Nghiên cứu tạo củ in vitro cây bách hợp (Lilium brownii Brown)

Mục tiêu tổng quát Nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố và kỹ thuật đến sự hình thành củ in vitro cây bách hợp nhằm xây dựng quy trình nhân giống loài cây này với tỷ lệ sống cao ngoài

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

BÙI ĐỨC QUỲNH

Tên đề tài:

NGHIÊN CỨU TẠO CỦ IN VITRO CÂY BÁCH HỢP

(Lilium brownii Brown)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ Sinh học Khoa : CNSH & CNTP Khoá học : 2012- 2016

Thái Nguyên, năm 2016

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

BÙI ĐỨC QUỲNH

Tên đề tài:

NGHIÊN CỨU TẠO CỦ IN VITRO CÂY BÁCH HỢP

(Lilium brownii Brown)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo : Chính quy

Chuyên ngành : Công nghệ sinh học

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn chỉnh tốt chương trinh đào tạo trong nhà trường với phương châm học đi đôi với hành, mỗi sinh viên khi ra trường cần chuẩn bị cho mình lượng kiến thức cần thiết , chuyên môn vững vàng Thời gian thực tập tốt nghiệp là một phần quan trọng không thể thiếu được trong trương trình đào tạo sinh viên đại học nói chung và sinh viên Đại Học Nông Lâm nói riêng Đây là khoảng thời gian cần thiết

để mỗi sinh viên củng cố lại những kiến thức lý thuyết đã được học một cách có hệ thống và nâng cao khả năng vận dụng lý thuyết vào thực tiễn, xây dựng phong cách của một kỹ sư

Với lòng biết ơn vô hạn, tôi xin chân thành cảm ơn các thầy giáo và cô giáo, trong khoa CNSH – CNTP Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên đã truyền đạt cho tôi những kiến thức quý báu trong suốt quá trình học tập và rèn luyện tại trường

Đặc biệt tôi xin chân thành cảm ơn thầy giáo TS Nguyễn Văn Duy và cô giáo ThS Vũ Hoài Sâm đã tận tình chỉ bảo hướng dẫn tôi trong suốt quá trình thực tập và hoàn thiện khóa luận tốt nghiệp này

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám Đốc trung tâm Nghiên Cúu Trồng và Chế Biến Cây Thuốc Hà Nội, Viện Dược Liệu cùng toàn thể nhân viên của các Phòng / Bộ môn tại trung tâm đã tạo mọi điều kiện cho tôi trong quá trình thực tập

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Thái Nguyên, tháng 5 Năm 1016

Sinh Viên

Bùi Đức Quỳnh

DANH MỤC HÌNH

Trang

Hình 2.1 Hình ảnh cây Bách hợp (Lilium brownii Br.) 5

Hình 2.2 Một số thực phẩm được chế biến từ Bách hợp 7

Hình 2.3 Một số sản phẩm thuốc từ Bách hợp 7

Hình 4.1 Củ hình thành trên môi trường MS + 60g/l đường + 0,5 mg/l α-NAA 34

Hình 4.2 Nhân nhanh củ nhỏ từ các loại lát cắt khác nhau 37

Hình 4.3 Nhân nhanh bách hợp trên môi trường 40

Hình 4.4 Cây bách hợp trên môi trường tạo rễ 42

Hình 4.5 Cây bách hợp trên các giá thể khác nhau ở vườn ươm 44

DANH MỤC BẢNG

Trang

Bảng 4.1 Ảnh hưởng của thời gian xử lý HgCl2 0,1% đến hiệu quả khử trùng mẫu cấy 25

Bảng 4.2 Ảnh hưởng của BAP đến tái sinh in vitro 28

Bảng 4.3 Ảnh hưởng của NAA đến tái sinh in vitro 30

Bảng 4.4 Ảnh hưởng của Kinetin đến sự hình thành củ nhỏ 32

Bảng 4.5 Ảnh hưởng của NAA đến khả năng hình thành củ nhỏ in vitro 33

Bảng 4.6 Ảnh hưởng của đường đến khả năng hình thành củ in vitro cây bách hợp 35

Bảng 4.7 Ảnh hưởng của các loại lát cắt đến khả năng nhân nhanh củ in vitro 36

Bảng 4.8: Ảnh hưởng của NAA đến khả năng nhân nhanh củ nhỏ 38

Bảng 4.9 Ảnh hưởng của tổ hợp NAA và BAP đến nhân nhanh củ in vitro 39

Bảng 4.10 Ảnh hưởng của NAA và BAP đến sự tạo rễ in vitro 41

Bảng 4.11 Ảnh hưởng của giá thể đến tỷ lệ sống của cây bách hợp ở vườn ươm 43

Bảng 4.12 Ảnh hưởng của giá thể đến sinh trưởng cây ngoài vườn ươm 44

MỤC LỤC

Trang

PHẦN I: MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu của đề tài 2

1.2.1 Mục tiêu tổng quát 2

1.2.2 Mục tiêu cụ thể 2

PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Giới thiệu chung về chi Lilium và cây Bách hợp 3

