nghiên cứu tạo củ in vitro và đánh giá khả năng sinh trưởng, năng suất của giống khoai sọ th3 và giống khoai môn th1 được nhân bằng phương pháp in vitro

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC ---  --- KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU TẠO CỦ IN VITRO VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG SINH TRƯỞNG, NĂNG SUẤT CỦA GIỐNG KHOAI SỌ TH3 VÀ GIỐNG

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

-   -

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU TẠO CỦ IN VITRO VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG SINH

TRƯỞNG, NĂNG SUẤT CỦA GIỐNG KHOAI SỌ TH3 VÀ GIỐNG

KHOAI MÔN TH1 ĐƯỢC NHÂN BẰNG PHƯƠNG PHÁP IN VITRO

Giảng viên hướng dẫn : GS.TS NGUYỄN QUANG THẠCH

: ThS NGUYỄN THỊ HƯƠNG

Sinh viên thực hiện : NGUYỄN THỊ TRANG

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành luận văn này, ngoài sự cố gắng nỗ lực của bản thân

em đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ của các thầy cô giáo, gia đình, người thân và bạn bè

Trước hết em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới NGND.GS.TS Nguyễn Quang Thạch và ThS Nguyễn Thị Hương, những người đã có nhiều công sức tận tình hướng dẫn, theo dõi sát sao, chỉ bảo và đóng góp những ý kiến quý báu cho em hoàn thành bài luận văn

Em xin gửi lời biết ơn tới ban giám hiệu Nhà trường, Ban Chủ nhiệm Khoa Công nghệ sinh học Viện Đại học Mở Hà Nội, cùng toàn thể các thầy cô giáo, các cán bộ công nhân viên Viện Sinh học Nông nghiệp, Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội đã nhiệt tình giúp đỡ, tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em trong thời gian học tập và thực hiện luận văn

Nhân dịp này, cũng cho phép em được bày tỏ lòng biết ơn tới những người thân trong gia đình, bạn bè đã luôn cổ vũ, động viên và giúp đỡ em trong suốt thời gian học tập và thực hiện luận văn

Hà Nội, ngày 6 tháng 5 năm 2011 Sinh viên

Nguyễn Thị Trang

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC BẢNG v

DANH MỤC HÌNH vi

DANH MỤC BIỂU ĐỒ vii

MỞ ĐẦU 1

PHẦN I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Giới thiệu chung về cây khoai môn sọ 3

1.1.1 Nguồn gốc, xuất xứ và phân bố 3

1.1.2 Giá trị kinh tế 3

1.2 Đặc tính thực vật học và các thời kì sinh trưởng của cây khoai môn sọ 5

1.2.1 Đặc tính thực vật học 5

1.2.2 Phân loại thực vật khoai môn sọ 6

1.2.3 Các giai đoạn sinh trưởng và phát triển 7

1.3 Yêu cầu ngoại cảnh và dinh dưỡng của cây khoai môn sọ 8

1.3.1 Nhiệt độ 8

1.3.2 Nước 8

1.3.3 Ánh sáng 9

1.3.4 Đất đai 9

1.3.5 Chất dinh dưỡng 9

1.4 Tình hình nghiên cứu nuôi cấy invitro cây khoai môn - sọ trên thế giới và Việt Nam 9

1.4.1 Tình hình nghiên cứu nuôi cấy invitro cây khoai môn – sọ trên thế giới 9

1.4.2 Tình hình nghiên cứu nuôi cấy in vitro cây khoai môn – sọ ở Việt Nam 17

PHẦN II VẬT LIỆU, ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19

2.1 Vật liệu, địa điểm và đối tượng nghiên cứu 19

2.1.1 Vật liệu nghiên cứu 19

2.1.2 Đối tượng nghiên cứu 19

2.1.3 Địa điểm và điều kiện thí nghiệm 19

2.2 Nội dung và phương pháp nghiên cứu 20

2.2.1 Nội dung 20

2.2.2 Phương pháp nghiên cứu 23

2.3 Phương pháp xử lý số liệu 23

2.4 Các chỉ tiêu theo dõi 23

PHẦN III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 24

3.1 Các thí nghiệm tạo củ in vitro 24

3.1.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ đường đến khả năng tạo củ khoai môn sọ in vitro 24

3.1.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của quang chu kì khác nhau đến khả năng tạo củ khoai môn sọ in vitro 27

3.1.3 Ảnh hưởng của chất kìm hãm sinh trưởng đến sự hình thành củ khoai môn sọ 30

3.1.4 Ảnh hưởng của tuổi cây đến sự hình thành củ khoai môn sọ 34

3.2 Đánh giá khả năng sinh trưởng phát triển của cây khi đưa ra trồng in vitro 36

3.2.1 Ảnh hưởng của mật độ trồng đến sinh trưởng phát triển của khoai môn sọ 36

3.2.2 Ảnh hưởng của các công thức bón phân đến sinh trưởng phát triển khoai môn sọ 40

3.2.3 Ảnh hưởng của phương pháp ngắt chồi đến việc tạo củ môn sọ in vivo 43

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 46

I Kết luận 46

II Đề nghị 47

TÀI LIỆU THAM KHẢO 48

theo dõi tạo củ in vivo 37

Bảng 11: Ảnh hưởng của chế độ bón phân đến sinh trưởng phát triển

khoai môn sọ 40 Bảng 12: Ảnh hưởng của công thức bón phân đến số củ môn sọ sau 8

tháng theo dõi tạo củ in vivo 41

Bảng 13: Ảnh hưởng của phương pháp ngắt chồi đến số củ môn sọ in

vivo 43

DANH MỤC HÌNH

Hình 1: Phân loại cây khoai môn sọ 7 Hình 2: Ảnh hưởng của nồng độ đường đến khối lượng củ con trên giống

TH1 27 Hình 3: Ảnh hưởng của thời gian chiếu sáng đến khả năng tạo củ trên

giống TH3 29 Hình 4: Ảnh hưởng của thời gian chiếu sáng đến sự hình thành củ ở TH1 30 Hình 5: Ảnh hưởng của chất kìm hãm sinh trưởng đến sự hình thành tạo củ

trên giống TH1 33 Hình 6: Ảnh hưởng của chất kim hãm sinh trưởng đến sự hình thành củ trên

giống TH3 33 Hình 8: Ảnh hưởng của tuổi cây đến sự hình thành củ trên giống TH1 35 Hình 9: Ảnh hưởng của mật độ trồng đến sự sinh trưởng và phát triển của

giống TH1 39 Hình 10: Ảnh hưởng của mật độ đến số củ khoai môn sọ 39 Hình 11: Ảnh hưởng của công thức bón phân đến sự sinh trưởng và phát

triển của giống TH1 42 Hình 12: Ảnh hưởng của công thức bón phân đến số củ khoai môn sọ 43 Hình 13: Ảnh hưởng của phương pháp ngắt chồi đến sự sinh trưởng và phát

triển của giống TH1 44 Hình14: Ảnh hưởng của phương pháp ngắt chồi đến số củ khoai môn sọ 45

