1 dẫn đến RPS (%) không cao Đối với vaccine Strep Si, vaccine thương mại, chủng vi khuẩn dùng sản xuất vaccine chủng có tính kháng ngun mạnh ổn định Hiệu bảo vệ thấp vaccine Strep1 cao vùng kháng nguyên vi khuẩn dùng để sản xuất vaccine GVHD: Th.s.Trần Vĩ Hích SVTH: Võ Thị Mỹ Dung Đồ án tốt nghiệp Đại học Trang 35 Chuyên ngành BHTS tương đồng với chủng Strep1 Sự khác đặc điểm kháng nguyên S iniea Bachrach et al (2001) giải thích cho nguyên nhân thất bại việc sử dụng vaccine phòng bệnh Streptococcosis cá hồi Irasel năm 1997, vaccine sử dụng thành cơng trước Hiện nay, khác đặc điểm kháng nguyên S iniea trở ngại cho thành công cho vaccine phòng bệnh tác nhân gây ra, việc sản xuất vaccine kết hợp hai đặc điểm kháng nguyên chủng S iniea hướng nghiên cứu Hiệu thấp vaccine thí nghiệm thấp phương pháp dẫn truyền Trong ni trồng thủy sản, dẫn truyền phương pháp tiêm ngâm hai phương pháp sử dụng phổ biến, nhiên so với phương pháp tiêm hiệu bảo vệ dẫn truyền phương pháp ngâm hạn chế Akhlaghi et al (1996) thử nghiệm dẫn truyền vaccine phòng bệnh L garvieae phương pháp ngâm tiêm, kết RPS phương pháp ngâm thấp nhiều so RPS phương pháp tiêm, 11.1% 88.8% Evans et al (2004) thử nghiệm vaccine phịng Streptococcus agalactiae cá rơ phi chứng minh hiệu phương pháp ngâm vaccine thấp hai lần so với phương pháp tiêm Suanyuk & Itsaro (2011) thử nghiệm vaccine phòng bệnh S iniae cá rô phi, hiệu bảo vệ phương pháp ngâm RPS 41.46% phương pháp tiêm RPS đạt 80.49% Trong thí nghiệm này, hiệu bảo vệ đạt cao 46.03% Điều giải thích dẫn truyền phương pháp ngâm, lượng kháng nguyên xâm nhập vào thể cá khơng đủ để kích thích đáp ứng miễn dịch đặc hiệu hay lượng kháng nguyên xâm nhập không đồng cá thể cá phương pháp tiêm Nusbaum and Morrison (1996) cho thất bại việc sử dụng vaccine Edwardsiella ictaluri bất hoạt kháng nguyên không vào thể cá nên không gây đáp ứng miễn dịch [24] Mặc khác, dẫn truyền phương pháp ngâm, kháng nguyên xâm nhập qua mang, da, quan đường bên…, quan có diện nhiều tế bào lympho, đại thực bào tương bào cư trú, dẫn đến đáp ứng miễn dịch cục tạo lượng kháng thể lớn quan tạo kháng thể bảo vệ toàn thể, điều khác với phương pháp tiêm Delamare- GVHD: Th.s.Trần Vĩ Hích SVTH: Võ Thị Mỹ Dung Đồ án tốt nghiệp Đại học Trang 36 Chuyên ngành BHTS Deboutteville (2006) nghiên cứu đáp ứng chức kháng thể huyết màng nhầy cá chẽm nuôi chủng ngừa vaccine Streptococcus iniae bất hoạt phương pháp tiêm hay ngâm cho thấy với phương pháp dẫn truyền khác có khác đáp ứng miễn dịch Đối với phương pháp ngâm, 21 ngày sau dẫn truyền vaccin, nồng độ kháng thể huyết thấp trong dịch nhầy lại cao Ở phương pháp tiêm, đáp ứng kháng thể cao tìm thấy huyết dịch nhầy Mặc dù, có hạn chế hiệu bảo vệ, với ưu