2.1.1 Giới thiệu chung về chi Lilium 3

2.1.2 Giới thiệu c1hung về cây Bách hợp 4

2.2 Các phương pháp nhân giống chi Lilium và cây Bách hợp 8

2.2.1 Phương pháp nhân giống bằng hạt 8

2.2.2 Phương pháp nhân giống bằng vảy củ 9

2.2.3 Phương pháp nhân giống bằng nuôi cấy mô 11

PHẦN III: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

3.1 Đối tượng 18

3.2 Địa điểm nghiên cứu 18

3.3 Nội dung và phương pháp nghiên cứu 18

3.3.1 Nội dung nghiên cứu 18

3.3.2 Phương pháp nghiên cứu 19

PHẦN IV KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 25

4.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian khử trùng đến hiệu quả khử trùng mẫu 25

4.2 Kết quả nghiên tái sinh in vitro từ đốt thân và vẩy củ 27

4.2.1 Ảnh hưởng của BAP đến tái sinh in vitro từ đốt thân và vẩy củ 27

4.2.2 Ảnh hưởng của NAA đến tái sinh in vitro từ đốt thân và vẩy củ 29

4.3 Nghiên cứu hình thành củ nhỏ 32

4.3.1 Ảnh hưởng của Kinetin đến sự hình thành củ nhỏ 32

4.3.2 Ảnh hưởng của NAA đến sự hình thành củ nhỏ in vitro 33

4.3.3 Ảnh hưởng của nồng độ đường đến sự hình thành củ nhỏ 34

4.4 Nghiên cứu nhân nhanh củ nhỏ in vitro 36

4.4.1 Ảnh hưởng của loại lát cắt đến khả năng nhân nhanh củ in vitro 36

4.4.2 Ảnh hưởng của NAA đến khả năng nhân nhanh củ nhỏ 37

4.5 Nghiên cứu tạo cây hoàn chỉnh 40

4.6 Nghiên cứu đưa cây ra vườn ươm 42

4.6.1 Ảnh hưởng của giá thể đến tỷ lệ sống ngoài vườn ươm 43

4.6.2 Ảnh hưởng của giá thể đến sinh trưởng cây ngoài vườn ươm 44

PHẦN V KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 46

5.1 Kết luận 46

5.2 Đề nghị 46

TÀI LIỆU THAM KHẢO 47

PHẦN I

MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề

Bách hợp còn gọi là Tỏi rừng, Khẻo ma, Suôn phạ (Tày), Kíp pá (Thái), Cà

ngái dòi (Dao), có tên khoa học là Lilium brownii Brown var Viridulum Baker,

1885, tên đồng danh là Lilium brownii Brown var Colchesteri Wils.ex Stapf.,

1921., thuộc họ hành tỏi (Liliaceae) là cây thuốc phổ biến và quan trọng trong Đông

y (Nguyễn Tập, 2007) [7] Bách hợp có dạng cây cỏ, cao 0,5 – 1m, thân hành to màu trắng, dọc thân có nhiều vảy xếp chồng lên nhau Cây thường mọc hoang ở các trảng cỏ và bờ nương rẫy vùng núi cao Vẩy thân hành của cây thường được dùng làm thuốc giảm đau, chống ho, chống viêm hoặc như một nguồn dinh dưỡng Theo tài liệu cổ, Bách hợp có tác dụng bổ phổi, trừ ho, định tâm, an thần, thanh nhiệt, lợi tiểu, chữa ho lao thổ huyết, ho có đờm, viêm phế quản, hư phiền hồi hộp, tim đập mạnh, phù thũng (Đỗ Huy Bích, 2004) [2] Ở Trung Quốc, Bách hợp thường được dùng làm thuốc nhuận phế, chỉ khái, an thần bình tâm Ở Việt Nam, Bách hợp có mặt trong thành phần của nhiều loại thuốc trị ho đang có mặt trên thị trường như Bách hợp chỉ khái lộ, An khái hoa, Cốm ho Ma hạnh Vinet….Ngoài các tác dụng làm thuốc kế trên, Bách hợp còn là cây cho hoa đẹp để làm cảnh

Với những đặc tính như trên từ những năm 1980 cây đã bị khai thác quá mức

để lấy nguyên liệu làm thuốc và xuất khẩu tiểu ngạch qua biên giới Thêm vào đó nguồn Bách hợp tự nhiên còn bị thu hẹp do nạn phá rừng ngày càng gia tăng Mặc

dù cây có thể tái sinh tự nhiên bằng hạt, nhưng chỉ có những hạt khi phát tán, được tiếp xúc được với mặt đất ẩm hay hốc đá có mùn mới có cơ hội nẩy mầm (Đỗ Huy Bích, 2004) [2] Do vậy, nó liên tục được đưa vào danh lục đỏ Cây thuốc Việt Nam các năm 1996, 2001 và 2006 và trong Nghị định số 32/2006/NĐ-CP của chính phủ (30/3/2006) nhằm quản lý và bảo vệ Tuy nhiên, nghiên cứu nhân giống cây bách hợp cho đến nay chưa được quan tâm nhiều ở Việt Nam Nhằm bảo tồn nguồn gen

và nhân rộng giống cây thuốc đang bị đe dọa này chúng tôi đã tiến hành đề tài:

“Nghiên cứu tạo củ in vitro cây bách hợp (Lilium brownii Brown)”

1.2 Mục tiêu của đề tài

1.2.1 Mục tiêu tổng quát

Nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố và kỹ thuật đến sự hình thành củ in

vitro cây bách hợp nhằm xây dựng quy trình nhân giống loài cây này với tỷ lệ sống

cao ngoài vườn ươm

1.2.2 Mục tiêu cụ thể

- Xác định được điều kiện khử trùng thích hợp

- Xác định được môi trường tái sinh thích hợp

- Xác định được ảnh hưởng của môi trường, chất điều hòa sinh trưởng,

đường đến sự tạo củ in vitro

- Xác định được giá thể thích hợp để đưa cây in vitro ra vườn ươm

PHẦN II TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Giới thiệu chung về chi Lilium và cây Bách hợp

2.1.1 Giới thiệu chung về chi Lilium

Chi Lilium (họ Liliaceae) gồm khoảng 100 loài (Mcrae, 1998) [30], được biết

đến trước hết là những loài hoa loa kèn, huệ tây trồng làm cảnh Trong số đó có hai

nhóm quan trọng nhất là Lilium longilorum (Easter Loa kèn) và Lilium hybrids

(gồm Asiatic Loa kèn và Oriental Loa kèn) rất đa dạng về hình thái, màu sắc Hiện nay việc lai tạo giữa các nhóm Lilium để tạo ra các giống có bản sắc riêng, phù hợp với điều kiện sinh thái, khí hậu mỗi vùng và cải thiện được các đặc tính của các giống lai đang là xu hướng trong công tác lai tạo giống loa kèn

Chi Lilium phân bố chủ yếu ở vùng ôn đới ấm Bắc bán cầu Ở Châu Á có

khoảng hơn một chục loài tập trung chủ yếu ở vùng cận Himalaya (Đỗ Huy Bích, 2004) [2] Theo thống kê của Đặng Văn Đông và Đinh Thế Lộc (2008) [1] thì hiện nay Trung Quốc có khoảng 460 giống hoa thuộc chi Lilium, 280 biến chủng (chiếm 1/2 tổng số hoa loa kèn trên thế giới), Nhật Bản có 145 giống trong đó có 19 giống đặc trưng của Nhật, Hà Lan có 302 giống trong đó 80% giống là do chính Hà Lan tạo ra, Hàn Quốc có khoảng 110 giống trong đó có 30 giống đặc trưng của nước này Theo Phạm Hoàng Hộ (1999) [12] ở Việt Nam, ngoài 2 loài được trồng phổ

biến là L longiflorum Thunb và L lancifolium, hiện có 3 loài hoa loa kèn hoang dại thuộc chi Lilium được ghi nhận là Lilium brownii F.E Brown (bách hợp), Lilium

poilanei Gagne và Lilium arboricola Trong các loài mọc tự nhiên, đáng chú ý nhất

là cây bách hợp, đây loài cây vừa có hoa đẹp làm cảnh và vừa có tác dụng làm thuốc chữa bệnh Bách hợp còn gọi là Tỏi rừng, Khẻo ma, Suôn phạ (Tày), Kíp pá

(Thái), Cà ngái dòi (Dao), có tên khoa học là Lilium brownii Brown var viridulum Baker (năm 1885), tên đồng danh là Lilium brownii Brown var colchesteri Wils.ex

Stapf (năm 1921), là cây thuốc phổ biến và rất quan trọng trong Đông y

2.1.2 Giới thiệu c1hung về cây Bách hợp

Chi: Loa kèn (Lilium)

Loài: Bách hợp (Lilium brownii Br.)

2.1.2.2 Hình thái

Lilium brownii F.E Brown var colchesteri Wilson thuộc nhóm Leucolirion

là một trong bốn nhóm được phân loại dựa vào hình dạng hoa (Wilson, 1925) [38] hay nhóm Archelirion là một trong 7 nhóm được phân chia dựa vào nhiều các đặc điểm khác như phương thức nẩy mầm của hạt, cách sắp xếp của lá, các đặc điểm của hạt và vẩy củ, nơi sống và hình dạng củ… cũng như là hình dạng của hoa