DANH MỤC BIỂU ĐỒ

Biểu đồ 1: Ảnh hưởng của mật độ đến tốc độ tăng trưởng chiều cao cây

trên giống TH3 37 Biểu đồ 2: Ảnh hưởng của mật độ đến động thái tăng trưởng chiều cao cây

và ra lá của khoai môn – sọ 38 Biểu đố 3: Ảnh hưởng của công thức bón phân đến sinh trưởng phát triển

của khoai môn - sọ 41

MỞ ĐẦU

I Đặt vấn đề

Khoai môn sọ (Colocasia esculenta L Schott) là giống cây trồng lấy củ

quan trọng ở nhiều nước Châu Á và Thái Bình Dương Trên thế giới khoai môn

sọ xếp thứ 14 trong số các cây trồng với khoảng 12 triệu tấn được sản xuất trên toàn cầu từ khoảng 2 triệu ha với năng suất trung bình là 6,5 tấn/ha (FAOSTAR 2010)

Cây khoai môn - sọ là cây có giá trị dinh dưỡng khá cao Củ khoai môn sọ chứa hàm lượng hydratcacbon cao, hàm lượng chất béo thấp và chứa nhiều khoáng chất Lá và dọc lá chứa lượng lớn carotene và các khoáng chất như canxi, photpho, kali….Ở Việt Nam nghề trồng khoai môn sọ đã có từ lâu đời, khoai môn sọ đã là nguồn lương thực quan trọng đối với nhiều dân tộc Việt Nam trong suốt thời gian dài khi nền kinh tế chưa phát triển Ngày nay tuy khoai môn sọ không còn là nguồn thức ăn chính trong các bữa ăn hàng ngày nhưng chúng vẫn được ưa chuộng trong các món ăn truyền thống

Khoai môn sọ được trồng ở khắp nơi trên đất nước, phù hợp với nhiều loại địa hình và nhiều điều kiện môi trường khác nhau Cây khoai môn sọ có thể trồng ở vườn nhà hay trồng luân canh với cây lúa, đặc biệt

nó được phát triển trên vùng đất trống đồi trọc Tuy nhiên các giống địa phương đang dần biến mất một cách nhanh chóng trong khi các nghiên cứu di truyền, chọn giống, bảo tồn nguồn gen đối với loại cây trồng này ở nước ta còn ít

Trong thực tế sản suất việc nhân giống khoai môn – sọ vẫn chủ yếu sử dụng là ở các dạng củ Vì thế việc tạo ra số lượng lớn củ giống sẽ giúp việc mở rộng quy mô sản suất khoai môn - sọ dễ dàng hơn rất nhiều

Mặt khác việc nuôi cấy và giữ cây khoai môn - sọ in vitro cũng đã gặp

không ít những khó nhăn như: thời gian giữ giống thấp nên tốn công sức

cấy chuyển Khi số lần cấy chuyển tăng lên thường rất dễ xảy ra các biến dị soma ảnh hưởng không tốt cho việc bảo quản giống Ngoài ra kích thước

cây khoai môn – sọ in vitro khá lớn cũng đã gây ra những khó khăn nhất

định khi cấy chuyển chúng Việc bảo tồn và lưu giữ nguồn gen trong nuôi cấy

in vitro ngày càng được quan tâm Những năm vừa qua Viện Sinh học Nông nghiệp, Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội đã thu thập và hoàn thiện quy trình nhân giống in vitro của hơn 10 giống khoai môn sọ trong nước Tuy nhiên việc tạo củ in vitro còn cần được nghiên cứu để hoàn thiện quy trình nhân giống khoai môn sọ trong phòng thí nghiệm, đồng thời việc đánh giá các đặc tính nông sinh học ngoài đồng ruộng của các giống này vẫn còn bỏ ngỏ

Xuất phát từ những yêu cầu thực tế trên chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu tạo củ in vitro và đánh giá khả năng sinh trưởng, năng suất của giống khoai sọ TH3 và giống khoai môn TH1 được nhân bằng phương pháp in vitro”

II Mục đích, yêu cầu

1 Mục đích

- Xác định được phương pháp tạo củ in vitro của 1 số giống khoai môn sọ

bản địa thu thập được

- Đánh giá khả năng sinh trưởng, năng suất của 1 số giống khoai môn sọ

bản địa được nhân bằng phương pháp in vitro

2 Yêu cầu

- Xác định ảnh hưởng của ánh sáng tới việc tạo củ in vitro khoai môn sọ

- Xác định ảnh hưởng của nồng độ đường tới việc tạo củ

- Xác định ảnh hưởng của chất ức chế sinh trưởng tới việc tạo củ

- Xác định một số biện pháp kỹ thuật trồng cây in vitro trong nhà màn

PHẦN I TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu chung về cây khoai môn sọ

1.1.1 Nguồn gốc, xuất xứ và phân bố

Khoai môn sọ (Colocasia esculenta L Schott) được cho là một trong những cây lương thực của thế giới cổ đại nhất với một lịch sử hơn 2000 năm Điều này

có niên đại dựa trên hồ sơ sớm nhất bằng văn bản cho khoai môn (Matthews 2006) Gần đây nhiều tác giả đều thống nhất rằng rất nhiều dạng hoang dại và dạng trồng của cây khoai môn sọ có nguồn gốc tại các dải đất kéo dài từ Đông Nam Ấn Độ và Đông Nam Á tới Papua New Guuinea và Melanesia (Kuruvilla

và Singh, 1981; Matthew, 1995; Lebot, 1999)

Khoai môn sọ là một cây trồng quan trọng trong khu vực Thái Bình Dương ngày hôm nay và là một đặc điểm đặc trưng trong các cuộc tranh luận nhiều về lịch sử nông nghiệp ở Đông Nam Á và Thái Bình Dương Chúng được trồng phổ biến ở khắp các vùng nhiệt đới cũng như ôn đới ấm áp Trong nhiều nước, đặc biệt ở Châu Á - Thái Bình Dương, khoai môn sọ đã gắn bó chặt chẽ với nền trồng trọt và các truyền thống của con người Điều này chỉ ra rằng khoai môn -

sọ là cây trồng cổ, có lịch sử rất lâu đời

Ở nước ta khoai môn - sọ được thuần hoá sớm, đặc biệt là khoai môn nước được thuần hóa trước cả cây lúa (cách đây khoảng 10000 –15000 năm)