phương pháp dẫn truyền đơn giản, rẽ tiền, giảm thiểu stress lên cá, kích thích đáp ứng miễn dịch thơng qua đường xâm nhập tự nhiên tác nhân gây bệnh áp dụng để dẫn truyền vaccine đồng thời với số lượng cá lớn mơ hình ni quy mơ lớn, phương pháp ngâm xem phương pháp dẫn truyền ưa thích tương lai Bên cạnh phương pháp dẫn truyền, loài cá, tác nhân gây bệnh loại vaccine nhân tố ảnh hưởng đến hiệu vaccine Vaccine bất hoạt vaccine truyền thống nuôi trồng thủy sản hiệu bảo vệ vaccine thấp, chí khơng có hiệu so với vaccine cơng nghệ cao khác Thune et al (1997) thử nghiệm gây miễn dịch cho cá da trơn Ictalurus punctatus vaccine bất hoạt hiệu bảo vệ, nhiên thử nghiệm vaccine nhược độc lại cho hiệu bảo vệ cao với RPS lên đến 77.5% (Shoemaker Klesius, 1999) [24] Buchanan et al 2005 dùng vaccine nhược độc S iniae cá hybrid striped bass cho hiệu bảo vệ lên đến 100% Tuy nhiên, tính an tồn vaccine đơn giản công nghệ sản xuất nên vaccine bất hoạt lựa chọn sản xuất vaccine cho cá Để tăng hiệu bảo vệ vaccine bất hoạt, nghiên cứu bổ sung chất bổ trợ vào vaccine tiến hành thu kết định Cá hồi tiêm vaccine L garvieae bất hoạt có khơng có bổ sung dầu khoáng, cho thấy hiệu bảo vệ cao nghiệm thức cá tiêm vaccine có bổ sung dầu khống với RPS đạt 82,3%, nghiệm thức cịn lại RPS đạt 62.7% (Ghitino, 1999) Suanyuk & Itsaro (2011) cho thấy thấy hiệu bảo vệ nhóm cá rơ phi tiêm vaccine bất hoạt GVHD: Th.s.Trần Vĩ Hích SVTH: Võ Thị Mỹ Dung Đồ án tốt nghiệp Đại học Trang 37 Chuyên ngành BHTS S iniae bổ sung β- (1,3/1,6) glucan hẳn nhóm cá tiêm vaccine bất hoạt, với RPS hai nhóm 95.12% 80.49% Vaccine dùng thí nghiệm này, hiệu bảo vệ (RPS) không cao đạt 34.92% vaccine Strep Si 46.03% vaccine chủng Strep1 vaccine thô thành phần vi khuẩn bất hoạt không kết hợp với chất bổ trợ Vì vậy, với kết thu xem vaccine thử nghiệm bước đầu đem thành công hiệu bảo vệ tạo hướng để phát triển thành cơng vaccine chống lại bệnh GVHD: Th.s.Trần Vĩ Hích SVTH: Võ Thị Mỹ Dung Đồ án tốt nghiệp Đại học Trang 38 Chuyên ngành BHTS CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 4.1 Kết luận Vi khuẩn Streptococcus iniae phân lập cá chẽm bệnh khu vực Khánh Hòa tác nhân gây bệnh nguy hiểm cá chẽm, gây chết lên đến 77.5% cảm nhiễm nồng độ 108 CFU/mL phương pháp ngâm Thí nghiệm xác định độc lực phương pháp ngâm cá chẽm giống cho thấy LD50 (%) 10 ngày 106.8 CFU/mL Cá chẽm sau cảm nhiễm với vi khuẩn cho tỷ lệ chết chủ yếu khoảng 24–48h, cá chết cấp tính biểu dấu hiệu bệnh lý Mang vị trí xâm nhập S iniae cảm nhiễm phương pháp ngâm Sau xâm nhập vào mang, vi khuẩn phát triển nhanh xâm nhập vào quan nội quan trọng thể: xuất lách thận sau 6h hầu hết quan nội quan sau 24h Vaccine bất hoạt formalin chủng Strep1 vaccine an tồn có