(Comber, 1949) [22] Lilium brownii var colchesteri là cây thảo cao 0,5 - 1 m được

tìm thấy ở nhiều nơi phía Đông châu Á - miền Nam Trung Quốc từ Hồng Kông đến Mianma Thân hành (thường gọi nhầm là củ) mầu trắng đục, có khi màu hồng rất nhạt gồm nhiều vảy nhẵn, dễ gãy Thân trên mặt đất mọc thẳng đứng, không phân nhánh, cứng và nhẵn, màu xanh lục có khi điểm những đốm nhỏ Lá mọc so le, có

bẹ, hình mũi mác, gốc tròn, đầu thuôn nhọn, gân lá hình cung, hai mặt trơn nhẵn Cụm hoa mọc ở ngọn thân gồm 2-5 hoa to màu trắng, hơi vàng; lá bắc; bao hoa hình phễu hay loa kèn, khi nở cong ra ngoài; 6 nhị ngắn hơn các bộ phận của bao hoa, chỉ nhị hình dùi, bao phấn hình trái xoan hay thuôn Quả nang, dài 5-6 cm, có 3 ngăn chứa nhiều hạt nhỏ Mùa hoa: từ đầu mùa hè (tháng 5) đến cuối mùa hè (tháng 7) Mùa quả: tháng 8 - 10

Là cây bản địa của vùng trung tâm Trung Quốc ở độ cao 1500m so với mặt nước biển (McRae, 1998) [30] Củ của nó được dùng như một loại rau để ăn và để làm thuốc (Chen et al., 1980) [21] Lily có đặc trưng riêng về vẻ đẹp, sự độc đáo cũng như màu sắc, và hương thơm dịu mát, bao hoa thay đổi nhanh chóng từ kem vàng sang trắng ngay trong quá trình nở (Okubo, 2006) [33] Nó đã được đưa vào nước Anh từ năm 1835 và sau đó trải dài đến Bỉ và Hà Lan (Willson, 1925) [38]

Ở Việt Nam, Bách hợp chỉ thấy mọc tự nhiên ở một vài nơi thuộc vùng khí hậu á nhiệt đới núi cao từ 1300 đến 2000 mét, như Sa Pa, Bát Xát (Lào Cai), Mù cang Chải (Yên Bái); Sìn Hồ, Phong Thổ (Lai Châu), Quản Bạ, Đồng Văn (Hà Giang); núi Phia Bi Oóc và vùng đèo Gió (Cao Bằng) Bách hợp thuộc cây ưa sáng,

ưa khí hậu ẩm mát, nhiệt độ trung bình năm từ 15 - 18,50C Cây thường mọc trên các hốc mùn chân núi đá vôi hoặc lẫn trong các trảng cỏ, cây bụi thấp có địa hình dốc (đỉnh đèo Hoàng Liên Sơn)

Hình 2.1 Hình ảnh cây Bách hợp (Lilium brownii Br.)

2.1.2.3 Một số hợp chất sinh học có giá trị từ cây Bách hợp

Trong Lilium brownii F.E var colchesteri Wilson có 30% tinh bột, protit 4%,

chất béo 0,1%, Colchicein C21H23O6N1/2H2O và ít vitamin C Thành phần hoá học

của Lilium brownii đã được nghiên cứu năm 1998 bởi Hou đã cho thấy củ của nó có

5 loại hợp chất Dựa vào các phân tích quang phổ (IR, FAB-MS, 1HNMR, DEPT, HMQC, HMBC) và các đặc tính hóa lý, chúng được xác nhận là beta-sitosterol (I),

daucosterol (II), n-butyl-beta-D-fructopyranoside (III),

26-O-beta-D-glucopyranosyl-3 beta, 26-dihydroxy-5-cholesten-16, rhamnopyranosyl-(1 >2)-beta-D-glucopyranoside (IV), 26-O-beta-D-

glucopyranosyl-3beta, 26-dihydroxy cholestan-16, rhamnopyranosyl-(1 >2)-beta-D-glucopyranoside(V)

22-dioxo-3-O-alpha-L-Năm 2012, 2 chlorophenyl glycosides mới và hiếm từ củ cây này là trichlorol-3-methyl-5-methoxy-phenol 1-O-β-D-glucopyranosyl-(1 → 6)-β-D-glucopyranoside (1) and 4-chlorol-5-hydroxyl-3-methyl-phenol 1-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranoside (2) cũng đã được phân lập dựa trên các phương pháp hoá học và quang phổ

2,4,6-Lilin, một loại protein giàu glutamate và arginin có hoạt tính miễn dịch và antifulgal đã đượcWang H (2002) [37] trường Đại học Nông Nghiệp Trung Quốc

phân lập từ củ khô Lilium brownii Nó được xác định là chuỗi đơn, có trong lượng

tử là14,4 kDa, và có tác dụng ức chế sự hoạt động của enzym chuyển hóa HIV – 1

và hầu hết thường được bán dưới dạng khô Đặc biệt vào mùa hè, người ta thường

ăn chúng để giảm sự nóng bên trong cơ thể Người Trung Quốc còn dùng bột từ chồi hoa cây này thay cho bột hoa hiên Ở Nhật bản, nó cũng được dùng thường xuyên cho nhiều món ăn, đặc biệt nó là thành phần không thể thiếu trong món trứng chiên nổi tiếng của họ (món Chawanmushi)