1.1.2 Giá trị kinh tế

Khoai môn củ là một nguồn tuyệt vời của chất bột, tinh bột đa số là trong

đó có 17 -28% là amylase, và phần còn lại là amylopectin (Oke, 1990) Kích thước của tinh bột khoai môn hạt là một phần mười của khoai tây và tiêu hóa của

nó đã được ước tính là 98,8% Bởi vì nó dễ dàng đồng hóa, nó phù hợp cho người có vấn đề tiêu hóa Nên khoai môn sọ đặc biệt hữu ích cho những người dị ứng với ngũ cốc và có thể được tiêu thụ bởi trẻ em người rất nhạy cảm với sữa,

và như bột khoai môn đó được sử dụng trong các công thức thức ăn cho trẻ sơ

sinh và các loại thực phẩm đóng hộp bé (Lee, 1999) Khoai môn củ ít chất béo

và protein, tuy nhiên, những protein trong củ khoai môn cao hơn so với khoai

mỡ, sắn và khoai lang Nó giàu protein và một số axit amin thiết yếu, nhưng ít tryptophan, isoleucine và methionine (Onwueme, 1978) Khoai môn lá có chứa hàm lượng protein cao hơn và cũng là nguồn tuyệt vời về carotene, kali, canxi, sắt, phốt pho, riboflavin, thiamine, niacin, vitamin A, vitamin C và chất xơ (Onwueme, 1978, Lambert, 1982; Hanson và Imamuddin, 1983; Bradbury và Holloway, 1988; Opara, 2001) Nó cũng có số lượng vitamin B lớn hơn so với sữa nguyên chất (Lee, 1999) Cây khoai môn tươi lá và cuống lá có chứa 80% và 94% độ ẩm

Bảng 1 Thành phần các chất trong củ khoai môn – sọ (khối lượng tươi)

Nguồn: FAO /Onwueme, 1994

Griffin (1982) đã nhấn mạnh tầm quan trọng kinh tế sử dụng khác của khoai môn sọ khi đã phát triển và sử dụng khoai môn sọ làm thức ăn động vật, là một nguyên liệu thô trong sản xuất mỹ phẩm và nhựa Khoai môn sọ đã phát triển với các nền văn hóa của người dân khu vực Châu Á Thái Bình Dương, do

vậy, nó đã có tầm quan trọng đáng kể văn hóa xã hội Nó có tính năng nổi bật trong văn hóa dân gian và truyền khẩu của nhiều người nền văn hóa tại Châu Đại Dương và Đông Nam Á

Khoai môn sọ được sử dụng làm lương thực và thực phẩm rộng khắp thế giới, từ Châu Á, Châu Phi, Tây Ấn Độ cho đến Nam Mỹ Ngoài việc góp phần vào an ninh lương thực bền vững tại thị trường trong nước, nó cũng mang lại thu nhập xuất khẩu (Revill et al, 2005)

1.2 Đặc tính thực vật học và các thời kì sinh trưởng của cây khoai môn sọ

1.2.1 Đặc tính thực vật học

• Rễ

Rễ chùm mọc từ đốt mầm xung quanh thân củ Rễ ngắn, hướng ăn ngang

và mọc thành từng lớp theo hướng đi lên thuận với sự phát triển của đốt, thân củ

Số lượng rễ và chiều dài rễ phụ thuộc vào từng giống và đất trồng Rễ phát triển thành nhiều tầng, phụ thuộc vào số lá của cây, mỗi lớp rễ trung bình có từ 25 –

30 rễ

• Thân củ

Khoai môn sọ đều có phần gốc phình to thành củ được gọi là than củ chứa tinh bột Củ cái chính được coi là cấu trúc than chính của cây, nằm trong đất Trên thân củ có nhiều đốt, mỗi đốt có mầm phát triển thành nhánh Sau khi dọc

lá lụi đi thì trên thân củ thêm một đốt và thân củ dài thêm ra Đỉnh của củ cái chính là điểm sinh trưởng của cây Sự mọc lên của cây đều bắt đầu từ đỉnh củ cái, toàn bộ phần dọc lá trên mặt đất tạo nên thân giả của cây môn sọ

• Lá

Lá là phần duy nhất nhìn thấy trên mặt đất, lá quyết định chiều cao của cây

Lá của cây môn sọ có diện tích tương đối lớn Mỗi một lá được cấu tạo bởi một cuống lá và một phiến lá

Cuống lá (dọc lá): mập có bẹ ôm chặt dưới gốc tạo nên thân giả Chiều dài của dọc lá biến động phụ thuộc vào kiểu gen từ 35cm – 160cm Màu dọc lá biến

đổi từ xanh nhạt tới tím đậm, đôi khi có sọc màu tím hoặc xanh đậm Dọc và lá không phải khi nào cũng cùng màu Gần lúc thu hoạch củ, dọc lá ngày càng ngắn lại và phiến lá cũng nhỏ đi

Phiến lá: có dạng hình khiên, gốc hình tim, có rốn ở giữa Phiến lá nhẵn chiều dài biến động từ 15cm – 50cm Kích thước lá chịu ảnh hưởng rất lớn của điều kiện ngoại cảnh và đạt kích cỡ lớn nhất ở giai đoạn sắp ra hoa Màu có thể biến động từ xanh nhạt đến đỏ thẫm tùy thuộc vào kiểu gen Trên phiến lá có 3 tia gân chính, 1 gân chạy thẳng từ điểm nối dọc lá với phiến lá tới đỉnh lá Hai gân còn lại chạy ngang về 2 đỉnh của thùy lá

• Hoa, quả và hạt

Hoa của cây môn sọ thuộc hoa đơn tính đồng chu, hoa đực và hoa cái cùng trên một trục Cụm hoa có dạng bong mo, mọc ra từ thân củ, ngắn hơn cuống lá Mỗi cây có thể có từ một cụm hoa trở lên Bao mo có hai phần, phần trên có màu vàng, phần dưới màu xanh, chiều dài khoảng 20cm ôm lấy trục hoa Trục hoa ngắn hơn mo, có 4 phần: phần hoa cái dưới cùng, tiếp đến là 1 phần không sinh sản, trên nữa là phần hoa đực, cuối cùng là phần phụ không sinh sản, hình nhọn Quả mọng có đường kính khoảng 3 – 5cm và chứa nhiều hạt

1.2.2 Phân loại thực vật khoai môn sọ

Khoai môn sọ được phân loại là Colocasia esculenta, nhưng các loài

được coi là đa hình (Purseglove, 1972) Có tám biến thể được công nhận trong Colocasia esculenta, trong đó có hai loại thường được trồng (O

“Sullivan và cộng sự, 1996.)

• Colocasia esculenta L.Schott var esculenta được mô tả là cây có một củ

cái chính to hình trụ và rất ít củ con thường được gọi là dạng dasheen Ở loài này

có hai nhóm là nhóm khoai nước (chịu ngập úng) và nhóm khoai môn (sử dụng củ cái và trồng trên đất cao) Hai nhóm này sử dụng củ cái để ăn, củ con để làm giống và dọc lá để chăn nuôi Hầu hết các giống thuộc loài phụ có bộ nhiễm sắc thể 2n=28 (Hình 1A), được gọi là loại "dasheen" của khoai môn

• Colocasia esculenta (L.) Schott var antiquorum được phân biệt là có một

củ cái nhỏ hình cầu với nhiều củ con mọc ra từ củ cái, thường được gọi là dạng eddoe Thuộc loài phụ này chủ yếu là nhóm cây khoai sọ Nhóm khoai sọ phân bố rộng có thể trồng trên ruộng lúa nước hoặc trên đất bằng phẳng có tưới nước Hầu hết các giống thuộc phần phụ này đều có bộ nhiễm sắc thể 2n = 48, thường được gọi là dạng tam bội

Hình 1: (A) C esculenta var esculenta (dasheen) có một củ cái trung tâm (B) C.esculenta var antiquorum (eddoe) có một củ cái nhỏ với nhiều củ con xung quanh