khả bảo vệ cá chẽm giống chống lại bệnh S iniae gây với tỷ lệ sinh tồn RPS đạt 46.03% Vaccine thương mại Strep Si vaccine an toàn với cá hiệu bảo vệ không cao dẫn truyền phương pháp ngâm 4.2 Đề xuất ý kiến Nghiên cứu sâu đường xâm nhiễm S iniae vào cá chẽm thực cảm nhiễm phương pháp cho ăn phương pháp ngâm nồng độ vi khuẩn khác Phát triển vaccine bất hoạt có bổ sung sản phẩm bổ trợ tiến hành thử nghiệm hiệu phương pháp ngâm để tìm bảo vệ tốt Bên cạnh thí nghiệm xác định số RPS (%), cần tiến hành thí nghiệm xác định đáp ứng miễn dịch đặc hiệu không đặc hiệu cá sau dẫn truyền vaccine phương pháp ngâm để xác định hiệu khoảng thời gian bảo vệ GVHD: Th.s.Trần Vĩ Hích SVTH: Võ Thị Mỹ Dung Trang 39 Đồ án tốt nghiệp Đại học Chuyên ngành BHTS TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Lục Minh Diệp, 2011 Nghiên cứu xây dựng qui trình cơng nghệ ni thâm canh cá chẽm Lates calcarifer (Bloch, 1790) thức ăn công nghiệp Hợp phần hỗ trợ phát triển nuôi trồng thủy sản bền vững (suda), quan chủ trì: Trường Đại học Nha Trang Đỗ Thị Hòa, Bùi Quang Tề, Nguyễn Hữu Dũng, Nguyễn Thị Muội, 2004 Đại cương bệnh thủy sản Nhà xuất nông nghiệp Trang 125 -166 Nguyễn Xuân Nguyên, 2011 Tìm hiểu số đáp ứng miễn dịch đặc hiệu cá chẽm (Lates calcarifer) sau tiêm chủng vi khuẩn Streptococcus iniae bất hoạt formallin Đồ án tốt nghiệp Đại học, trường Đại học Nha Trang Phạm Văn Thư Sử dụng vaccine nuôi trồng thủy sản Viện nghiên cứu nuôi trồng thủy sản Tài liệu tiếng Anh Agnew, W and Bartnes, A.C., 2007 Streptococcus iniae: an aquatic pathogen of global veterinary significance and a challenging candidate for reliable vaccination Veterinary Microbiology 122: 1-15 Akhlaghi, M., Munday, B.L and Whittington, R.J., 1996 Comparison of passive and active immunization of fish against streptococcosi (enterococcosis ) Journal of Fish Diseases 19: 251-258 Bachrach, G., Zlotkin, A., Hurvitz, A., Evans, D.L and Eldar, A., 2001 Recovery of Streptococcus iniae from diseased fish previously vaccinated with a streptococcus vaccine Applied Environmental Microbiology 67: 3756-3758 Bercovier, H., Ghittino, C and Eldar, A., 1997 Immunization with bacterial antigens:infections with streptococci and related organisms In: Fish GVHD: Th.s.Trần Vĩ Hích SVTH: Võ Thị Mỹ Dung Đồ án tốt nghiệp Đại học Trang 40 Chuyên ngành BHTS Vaccinology, R Gudding, A Lillehaug, P.J Midtlyng and F Brown (eds.) S Karger, Basel Buchanan, J.T., Stannard, J.A., Lauth, X., Ostland, V.E., Powell, H.C., Westerman, M E and Nizet, V., 2005 Streptococcus iniae phosphoglucomutase is a virulence factor and a target for vaccine development Infection Immunulogy 73: 6935-6944 10 Bromage, E S., Thomas, A and Owens, L., 1999 Streptococcus