Hình 2.2 Một số thực phẩm đƣợc chế biến từ Bách hợp

A: Món canh hoa bách hợp B: Món canh hến bách hợp

Ở Hồng Kông, củ của Lilium brownii được dùng làm thuốc chống ho, lợi tiểu,

thuốc đánh rắm, thuốc long đờm, thuốc hạ sốt, đau ngực, an thần và thuốc bổ Nước sắc được dùng trong điều trị bệnh ho và thiếu máu, hay lo âu, hồi hộp, phù nề và tiểu khó Các hành nhỏ từ nách lá được dùng trong điều trị bệnh rối loạn tiêu hóa Bột hoa hay hoa khô được dùng làm thuốc đắp vào chỗ bầm tím hoặc đứt tay… Ở Việt Nam, nó có mặt trong thành phần của nhiều loại sản phẩm trị ho đang bán trên thị trường dược như Bách hợp chỉ khái lộ, An khái hoa, Cốm ho Ma hạnh Vinet….Ngoài các tác dụng làm thuốc kế trên, Bách hợp còn là cây cho hoa đẹp để làm cảnh

Hình 2.3 Một số sản phẩm thuốc từ Bách hợp

A - Bách hợp dạng lát khô (dung để chưa ho viêm phế quản, mất ngủ, tang khr năng kháng HIV)

B - Bách hợp dạng củ tươi (Dùng hàng ngày: 15-30g củ khô sắc nước hoặc tán bột để sử dụng

Bên cạnh tác dụng nêu trên, mới đây „Smilax‟là một hỗn hợp các thảo dược Trung Quốc, gồm lúa mạch, hà thủ ô đỏ, nhãn, cảo bản, gừng và bách hợp này đã được nghiên cứu và cho rằng có tác dụng đáng kể trong điều trị bệnh béo phì ở người Nghiên cứu đã được thực hiện trên những người tình nguyện uống thử trong

6 tuần (Ignjatovic, 2000) [29] Ở Đài Loan, khi kết hợp 4 loại cây là thiên nam tinh, khủ khởi, câu đằng và bách hợp Lin RD (2003) [30], đã chứng minh rằng chúng có thể làm chậm quá trình thoái hóa bị gây nên bởi các bệnh về thần kinh

2.2 Các phương pháp nhân giống chi Lilium và cây Bách hợp

2.2.1 Phương pháp nhân giống bằng hạt

Hình thức nhân giống này có nhiều ưu điểm: dễ làm, hệ số nhân giống cao, tạo được nguồn cây con sạch bệnh, điều này rất quan trọng trong sản xuất hoa Lilium Takami, T & cs (2007) [36] đã tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện nhiệt độ và ánh sáng tới sự nảy mầm của Lilium x formolongi trên 4 giống hoa loa kèn là: „Fsub(1) Augusta‟, „Raizan No.1‟, „Raizan No.2‟ và „Raizan No.3‟ Kết quả nghiên cứu chỉ ra rằng:

+ Nhiệt độ nảy mầm tối ưu là 200C ở giống ra hoa sớm 'Fsub(1) Augusta' và 'Raizan No.1', 18 °C đối với giống ra hoa trung ngày 'Raizan No.2', 15°C đối với giống ra hoa muộn 'Raizan No.3' 'Fsub (1) Augusta' và 'Raizan No.1' biểu hiện một

tỷ lệ nảy mầm cao ở 5°C so với 'Raizan No.3'

+ Sự nảy mầm của hạt giống của tất cả các giống được thử hạn chế ở nhiệt

độ cao 24°C Xử lý tiền lạnh ở 3,5 hoặc 10°C trong vòng hơn 10 ngày, làm tăng nhanh tỷ lệ nảy mầm ở 20°C; sự nảy mầm ở 30°C được tăng nhanh bởi việc xử lý tiền lạnh ở 10°C trong hơn 10 ngày, trong khi xử lý tiền lạnh ở 3 hoặc 5°C không có những ảnh hưởng xúc tiến Tóm lại, xử lý tiền lạnh ở 10°C trong hơn 10 ngày là yêu cầu để thu được sự nảy mầm đồng đều của Lilium x formolongi dưới điều kiện nhiệt độ cao Không có ảnh hưởng nào của điều kiện ánh sáng đến sự nảy mầm Nhiệt độ có ảnh hưởng tương đối rõ rệt tới sự nảy mầm của hạt lily Năm 1996, Roh

đã nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ tới sự nảy mầm của hạt giống lily Lilium x formolongi: đặt hạt giống ở các nhiệt độ 14, 17, 20, 23, 26, 29°C dù có qua xử lý

nhiệt độ thấp hay không thì ở 14°C tỷ lệ nảy mầm cao nhất nhưng xử lý 5°C trong 2 tuần và gieo hạt ở 20°C thì chỉ cần 21 ngày là nảy mầm được 50% (dẫn theo Nguyễn Văn Tỉnh, 2009) [18] Xử lý 4 và 5°C hạt giống lily lai thơm trong 6 tuần

sẽ kích thích lá sinh trưởng, đốt dài ra và tăng sức sinh trưởng (1,62 lá/ngày) nhưng làm thân nhỏ đi, giảm số lá và số nụ Xử lý 18 tuần làm giảm số lá và sức sinh trưởng rõ rệt, từ khi cây nhú khỏi mặt đất đến khi ra hoa, tốc độ ra lá, tốc độ sinh trưởng của thân tương quan thuận với nhiệt độ (dẫn theo Nguyễn Văn Tỉnh, 2009) [18]