Ngoài ra còn có 1 nhóm mang đặc tính trung gian giữa 2 nhóm kể trên Chính vì vậy gọi nhóm cây khoai môn sọ là chính xác nhất

1.2.3 Các giai đoạn sinh trưởng và phát triển

1.2.3.1 Giai đoạn ra rễ mọc mầm

Sự hình thành rễ xảy ra ngay sau khi trồng, tiếp theo là sự phát triển nhanh chóng của chồi (mầm) củ Khi chồi mầm ra khỏi mặt đất thì

rễ đã dài từ 3 – 5cm Sự phát triển của rễ tương ứng với sự phát triển của

lá, cứ 1 lá lại sinh ra 1 lớp rễ Từ khi chồi mầm nhú lên khỏi mặt đất đến khi phát triển lá thứ nhất mất khoảng 15 – 20 ngày, sau đó 10 – 12 ngày xòe 1 lá Từ lúc nhú đến lúc nở hoa hoàn toàn mất 4 – 5 ngày Tuổi thọ của lá khoảng 32 – 37 ngày Khi ra lá thứ tư, thứ năm thì lá thứ nhất bắt đầu héo, sau đó cứ 2 – 3 lá thì có một lá héo

1.2.3.2 Giai đoạn sinh trưởng thân lá

Đặc trưng bởi sự phát triển thân lá và hình thành củ cái Khi tốc độ ra lá nhanh, cũng là lúc diện tích lá tăng nhanh nhất Sự hình thành củ cái thường bắt đầu xảy ra sau khi trồng được 3 tháng Sự hình thành củ con được xảy ra sau đó

1 thời gian ngắn Trong giai đoạn này cây cũng bắt đầu đẻ nhánh phụ Sự phát triển của chồi và lá sẽ chỉ giảm mạnh vào khoảng sau trồng 5 – 6 tháng cùng với

đó lá mọc ra chậm lại, chiều dài của dọc cũng giảm, giảm tổng diện tích lá trên cây và giảm cả về chiều cao cây trung bình trên đồng ruộng Hiện tượng này thường được gọi là khoai xuống dọc

1.2.3.3 Giai đoạn phình to của thân củ

Thời gian đầu củ cái và củ con phát triển chậm lại nhưng khoảng tháng thứ 4 – 6 khi sự phát triển của chồi giảm, củ cái và củ con phát triển rất nhanh Cuối vụ thường là đầu mùa khô sự lụi đi của bộ rễ và các chồi ngày càng tăng nhanh cho đến khi chồi chính chết Lúc này thu hoạch củ là thích hợp nhất

1.3 Yêu cầu ngoại cảnh và dinh dƣỡng của cây khoai môn sọ

1.3.2 Nước

Cây môn sọ có bề mặt thoát hơi nước lớn nên yêu cầu về độ ẩm cao để phát triển Cây cần lượng mưa hoặc nước tưới khoảng 1500 – 2000 mm để cho năng suất tối ưu Cây phát triển tốt nhất trong điều kiện đất ẩm ướt hoặc điều kiện ngập Trong điều kiện khô hạn cây giảm năng suất củ rõ rệt Củ phát triển trong điều kiện khô hạn thường có dạng quả tạ

1.3.3 Ánh sáng

Cây môn sọ đạt được năng suất cao nhất trong điều kiện cường độ ánh sáng cao, tuy nhiên nó là loại cây chịu được bóng râm hơn hầu hết các loại cây khác Đây là một đặc tính ưu việt khiến cây môn sọ là cây trồng xen kẽ với cây

ăn quả và các loại cây khác Ánh sáng mặt trời cũng ảnh hưởng đến sinh trưởng phát triển của cây môn sọ

1.3.4 Đất đai

Cây môn sọ là loại cây có thể thích ứng được với nhiều loại đất khác nhau

và được trồng nhiều ở loại đất tương đối chua, thành phần tương đối nhẹ và nhiều mùn Năng suất cao hay thấp phụ thuộc vào giống và phân bón nhiều hay

ít Tuy nhiên khoai môn nước cũng thích ứng tốt với loại đất nặng ngập nước hoặc đất phù sa, có độ ẩm Khoai sọ đồi được trồng nhiều ở xứ nhiệt đới Ở miền Bắc nước ta thường được trồng nhiều ở các tỉnh Lai Châu, Sơn La, Bắc Cạn, Lạng Sơn…

1.3.5 Chất dinh dưỡng

Cũng như các loại cây trồng lấy củ khác, khoai môn sọ yêu cầu đất tốt, đầy đủ NPK và các nguyên tố vi lượng để cho năng suất cao Những nơi đất quá cằn cỗi cần bón nhiều phân hữu cơ mới phù hợp để trồng khoai môn sọ Phân bón rất có ý nghĩa trong việc tăng năng suất củ và thân lá của cây khoai môn sọ

Cây môn sọ phát triển tốt nhất trên đất có pH khoảng 5,5 – 6,5 Một đặc tính quý của chúng là một số giống có tính chống chịu mặn cao Chính vì vậy ở Nhật và Ai Cập cây khoai môn sọ được sử dụng như cây trồng đầu tiên để khai hoang đất ngập mặn Điều này cho thấy tiềm năng sử dụng cây môn sọ để khai thác 1 số vùng sinh thái khó khăn, nơi những cây trồng khác không thể trồng được, hoặc kém phát triển

1.4 Tình hình nghiên cứu nuôi cấy invitro cây khoai môn - sọ trên thế giới

và Việt Nam

1.4.1 Tình hình nghiên cứu nuôi cấy invitro cây khoai môn – sọ trên thế giới

Để tiến hành nuôi cấy khoai môn - sọ, người ta thường sử dụng củ khoai môn - sọ để vào mẫu Củ khoai môn - sọ là bộ phận sử dụng chủ yếu, chúng nằm

trong đất nên thường dễ bị nấm bệnh tấn công Cũng chính vì vậy việc vào mẫu nuôi cấy cũng đã gặp không ít khó khăn Trước tình hình đó nhiều tác giả đã nghiên cứu về các chế độ khử trùng khác nhau S Seetohul và D Puchooa (2005) đã tiến hành các thí nghiệm vào mẫu với các chế độ khử trùng khác nhau Đầu tiên chồi, mắt ngủ được rửa sạch dưới vòi nước Tiếp đến được khử trùng bằng dung dịch benlate 0,06% trong 15 phút Sau đó các mẫu này được đưa vào khử trùng trong dung dịch NaClO với 4 nồng độ khác nhau: 1%; 1,5%; 2%; 2,5% cùng với 100 ml Tween 20 trong thời gian 15 phút Các mẫu này sau khi khử trùng được rửa lại 3 lần bằng nước cất vô trùng Kết quả cho thấy khử trùng mẫu tốt nhất là NaClO 2%, ở chế độ khử trùng này cho tỷ lệ mẫu sống, bật chồi cao nhất và tỷ lệ mẫu nhiễm thấp nhất

Sau khi khử trùng, các chồi, mắt ngủ được nuôi cấy trên môi trường MS

có bổ sung IAA với các nồng độ khác nhau là: 0 mg/l; 10 mg/l; 15 mg/l; 20 mg/l; 25 mg/l Các tác giả cũng đã đi đến kết luận rằng môi trường cho số lá và

rễ nhiều nhất là môi trường MS + 10 mg/l IAA

Theo nhóm tác giả: S.P Martin, C.A Bobisud và T.T Sekiota (2001), nghiên cứu nuôi cấy meristem cây khoai môn - sọ trên môi trường MS có bổ sung IAA và BA với các tỷ lệ khác nhau là: IAA: BA = 0: 0; 5: 5; 5: 10; 10: 5 và 10: 10 (µM) Tác giả tiến hành thí nghiệm trên 4 giống môn - sọ địa phương là Pikokea, Pololu, Nihopuu và Haokea Cả 4 giống đều phản ứng tốt nhất ở công thức IAA: BA = 10: 5 (µM) với hệ số nhân trung bình là 12,2 lần sau 3 tháng

Hệ số nhân giống của khoai môn - sọ là rất thấp, đây cũng là một trong những hạn chế rất lớn cho sự phát triển của chúng trong sản xuất Để có thể mở rộng sự phát triển khoai môn - sọ thì nhiều tác giả đã tiến hành nghiên cứu nhân

nhanh khoai môn - sọ in vitro trên nhiều công thức môi trường khác nhau

Shakuntala Sabapathy và Helen Nair (1992), khi nghiên cứu về nhân

nhanh khoai môn – sọ in vitro đã đưa ra kết luận: Nhân giống khoai môn - sọ in vitro có thể sử dụng cả chồi đỉnh và chồi nách Khi nuôi cấy trong môi trường

Linsmaier and Skoog (1965) chứa 5,5 mg/l NAA, 0,2 mg/l kinetin hoặc 1,85 mg/l NAA và 2 mg/l kinetin và bổ sung thêm 10-4

– 10-3 mol/l spermine hoặc tiền chất của axit amin arginine và ornithine Cây con được tái sinh trực tiếp từ chồi đỉnh, chồi nách và protocorm Tần số tái sinh cây con, tốc độ sinh trưởng phát triển của cây con từ chồi đỉnh cao hơn khi môi trường có arginine và ornithine Các cây con thứ cấp phát triển từ chồi nách và dạng protocorm được cảm ứng bởi spermine và arginine

Tuia và V S (1997) đã nghiên cứu hiệu quả từ việc vi nhân giống khoai môn - sọ bằng protocol trên môi trường MS với 30 g/l sucrose, 7,75 g/l agar và chất kích thích sinh trưởng TDZ và BAP Tiến hành nhân giống trong 3 nồng độ: 0,5 mg/l TDZ trong 4 tuần; 0,8 mg/l BAP trong 3 tuần; 0,005 mg/l TDZ trong 3 tuần Ban đầu tiến hành nuôi cấy trong môi trường MS lỏng trong 2 – 4 tuần, sau

đó cấy chuyển sang môi trường MS rắn

Tác giả H Chand và cộng sự (1999) đã tiến hành nhân nhanh in vitro khoai môn - sọ Colocasia esculenta trên môi trường MS có bổ sung chất điều

tiết sinh trưởng là BA và TDZ Mẫu cấy sử dụng trong thí nghiệm là đỉnh chồi

và mắt ngủ Sau khi khử trùng, mẫu cấy được cắt với kích thước 5 – 10 mm, sâu

5 mm đối với mắt ngủ và 15 – 30 mm đối với đỉnh chồi, cấy mẫu trên môi trường: MS + 30 g/l saccarose + 150 ml/l nước dừa Sau đó khảo sát sự nhân nhanh trên các môi trường:

MS + BA (0; 0,03; 0,13; 0,63; 1,13; 2 mg/l)

MS + TDZ (0; 0,03; 0,13; 0,63; 1,13; 2 mg/l)

Với cách bố trí thí nghiệm với 5 mẫu/CT, chồi xuất hiện sau 4 tuần vào mẫu

ở các nồng độ từ 0,13 – 1,13 mg/l Trong đó công thức thí nghiệm với BA hệ số nhân cao nhất ở nồng độ 1,13 mg/l Sau 12 tuần nuôi cấy hệ số nhân cao nhất thu được ở thí nghiệm với BA và TDZ đều là ở nồng độ 1,13 mg/l Sau khi tổng kết thí nghiệm tác giả đã tìm ra môi trường nhân nhanh thích hợp là:

MS + 1 mg/l BA với hệ số nhân là 4,5 lần

MS + 1 mg/l TDZ với hệ số nhân là 25 lần sau 20 tuần nuôi cấy

Theo tác giả thì khi nuôi cấy trên môi trường TDZ tuy hệ số nhân cao hơn trên môi trường BA nhưng chồi nhỏ và yếu hơn

Năm 2004, Arai đã khẳng định việc nhân nhanh khoai môn - sọ in vitro

có thể sử dụng môi trường không bổ sung chất điều tiết sinh trưởng Phương pháp nhân nhanh này được tiến hành trong môi trường khoáng MS không có vitamin hay sự điều chỉnh pH Cây con có thể được tạo ra từ chồi đỉnh hay từ một phần của củ Các mẫu cấy được làm sạch sau đó được đưa vào môi trường nuôi cấy Chồi được nuôi cấy trong môi trường MS lỏng bổ sung thêm 60 g/l sucrose, củ được nuôi cấy trong MS lỏng với 30 g/l sucrose Sau khoảng một tháng nuôi cấy trong môi trường lỏng không khuấy lắc, chồi phát triển thành cây con, chồi nách của củ phát triển thành cây con nhỏ hơn 3 lần so với cây từ chồi đỉnh Bằng phương pháp nhân giống này có thể nhanh chóng cung cấp cây để trồng ngoài nhà lưới hay trên đồng ruộng và cho năng suất rất cao Và hơn thế, cây con không xuất hiện các biến dị

Nhóm tác giả Du H M và cộng sự (2006) đã tiến hành thí nghiệm nhân nhanh trên nền môi trường MS có bổ xung chất điều tiết sinh trưởng là BA, TDZ

và α - NAA trong 30 ngày Kết quả tốt nhất thu được trên môi trường có bổ sung

1 mg/l TDZ Cây con sau đó được cấy chuyển sang môi trường MS lỏng trong

90 ngày Sau 30 ngày hệ số nhân đạt cao nhất là 2,5 lần tại công thức MS + 1 mg/l BA + 0,5 mg/l α NAA Sau 90 ngày nuôi cấy hệ số nhân cao nhất trên môi trường MS + 3 mg/l BA + 0,1 mg/l TDZ Chồi phát triển tốt và tạo rễ trong MS + 1 mg/l BA + 0,5 mg/l α NAA + 0,5 g/l than hoạt tính