iniae, a bacterial infection in barramundi Lates calcarifer Diseases of Aquatic Organisms 36: 177-181 11 Bromage, E.S., Owens, L., 2002 Infection of barramundi Lates calcarifer with Streptococcus iniae: effects of different routes of exposure Diseases of aquatic organisms 52: 199–205 12 Cheong, L., 1989 Status of knowledge on farming of Seabass (Lates calcarifer) in South East Asia Advances In Tropical Aquaculture 421-428 13 Delamare-Deboutteville, J., D Wood and A.C Barnes., 2006 Response and function of cutaneous mucosal and serum antibodies in barramundi (Lates calcarifer) acclimated in seawater and freshwater Fish and Shellfish Immunology 21: 92-101 14 Eldar, A., Horovitcz, A and Bercovier, H., 1997 Development and efficacy of a vaccine against Streptococcus iniae infection in farmed rainbow trout Veterinary Immunology and Immunopathology 56: 175-183 15 Evans, J J., Shoemaker, C A and Klesius, P H., 2004 Efficacy of Streptococcus agalactiae (group B) vaccine in tilapia (Oreochromis niloticus) by intraperitonal and bath immersion administration Vaccine 22: 3769-3773 16 Ferguson, W., Morales, J A., Ostland, V E., 1994 Streptococcosis in aquarium fish Diseases Of Aquatic Organisms 19: 1-6 GVHD: Th.s.Trần Vĩ Hích SVTH: Võ Thị Mỹ Dung Đồ án tốt nghiệp Đại học Trang 41 Chuyên ngành BHTS 17 Hich, T V., Duzng, N H., 2011 Experimental Streptococcus iniae infection in barramundi (Lates calcarifer ) Book of abstracts symposium on diseases in Asian Aquaculture (96) 18 Ling, S H M., Wang, X H., Lim T M., Leung K Y., 2001 Green fluorescent protein-tagged Edwardsiella tarda reveals portal of entry in fish FEMS Microbiology Letters 194: 239-243 19 Nguyen Thinh Huu, 2000 Study on the infection mechanism of Streptococcus iniae in Japanese flounder ( Paralichthys olivaceus) Thesis for degree of doctor of philosophy in Marine Science Nagasaki University, Japan 20 Pier, G.B and S.H Madin., 1976 Streptococcus iniae sp nov., a beta hemolytic streptococcus isolated from an Amazon freshwater dolphin, Inia geoffrensis International Journal of Systematic Bacteriology 26: 545-553 21 Sandlund, N., Torkildsen, L., Magnesen T., Mortensen, S., Bergh, O 2006 Immunohistochemistry of great scallop Pecten maximus larvae experimentally challenged with pathogenic bacteria Diseases Of Aquatic Organisms 69: 163–173 22 Shoemaker, C A., P H Klesius and J A Plumb 1997 Killing of Edwardsiella ictaluri by macrophages from channel catfish immune and susceptible to enteric septicemia of catfish Veterinary Immunology and Immmunopathology 58:181–190 23 Shoemaker, C.A., Vanderberg, G.W., Désormeaux, A., Klesius P.H and Evans, J.J 2006 Efficacy of a Streptococcus iniae modified bacterin delivered