2.2.2 Phương pháp nhân giống bằng vảy củ

Ưu điểm: đây là phương pháp nhân giống nhanh, dễ làm và có giá thành hợp

lý để làm tăng số lượng một dòng đặc biệt là làm tăng nhanh số lượng một nhóm các cá thể khác biệt được chọn lọc từ trong một quần thể gieo từ hạt Các nhà trồng hoa thương mại thường sử dụng hệ thống nhân giống này một cách rộng rãi với mục đích làm trẻ hóa lại tập đoàn cây giống của mình Ngoài ra, người ta cũng có thể thu được các cây sạch bệnh nếu như phương pháp này được tiến hành đúng cách, vì các bệnh như thối củ (Fusarium) có thể được điều khiển trong quá trình này Hầu hết các giống lily đều có thể nhân giống một cách dễ dàng bằng vảy củ

Nhược điểm: không có khả năng ngăn ngừa hoàn toàn sự lây truyền của các bệnh vi rút, hay bất cứ loại bệnh nào khác nếu như nguồn vật liệu ban đầu không sạch bệnh Phương pháp nhân giống bằng vảy củ được tiến hành ở nhiều nước trên thế giới đặc biệt là ở Hà Lan Ngày nay, phương pháp này dần được thay thế bằng

phương pháp nuôi cấy in vitro, mặc dù vậy, các nhà chọn giống vẫn thường sử dụng

phương pháp này để nhân nhanh và lưu giữ các nguồn gen có số lượng củ giống ít Phương pháp nhân giống hoa Lilium bằng vảy củ đã được một số tác giả trên thế giới nghiên cứu, trong đó nổi bật là hai nghiên cứu của hai tác giả: Edward và Triệu Tường Vân Theo Edward (1998) [25], phương pháp nhân giống bằng vảy củ ở hoa Lilium được tiến hành như sau:

- Chọn củ giống để tách vảy nhân: chọn củ to, không trầy xước, sạch đất và nấm bệnh để tách vảy

- Kỹ thuật nhân vảy: ủ vảy củ trong phòng thông gió tốt ở nhiệt độ 15-21°C cho đến khi củ con và rễ hình thành hoàn toàn (khoảng 8-10 tuần) Sau khi chuyển

các khay giâm vảy với các củ con từ nơi ủ, để chúng ở một nhiệt độ trung gian 10°C) trong 3 đến 4 tuần, rồi đưa chúng vào xử lý lạnh (1°C) Khi điều kiện đất đai

(4-và điều kiện thời tiết thuận lợi, vảy củ được trồng ở ngoài trời theo hàng Triệu Tường Vân & cs (2005) [14], đã nghiên cứu, xây dựng quy trình nhân giống hoa Lilium bằng vảy củ với 2 phương pháp là: cắm vảy (giâm vảy) và vùi vảy vào giá thể trong nhà có khống chế nhiệt độ

Phương pháp vùi vảy vào giá thể (trong nhà có khống chế nhiệt độ):

- Phương pháp này không phụ thuộc điều kiện bên ngoài nên có thể làm quanh năm và cho củ giống chất lượng cao có thể quy mô hóa sản xuất được

- Phương pháp giâm vảy: chọn củ giống có chu vi 14 cm, rửa sạch, bóc lấy vảy to khoẻ sau đó ngâm vào dung dịch fomalin 50%, trong 20 phút, lấy ra rửa sạch hong khô 1 ngày Có thể dùng hỗn hợp than bùn, cát, mùn cưa, bột đá làm giá thể; trước khi dùng giá thể khử độc bằng cách trộn với methyl Thurbrcine 600 lần theo

tỷ lệ 1:5 Thao tác xong dùng nilon đóng hộp để giữ ẩm Từ ngày thứ 21 sau khi vùi vảy ở gốc vảy nhú lên 1/2 - 3 miếng lồi trắng, sau 1 tháng sẽ hình thành củ Khi vảy

có màu nâu và khô thì củ sẽ tách khỏi vảy và củ con có hình trứng đường kính từ

0,3 - 0,6 cm và có 1 - 5 rễ Củ con ở phía trên có thể ra 1 - 3 lá nhỏ dài và phát triển thành 1 cây

2.2.3 Phương pháp nhân giống bằng nuôi cấy mô

2.2.3.1 Khái niệm

Nuôi cấy mô tế bào thực vật là khái niệm chung cho tất cả các quá trình nuôi cấy từ nguyên liệu thực vật trên môi trường nhân tạo trong điều kiện vô trùng (Trần Thị Lệ, 2008) [13]