Mẫu cấy được lấy từ củ của cây môn - sọ được trồng trong điều kiện tự nhiên 7 – 8 tháng Các mẫu này được đưa vào khử trùng bề mặt bằng cồn 70% Tiếp đó chúng được tách nhỏ tới kích thước 1cm2 rồi đưa vào khử trùng trong dung dịch HgCl2 0,5% có chứa vài giọt Tween 20 trong 8 phút và sau được rửa lại 4 – 5 lần bằng nước cất vô trùng Mẫu cấy được đưa vào nuôi cấy trên môi

trường MS có bổ sung BA với các nồng độ là 2; 4; 6; 8 mg/l và IAA với các nồng độ khác nhau là: 0,5; 1; 2; 3 mg/l (Chien-Ying Ko và cộng sự, 2007) Qua quá trình theo dõi các tác giả đã thấy rằng: các mẫu được cấy trong môi trường

MS + 5 mg/l BA + 2 mg/l IAA sau 1 tuần đã có mầu xanh trở lại và sau 4 tuần nuôi cấy cho hệ số nhân cao nhất Các chồi sau đó được chuyển sang môi trường

MS + 0,25 mg/l αNAA + 1,5 g/l than hoạt tính + 30 g/l saccarose để tạo rễ

Nghiên cứu ảnh hưởng của TDZ và BA đến hệ số nhân của chồi khoai môn - sọ H Chand và M N Pearson (1998) đã đưa ra kết luận: việc nuôi cấy khoai môn - sọ trong môi trường MS có bổ sung 2,6 µM TDZ (0,6 mg/l) cho hệ

số nhân của chồi cao hơn so với việc cấy chúng trong môi trường MS có bổ sung

BA Khi bổ sung vào môi trường 4,3 µM TDZ (1mg/l TDZ) sau 4 tuần nuôi cấy

co hệ số nhân đạt tới 15 – 20 lần, so với môi trường bổ sung BA là 4 lần

Hầu hết trong sản xuất khoai môn - sọ đều được trồng bằng củ Việc tạo

củ giống nhiều và sạch cũng sẽ mở ra hướng phát triển cho khoai môn - sọ

Năm 1999, Su P Zhou và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu tạo củ in vitro

cây khoai môn - sọ Ban đầu cây con được nuôi cấy trên môi trường MS lỏng có

bổ sung 8 – 10% saccarose và 22 – 44 µM BA, hầu hết các mẫu cấy đều hình thành củ Theo tác giả, nếu môi trường bổ sung 170 – 850 µM PP333 sẽ làm tăng

sự tạo củ Ngược lại, khi nồng độ PP333 quá cao (1700 µM) sẽ làm củ kém phát triển Nếu bổ sung 66 µM BA vào môi trường MS + 170 µM PP333 sẽ thu được

củ với kích thước nhỏ hơn Nuôi cấy lỏng lắc có thể cho củ có kích thước tới 2,03 g, khối lượng tươi trung bình là 0,7 g sau 40 ngày nuôi cấy Ở môi trường đặc củ tạo ra có thể đạt được 1,87 g với khối lượng tươi trung bình là 0,5 g Tỷ lệ sống của chồi sau khi đưa ra khỏi ống nghiệm và bảo quản ở nhiệt độ 4oC trong vòng 10 tháng là 99 – 100%

Năm 2005, Z Hussain và R K Tyagi nghiên cứu tạo củ, sự ổn định di

truyền của việc tái sinh khoai môn - sọ đã đi đến kết luận: Việc tạo củ in vitro

được hình thành khi nuôi cấy trong môi trường MS chứa 8 - 10% sucrose, 22

µM BAP, 0,6 µM α-NAA và 0,8% agar Nuôi cấy tạo củ có thể bảo quản được trong vòng 15 tháng ở 25±2oC, nuôi cấy dạng chồi chỉ có thể kéo dài được 6 tháng trong môi trường MS bổ sung 3% sucrose, 2,2 µM BAP, 0,6 µM NAA,

0,8% agar Cây con phát triển từ củ in vitro có tỷ lệ sống sót trên đồng ruộng là

100% và đồng đều

Nghiên cứu sự phát sinh cơ quan và tạo phôi vô tính ở khoai môn – sọ đã

có 4 công trình công bố (Yam et al, 1991; Thinh, 1997; Verma et al,2004; Deo, 2008) Tái sinh callus ở khoai môn - sọ, Yam và cộng sự (1990, 1991) đã khẳng định hiệu quả của nuôi cấy chồi nách, 1/2 dinh dưỡng đa lượng, 1/10 dinh dưỡng MS vi lượng, vitamin, 25 ml/l dịch chiết khoai môn - sọ (TE) và 2,4,5-trichlorophenoxyacetic acid (2,4,5-T) Môi trường đầy đủ dinh dưỡng không dẫn tới sự hình thành callus Năm 2009, Deo và cộng sự đã nghiên cứu sâu hơn về vấn đề trên và khẳng định: dịch chiết khoai môn - sọ là quan trọng

để hình thành callus Tuy nhiên, TE là thành phần không rõ trong môi trường nuôi cấy và nó không đồng nhất về thành phần và nồng độ của các chất ở mỗi

cá thể riêng lẻ Hơn nữa, chất hoạt động trong TE tác động cho sự hình thành callus là chưa xác định

Đã có 3 công trình nghiên cứu về việc tạo phôi vô tính khoai môn - sọ (Thinh, 1997; Verma et al, 2004; Deo et al, 2009) Verma và cộng sự (2004) đã

sử dụng môi trường MS để tạo protocol (khởi đầu trong môi trường bổ sung 2,2 mg/l 2,4-D và 0,44 mg/l TDZ, tiếp theo nuôi cấy với 1.1 mg/l TDZ) và từ đó tạo phôi vô tính từ chồi đỉnh, với 25 – 30 phôi vô tính từ mẫu cấy Thinh (1997) đã tạo phôi vô tính từ cuống lá tính từ ngọn xuống Chúng được nuôi cấy trong môi trường MS với 1,0 – 2,0 mg/l TDZ Cả 2 trường hợp trên đều có thể trực tiếp tạo phôi vô tính Thinh (1997) tiến hành trên khoai sọ, Verma và cộng sự quan sát thấy trên cả khoai môn và khoai sọ Hiệu quả từ protocol, gián tiếp hình thành phôi vô tính (qua việc tác động vào callus và sau đó nuôi cấy huyền phù phôi callus) bao gồm hiệu quả tái sinh protocol thành phôi vô tính ở khoai môn (Deo

et al, 2009) với hiệu quả có tốc độ khoảng 500 - 3000 phần ml tế bào và 80 –

100 g môi trường rắn tạo callus hình thành phôi với tỷ lệ khoảng 60%

Trong trường hợp protocol (Deo et al, 2009) tạo từ lát củ nuôi cấy in vitro

trên môi trường MS có 2,0 mg/l 2,4-D trong khoảng 20 ngày ở điều kiện tối, sau

đó cấy chuyển sang môi trường MS với 1,0 mg/l TDZ đặt ở trong tối Phôi callus hình thành sau 75 ngày và tiếp tục nuôi cấy đến 100 ngày Sử dụng môi trường

có 1 mg/l 2,4-D và 0,5 mg/l TDZ đã hình thành phôi callus nhưng tần số thấp hơn so với môi trường chứa 2 mg/l 2,4-D và 1 mg/l TDZ Nồng độ các chất trên

có thể khác nhau giữa các loại khoai môn - sọ Callus được hình thành trong môi trường MS có cả 2 loại hormone: 0,5 mg/l 2,4-D, 1 mg/l TDZ, 800 mg/l glutamine rồi chuyển tới môi trường nửa MS, nó phân hóa tạo phôi