using Oralject technology in Nile tilapia (Oreochromis niloticus) Aquaculture 255: 151-156 24 Shoemaker, C A and Klesius, P H 2009 Use of modified live Vaccines in Aquaculture Journal of the world aquaculture society 40 GVHD: Th.s.Trần Vĩ Hích SVTH: Võ Thị Mỹ Dung Đồ án tốt nghiệp Đại học Trang 42 Chuyên ngành BHTS 25 Suanyuk, N., Sukkasame, N., Tanmark, N., Yoshida, T., Itami, T., Thune, R L., Tantikitti, C and Supamattaya, K 2010 Streptococcus iniae infection in cultured Asian sea bass (Lates calcarifer) and red tilapia (Oreochromis sp.) in southern Thailand Songklanakarin Journal of Science and Technology 32, 341-348 26 Suanyuk, N., Itsaro, A 2011 Efficacy of inactivated Streptococcus iniae vaccine and protective effect of β-(1,3/1,6)–glucan on the effectiveness of vaccine in red tilapia Oreochromis niloticus x O Mossambicus Songklanakarin Journal of Science and Technology.Songklanakarin J Sci Technol 33, 143-149 27 Romalde, J L., Magariños, B., Ravelo, C and Toranzo, A E., 2009 Vaccination strategies to prevent streptococcal infections in cultured fish Fish defenses, 2: 111-137 28 http://aqua.merck-animal-health.com GVHD: Th.s.Trần Vĩ Hích SVTH: Võ Thị Mỹ Dung Chuyên ngành BHTS Đồ án tốt nghiệp Đại học PHỤ LỤC Sinh trưởng chiều dài thân (SL) cá chẽm thí nghiệm đánh giá hiệu vaccine (theo dõi 21 ngày sau ngâm vaccine) Chỉ tiêu SL (cm) Ngày sau dùng vaccin Nghiệm thức Vaccine Vaccine Vaccine Strep1 Strep2 Đối chứng Strepci 2,03±0,0021 2,09±0,064 2,08±0,042 2,10±0,057 2,42±0,007 2,36±0,0008 2,41±0,0050 2,30±0,0072 11 2,68± 0,029 2,67±0,0242 2,63±0,0162 2,57±0,0018 16 2,94±0,001 3,02±0,0008 2,99±0,0050 2,80±0,0200 21 3,05±0,005 3,15±0,0162 3,10±0,0008 3,04±0,0080 25 3,24±0,013 3,31±0,0018 3,26±0,0072 3,27±0,0002 GVHD: Th.s.Trần Vĩ Hích SVTH: Võ Thị Mỹ Dung Chuyên ngành BHTS Đồ án tốt nghiệp Đại học PHỤ LỤC So sánh tốc độ tăng trưởng đặc trưng nhóm cá sau ngâm vaccine Descriptives SGRL (6 ngày sau ngâm vaccine) 95% Confidence Interval for Mean N Mean Std Deviation Std Error Lower Bound Upper Bound Minimum Maximum Dc 10 2,5400 ,52326 ,37000 -2,1613 7,2413 2,17 2,91 Strep1 10 2,9750 ,09192 ,06500 2,1491 3,8009 2,91 3,04 Strep2 10 2,5300 ,16971 ,12000 1,0053 4,0547 2,41 2,65 Strep Si 10 2,7550 ,04950 ,03500 2,3103 3,1997 2,72 2,79 Total 40 2,7000 ,28780 ,10175 2,4594 2,9406 2,17 3,04 a Duncan Strep2 10 2,5300 Dc 10 2,5400 Strep Si 10 2,7550 Strep1 10 2,9750 Sig ,193 Descriptives SGRL (11 ngày sau ngâm vaccine) 95% Confidence Interval for Mean N Mean Std Deviation Std Error Lower Bound Upper Bound Minimum Maximum Dc 10 2,2250 ,40305 Strep1 10 2,0250 1,97283 Strep2 10 2,4550 1,40714 ,99500 Strep Si 10 1,7400 ,38184 Total 40 2,1112 ,98075 GVHD: Th.s.Trần Vĩ Hích ,28500 1,39500 -1,3963 5,8463 1,94 2,51 -15,7002 19,7502 ,63 -10,1877 15,0977 1,46 3,45 ,27000 -1,6907 5,1707 1,47 2,01 ,34675 1,2913 2,9312 ,63 3,42 3,45 SVTH: Võ Thị Mỹ Dung Chuyên ngành BHTS Đồ án tốt nghiệp Đại học Subset for alpha = 0.05 nghiemth a Duncan N Strep Si 10 1,7400 Strep1 10 2,0250 Dc 10 2,2250 Strep2 10 2,4550 Sig ,597 Descriptives SGRL (16 ngày sau ngâm vaccine) 95% Confidence Interval for Mean N Mean Std Deviation Std Error Lower Bound Upper Bound Minimum Maximum Dc 10 1,7000 1,34350 ,95000 -10,3709 13,7709 ,75 2,65 Strep1 10 1,8700 1,07480 ,76000 -7,7867 11,5267 1,11 2,63 Strep2 10 2,4800 ,97581 ,69000 -6,2873 11,2473 1,79 3,17 Strep Si 10 2,5700 ,49497 ,35000 -1,8772 7,0172 2,22 2,92 Total 40 2,1550 ,86929 ,30734 1,4283 2,8817 ,75 3,17 Subset for alpha = 0.05 nghiemth a Duncan N Dc 10 1,7000 Strep1 10 1,8700 Strep2 10 2,4800 Strep Si 10 2,5700 Sig ,444 Descriptives SGRL (21 ngày sau ngâm vaccine) 95% Confidence Interval for Mean N Mean Dc 10 Strep1 10 ,7300 Std Deviation Std Error Lower Bound Upper Bound Minimum Maximum 1,6550 ,82731 ,26870 GVHD: Th.s.Trần Vĩ Hích ,58500 -5,7781 9,0881 ,19000 -1,6842 3,1442 ,54 1,07 2,24 ,92 SVTH: Võ Thị Mỹ Dung Chuyên ngành BHTS Đồ án tốt nghiệp Đại học Strep2 10 ,8350 ,61518 ,43500 -4,6922 6,3622 ,40 1,27 Strep Si 10 ,7250 ,65761 ,46500 -5,1834 6,6334 ,26 1,19 Total 40 ,9863 ,62969 ,22263 1,5127 ,26 2,24 ,4598 Subset for alpha = 0.05 nghiemth a Duncan N Strep Si 10 ,7250 Strep1 10 ,7300 Strep2 10 ,8350 Dc 10 Sig 1,6550 ,217 Descriptives SGRL (25 ngày sau ngâm vaccine) 95% Confidence Interval for Mean N Mean Std Deviation Std Error Lower Bound Upper Bound Minimum Maximum Dc 10 1,4600 ,09899 Strep1 10 1,2050 Strep2 10 1,0000 ,55154 Strep Si 10 Total 40 ,07000 ,5706 1,16673 ,82500 2,3494 1,39 1,53 -9,2776 11,6876 ,38 2,03 ,39000 -3,9554 5,9554 ,61 1,39 1,0000 ,33941 ,24000 -2,0495 4,0495 ,76 1,24 1,1662 ,54466 ,19257 1,6216 ,38 2,03 ,7109 Subset for alpha = 0.05 nghiemth a Duncan N Strep2 10 1,0000 Strep Si 10 1,0000 Strep1 10 1,2050 Dc 10 1,4600 Sig ,531 GVHD: Th.s.Trần Vĩ Hích SVTH: Võ Thị Mỹ Dung ... ? ?Nghiên cứu đường xâm nhiễm vi khuẩn Streptococcus iniae vào cá chẽm (Lates calcarifer) đánh giá khả phòng bệnh Streptococcus iniae gây cách ngâm cá vaccine? ?? Nội dung thực hiện: Nghiên cứu đường. .. đường xâm nhiễm vi khuẩn Streptococcus iniae vào cá chẽm Đánh giá khả phòng bệnh Streptococcus iniae gây cách ngâm cá vaccine Mục tiêu đề tài: Xác định đường xâm nhập, phát triển S iniae vào cá chẽm. .. đề tài nghiên cứu tạo vaccine phòng bệnh đốm trắng cá tra Vi? ??n nghiên cứu ni trồng Thủy sản II Ngồi ra, số cơng ty nước ngồi nghiên cứu sản xuất thử nghiệm vaccine phòng bệnh cho cá tra, cá điêu