Nhân giống in vitro hay còn gọi là vi nhân giống thường sử dụng cho việc

ứng dụng các kỹ thuật nuôi cấy mô để nhân giống thực vật, sử dụng các bộ phận khác nhau của thực vật với kích thước nhỏ (Trần Thị Lệ, 2008) [13]

Trong thực tế, các nhà vi nhân giống thường dùng thuật ngữ nuôi cấy mô và

nhân giống in vitro hay nuôi cấy in vitro thay thế cho nhau để chỉ các phương thức

nhân giống thực vật trong điều kiện vô trùng với các mục đích khác nhau (Trần Thị

Lệ, 2008) [13]

2.2.3.2 Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô

Cơ sở lý luận của phương pháp nuôi cấy mô, tế bào in vitro là học thuyết về

tính toàn năng (totipotence) của tế bào Theo Haberlandt G (1902) [26], nhà thực vật người Đức, tất cả các tế bào của cây đều mang toàn bộ lượng thông tin di truyền của cơ thể, khi gặp điều kiện thích hợp, mỗi tế bào đều có khả năng tái sinh và phát triển thành cá thể hoàn chỉnh (Vũ Văn Vụ, 1999) [17] Thực tế đã chứng minh được khả năng tái sinh một cơ thể thực vật hoàn chỉnh từ một tế bào riêng rẽ Hàng trăm loài cây trồng đã được nhân giống trên qui mô thương mại bằng cách nuôi cấy trong môi trường nhân tạo vô trùng và tái sinh chúng thành cây với hệ số nhân giống vô cùng lớn (Murashige, 1980) [32]

2.2.3.3 Ý nghĩa, ưu điểm, hạn chế của nuôi cấy mô

a Ý nghĩa

Nuôi cấy mô tế bào thực vật, thực chất là một phương pháp nhân giống vô tính, đối với nhiều loài thực vật quý hiếm, có giá trị kinh tế và ý nghĩa sinh học cao

gặp khó khăn trong vấn đề nhân giống hữu tính thì nhân giống vô tính in vitro là

công cụ vô cùng hữu ích Trên thực tế có nhiều loài thực vật nhân giống hữu tính

bằng hạt có hệ số nhân cao nhưng vẫn tiến hành nhân giống vô tính in vitro là do

các phương pháp nhân giống hữu tính bằng hạt mặc dù cho hệ số nhân giống cao,

dễ bảo quản và vận chuyển nhưng với một số cây trồng, khi nhân giống bằng hạt sẽ cho ra các cây con không hoàn toàn giống bố mẹ cả về hình thái và thành phần hoá học (Bhojwani, 1983) [20] Sự không đồng nhất này gây ra khó khăn trong việc đưa cây vào sản xuất theo dây truyền công nghiệp vì các cây có chất lượng sản phẩm không đồng đều, làm giảm giá trị thương phẩm Đặc biệt, đối với cây thuốc thì việc không đồng nhất về chất lượng (hàm lượng các chất hoạt tính) sẽ dẫn đến hậu quả là nguyên liệu không ổn định, không đáp ứng được nhu cầu sản xuất Ví dụ: đối với các cây lấy tinh dầu, việc nhân giống bằng hạt dẫn tới sự phân ly không đều về hàm lượng các thành phần hoạt chất, cây cọ dầu khi nhân giống bằng hạt, hàm lượng tinh dầu ở cây con phân ly từ 0,5 đến 11,3%, hàm lượng lynalylacetat từ 11 đến 78%; cây bạc hà nhân giống hữu tính có sự phân ly rất lớn về hàm lượng và thành phần tinh dầu (Salwa, 2014) [35]

b Ưu điểm

Phương pháp nhân giống in vitro có khả năng khắc phục được nhiều trở ngại mà

những phương pháp nhân giống khác thường gặp Sau đây là những ưu điểm chính:

- Cây con được trẻ hóa và sạch bệnh, vì vậy có tiềm năng sinh trưởng, phát triển và năng suất cao

- Tạo cây con đồng nhất về mặt di truyền, bảo tồn được các tính trạng đã chọn lọc

- Tạo được dòng thuần của các cây tạp giao

- Tạo được cây có genotip mới (đa bội, đơn bội)

- Bảo quản và lưu giữ tập đoàn gen

- Có khả năng sản xuất quanh năm

- Có thể nhân nhanh nhiều cây không kết hạt trong những điều kiện sinh thái nhất định hoặc hạt nảy mầm kém

- Hệ số nhân giống cực kỳ cao (thường đạt được ở loài cây khác nhau trong phạm vi từ 36

-1012/năm), rút ngắn thời gian đưa một giống mới vào sản xuất đại trà (Lê Trần Bình, 1997) [4]