Năm 2010, Deo Pradeep C và cộng sự đã nghiên cứu và đưa ra kết luận rằng: Việc tạo phôi vô tính từ callus được cảm ứng bằng cách nuôi cấy lát cắt mỏng của củ khoai môn - sọ trong môi trường MS rắn hoặc bán rắn có chứa 2 mg/l 2,4-D trong 20 ngày rồi chuyển sang môi trường chứa 1 mg/l TDZ Callus được cấy chuyển nhân lên trong môi trường rắn chứa 1 mg/l TDZ, 0,5 mg/l 2,4-

D và 800 mg/l glutamine trước khi được chuyển sang môi trường lỏng với thành phần như trên nhưng nồng độ của glutamine là 100 mg/l Sau 3 tháng nuôi cấy trong môi trường lỏng lắc, tập hợp các tế bào đậm đặc được hình thành Phôi vô tính được cảm ứng từ nuôi cấy huyền phù tế bào ở môi trường rắn bổ sung 0,1 mg/l TDZ, 0,05 mg/l 2,4-D, 40 - 50 g/l sucrose, 1 mg/l biotin Phôi thành thục và nảy mầm sau khi được nuôi trong môi trường chứa 0,05 mg/l BA, 0,1 mg/l IAA

Yamoto và cộng sự (1992) đã nghiên cứu tạo callus từ mô lá trên môi trường 1/2 MS+25 mg/l TE + 2 mg/l 2,4,5 - Trichlorophenoxyacetic acid và 200 mg/l glutamine Rễ được hình thành từ callus khi cấy chuyển sang môi trường 1/2 MS + 25 mg/l TE + 100 mg/l nước dừa

Năm 1992, Josue Jack F Malamug và cộng sự đã nghiên cứu sự tái sinh cây con từ callus và đi đến kết luận: Callus khoai môn - sọ được cảm ứng từ nuôi

cấy đỉnh chồi trong môi trường Nitsch bổ sung thêm 20 g/l sucrose, 1 mg/l

2,4-D, 1 mg/l BA Hiệu quả của agar với nồng độ 0; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8% trong môi trường MS để tái sinh chồi từ callus đã được xác định Sự phân hóa chồi chỉ quan sát thấy ở nồng độ 0,2; 0,4; 0,6% agar Sự phân hóa này đạt 64% ở nồng độ 0,6% agar Tuy nhiên, sự phân hóa rễ có thể thấy ở tất cả các nồng độ Sự phân hóa chồi nhanh hơn khi môi trường bổ sung 1 mg/l BA, chỉ sau 10 tuần nuôi cấy Khi bổ sung 0,1% than hoạt tính không trực tiếp cảm ứng tới sự phân hóa chồi, nhưng có thể kéo dài tuổi thọ của callus, sự chết hoại chỉ quan sát thấy sau 20 tuần nuôi cấy Sự tái sinh chồi tăng lên khi nuôi cấy trong môi trường bổ sung 1 mg/l NAA, 1 mg/l BA Trước khi cây con được chuyển ra ngoài đồng ruộng chúng được đưa vào môi trường khoáng để thích ứng trước

Khi nồng độ NH4NO3 từ 720 – 200 mg/l sẽ làm tăng tỷ lệ tạo callus Nồng

độ NH4NO3 ở mức thấp sẽ làm tăng chất lượng của callus Khi môi trường được

bổ sung 10% nước dừa sẽ tốt hơn cho cảm ứng tạo callus, có lợi cho sự nhân lên của callus nhưng đúng hơn là cho cảm ứng tạo rễ

Nhóm tác giả Murakami K và cộng sự (1998) đã nghiên cứu tái sinh chồi

từ callus và protoplast trên Colocasia esculenta Schott Tác giả đã tạo callus từ

cuống lá trên môi trường MS + 30 g/l saccarose + 1 mg/l 2,4-D và 2ip Số lượng callus tăng lên nhanh chóng khi cấy chuyển sang môi trường mới và sau đó được nuôi cấy trên môi trường lỏng Protoplast được tách riêng từ các tế bào nhỏ Chồi được tái sinh từ khối callus khi cấy chuyển chúng sang môi trường MS + 30 g/l saccarose + 0 - 2 mg/l α NAA + 2 mg/l BA hoặc 2ip Những chồi này hình thành

rễ khi được cấy sang môi trường MS cơ bản

Năm 2008, Deo và cộng sự đã đưa ra kết luận về việc nuôi cấy huyền phù

tế bào khoai môn – sọ: Nuôi cấy huyền phù tế bào bằng cách đặt miếng callus (0,5 g) trong môi trường MS lỏng chứa 1 mg/l TDZ, 0,5 mg/l 2,4-D và 100 mg/l glutamine trong điều kiện lắc 90 rpm Phôi được cảm ứng khi nuôi cấy huyền phù tế bào trong môi trường MS chứa 1 mg/l TDZ, 0,5 mg/l 2,4-D, 100 mg/l

glutamine và 50 g/l sucrose Sự chín và nảy mầm được tiến hành trên môi trường

MS với 0,1 mg/l IAA, 0,05 mg/l BAP

Theo dự án bảo tồn in vitro nguồn gen môn - sọ của FAO, nguồn gen khoai môn - sọ được bảo tồn in vitro trên môi trường cơ bản: MS + 1 mg/l BA + 0,2 mg/l α NAA (pH: 5,5 – 5,8) Ngoài ra việc bảo tồn in vitro khoai môn - sọ

còn được tiến hành trên các môi trường khác là:

MS + 0,005 mg/l TDZ

MS +0,025 mg/l TDZ

MS + 0,05 mg/l TDZ

MS + 0,8 mg/l BA

Trong nghiên cứu về vấn đề bảo tồn nguồn gen khoai môn - sọ của

Hiroko Takagi và cộng sự (2005) thì việc bảo tồn in vitro được tiến hành trên

môi trường có hàm lượng đường cao: MS + 120 g/l saccarose

1.4.2 Tình hình nghiên cứu nuôi cấy in vitro cây khoai môn – sọ ở Việt Nam

Trong những năm gần đây do nhận thấy giá trị của cây khoai môn - sọ mà

vấn đề nghiên cứu nuôi cấy khoai môn - sọ in vitro đang nhận được sự quan tâm

rất lớn Đã có một vài công trình nghiên cứu với các kết quả công bố về bước đầu trong nhân giống khoai môn - sọ bằng nuôi cấy mô tế bào: công trình nghiên

cứu của Phân Viện sinh học Đà Lạt (2003)…

Để phục tráng giống và làm sạch bệnh của các dòng, giống khoai môn - sọ

bị thoái hóa hoặc bị nhiễm bệnh, Nguyễn Thị Ngọc Huệ và Đinh Thế Lộc đã sử

dụng phương pháp nhân giống in vitro Các mô phân sinh từ chồi bên của củ cái

sau khi được khử trùng bằng thủy ngân (HgCl2) được đưa vào môi trường MS có

bổ sung 10 mg/l IAA Sau khi mô phân sinh tạo chồi, chúng được cấy chuyển sang môi trường MS bổ sung 1 mg/l Kinetin để tạo rễ Các cây này được đem trồng vào khay 1 tháng trước khi đem ra trồng trên đồng ruộng

Nghiên cứu ảnh hưởng của việc bổ sung các chất điều tiết sinh trưởng và hiệu quả khi kết hợp chúng với nhau, tại Phân Viện Sinh học Đà Lạt, Dương Tấn Nhựt và cộng sự (2003) đã tìm ra môi trường nhân nhanh thích hợp nhất là môi trường MS + 2 mg/l BA + 0,5 mg/l IAA + 3% sucrose Môi trường ra rễ thích hợp nhất là MS + 0.1 mg/l BA + 1% sucrose

Tạo vật liệu khởi đầu cho nuôi cấy in vitro luôn là vấn đề quan trọng cần

được nghiên cứu trước tiên Nguyễn Gia Tài (2009) đã nghiên cứu chế độ khử trùng khác nhau ảnh hưởng tới tỷ lệ sống sót và nhiễm bệnh của mẫu cấy ban đầu Các chồi ngủ được đưa vào khử trùng bằng HgCl2 trong 12 phút Sau đó chúng được đưa vào khử trùng trong dung dịch Jonshon với thời gian khác nhau:

10 phút, 20 phút, 30 phút, 40 phút Chế độ khử trùng hiệu quả nhất là chế độ khử trùng kép sử dụng HgCl2 0,1% trong 12 phút sau đó ngâm mẫu trong dung dịch Johnson trong 30 phút Với công thức này tỷ lệ mẫu sạch đạt trên 70% trên nhiều giống tiến hành thí nghiệm

Để mở rộng diện tích trồng khoai môn - sọ thì việc cung cấp đủ lượng

giống là điều cần thiết Do đó quá trình nhân giống khoai môn - sọ in vitro cần

có được môi trường nhân nhân nhanh tối ưu làm tăng hệ số nhân của khoai môn

- sọ Năm 2008, Nguyễn Thị Loan đã nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ TDZ đến hệ số nhân của khoai môn - sọ Mẫu được cấy trong môi trường MS có bổ sung TDZ với các nồng độ khác nhau: 0,5; 1; 1,5; 2 mg/l Tác giả đi đến kết luận: TDZ là chất điều tiết sinh trưởng cho hệ số nhân giống môn - sọ tốt nhất, với nồng độ TDZ là 1,5 mg/l, hệ số nhân môn - sọ có thể đạt 16.1 lần sau 10 tuần nuôi cấy đối với giống khoai sọ Hoà Bình, 18,6 lần đối với giống khoai môn tím

và 14,3 lần đối với giống khoai sọ vàng

PHẦN II VẬT LIỆU, ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG

VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu, địa điểm và đối tượng nghiên cứu

2.1.1 Vật liệu nghiên cứu

Chất kìm hãm sinh trưởng B9: là một dạng bột trắng hòa tan trong nước, nó được sử dụng để ức chế sinh trưởng, kìm hãm sinh tổng hợp GA3,

ức chế chồi, giảm chiều dài đốt, tăng sinh trưởng rễ đồng thời tăng độ dày lá

và hàm lượng diệp lục

2.1.2 Đối tượng nghiên cứu

Nghiên cứu trên 2 giống khoai môn – sọ sau:

2.1.3 Địa điểm và điều kiện thí nghiệm

Các thí nghiệm in vitro được tiến hành tại phòng Công nghệ Sinh học

thực vật Viện Sinh học Nông nghiệp, Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội

* Điều kiện nuôi cấy

Quá trình nuôi cấy in vitro tiến hành theo phương pháp nuôi cấy

mô tế bào hiện hành với phòng nuôi cấy có điều kiện:

- Nhiệt độ phòng 25oC

- Ánh sáng: 3000 – 3500 lux

- Thời gian chiếu sáng: 16 h/ngày

- Ẩm độ phòng: 70%

Các thí nghiệm in vivo được tiến hành tại khu nhà màn Viện Sinh học

Nông nghiệp, Trường ĐH NN Hà Nội

2.2 Nội dung và phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Nội dung

2.2.1.1 Các thí nghiệm tạo củ in vitro

Thí nghiệm 1 Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ đường đến khả năng tạo củ khoai môn sọ in vitro

Các cây khoai môn sọ đạt tiêu chuẩn về chiều cao và số lá được cấy chuyển sang môi trường MS Sau khoảng 14 ngày nuôi cấy khi cây đã ra rễ ta tiến hành bổ sung lượng đường với nồng độ khác nhau

Các công thức bổ sung lượng đường như sau:

C Sau 3 tháng tiến hành thu củ

Thí nghiệm 2 Nghiên cứu ảnh hưởng của quang chu kì khác nhau đến khả năng tạo củ khoai môn sọ in vitro

Những cây khoai môn sọ đủ tiêu chuẩn được nuôi cấy trên môi trường

MS Sau khoảng 14 ngày nuôi cấy trên môi trường trên tiến hành bổ sung dung dịch đường vô trùng với nồng độ 120 g/l vào các bình nuôi cấy với các điều kiện chiếu sáng khác nhau:

CT1: Trong tối hoàn toàn

CT2: 8h sáng/ ngày

CT3: 16h sáng/ ngày

Mỗi công thức thí nghiệm được tiến hành với 3 lần nhắc lại, mỗi lần 10 bình Sau 3 tháng tiến hành thu củ

Thí nghiệm 3 Nghiên cứu ảnh hưởng của chất kìm hãm sinh trưởng đến khả năng hình thành củ

Sử dụng môi trường MS+ 120g đường/l, thời gian chiếu sáng 16h/ngày, nhiệt độ 25oC Chất kìm hãm sinh trưởng là B9

CT1: Đối chứng (MS không bổ sung B9)

CT1: Cây có chiều cao 5cm, 4 lá

CT2: Cây có chiều cao 10cm, 6 lá

CT3: Cây có chiều cao 15cm, 7 lá

Sau đó ta tiến hành bổ sung vào môi trường MS + 120g đường/l + 2g/l B9, thời gian chiếu sáng 16h/ngày, nhiệt độ 25oC

Mỗi công thức thí nghiệm được tiến hành với 3 lần nhắc lại, mỗi lần 5 bình, mỗi bình 5 cây Sau 3 tháng tiến hành thu củ

2.2.1.2 Các thí nghiệm đánh giá khả năng sinh trưởng, phát triển, năng suất của cây khi đưa ra trồng in vivo

Cây môn sọ in vitro được cấy chuyển sang môi trường MS sau 14 ngày cây đạt tiêu chuẩn chiều cao 7-10cm, có 5-6 lá thì tiến hành ra cây và trồng trong bầu trên nền giá thể trấu hun+đất (1:1) Sau 20 ngày chuyển sang trồng trong nhà màn

và tiến hành các thí nghiệm tiếp theo