Về phương diện hệ số nhân, nhân giống in vitro là phương pháp không gì có

thể so sánh kịp, kể cả phương pháp nhân giống bằng hạt Chỉ tính riêng lĩnh vực

true-to-type, nuôi cấy in vitro có thể coi là một cuộc đại cách mạng về hệ số nhân

c Nhược điểm

Nhược điểm chính của phương pháp nuôi cấy in vitro là đòi hỏi trang thiết bị

đắt tiền và kỹ thuật cao nên chỉ có hiệu quả đối với những cây có giá trị cao hoặc khó nhân giống bằng phương pháp khác (Nguyễn Quang Thạch, 2004; Trần Thị Lệ, 2008) [6] Ngoài ra, phương pháp này còn có những bất lợi như: cây con có kích thước nhỏ, đòi hỏi phải có chế độ chăm sóc đặc biệt ở giai đoạn sau ống nghiệm; Cây có thể có những đặc tính không mong muốn hoặc tạo đột biến tăng hoặc khả năng tái sinh có thể bị mất đi do cấy truyền callus hay huyền phù tế bào nhiều lần; Cây giống có thể bị nhiễm bệnh đồng loạt

2.2.3.4 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về nhân giống vô tính chi Lilium

và cây bách hợp

a.Ngoài nước

Với hiểu biết của chúng tôi chưa thấy có bài nào công bố về nhân giống in

vitro cây Lilium brownii F.E.Wilson Nhưng có khá nhiều các công trình nghiên

cứu nhân giống in vitro từ các loài khác cùng chi Lilium này, song số lượng các

công trình của các loài đã được đưa vào trồng trọt nhiều hơn rất nhiều so với những các loài hoang dại (Zhang et al., 2004) [39] Kết quả một số nghiên cứu như: Theo

He Yunfang (Trung Quốc, 1995) [27], các mẫu vảy của Lilium brownii var viridulum và củ của Pinellia ternata var vulgaris (bán hạ) được đem nuôi cấy trên

môi trường MS có bổ sung BA, KT và NAA Tác giả cho rằng phần lớn các mẫu đều có khả năng tái sinh, tuy nhiên tỷ lệ mẫu đã bị nhiễm là rất cao và gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến quá trình nuôi cấy Qua định dạng vi sinh vật, tác giả xác định đó là do vi khuẩn Agrobacterium gây nên và sử dụng hỗn hợp chất gồm sodium

hyt°Chlorite, mercur chloride để khử trùng và đã có thể thu được 80% cây con sinh trưởng bình thường Bài báo này chỉ nêu ra việc xử lý nấm khuẩn trong quá trình

nuôi cấy mà không thấy đề cập đến nội dung của nghiên cứu nhân giống cây Lilium

brownii Cũng ở nước này, năm 2002, nghiên cứu nhân giống in vitro bằng lá và

vẩy hành của Lilium davidii var Unicolor đã được thực hiện Nhóm tác giả đã kết luận môi trường tái sinh tốt nhất là MS + 0,6-1,0 mg/l BA + 0,2 mg/l NAA; môi trường nhân nhanh là MS + 0,5-0,6 mg/l BA + ),1 mg/l NAA; môi trường tạo rễ là 1/2 MS + 0,2 mg/l NAA + 1% than hoạt tính Luận văn thạc sĩ trường Đại học Quảng tây 2008, Bằng chương trình xử lý kiểm tra hồi quy, hệ thống nuôi cấy mô lily Aralia và phân tích các tác động khác nhau của các nhân tố có tác động đến Aralia Lily, thạc sĩ Shi YunPing đã thu được các điều kiện nuôi cấy tốt nhất Với mẫu là các gốc, lá, thân và vảy hành, các môi trường nuôi cấy thích hợp đã được xác định Môi trường môi trường nhân nhanh thích hợp nhất là MS + 2,4 BA + 0,25 mg/l; tái sinh thích hợp nhất của vảy củ là MS + 1,5 mg/l BA + 0,5 mg/l NAA; của thân là MS + 2,4 mg/l BA + 0,25 mg/l NAA; của lá là MS + 2,5 mg/l BA + 0,25 mg/l NAA; của gốc là MS + 2 mg/l BA + 0,2mg/l NAA Năm 2009, một nghiên cứu về nhân giống Lilium đã được thực hiện ở Trung tâm Công nghệ Sinh học, Udheywalla, SKVAST- Jammu Ấn Độ Mẫu đưa vào nuôi cấy là các vẩy củ được khử trùng bề mặt với 0,1% HgCl2 và 2% Bavistin trong 7,5 phút, sau đó được cấy vào môi trường MS có bổ sung Kin 0,75mg/l và NAA (0,5mg/l) cho tỉ lệ tạo chồi cao nhất Sau đó, chúng lại được cấy chuyển sang môi trường nhân nhanh là MS với 0,75 mg/l BAP và NAA 0,5mg/l thu được 7,2 củ con trên một mẫu nuôi cấy Các cây con này được tách ra và tạo rễ tốt nhất trên môi trường MS có bổ sung 1,0 NAA Trên môi trường này tỉ lệ tạo rễ đạt cao nhất là 97,32% cây tạo rễ và dài rễ đạt 1,66cm Cây con có rễ, sau đó được đưa vào giá thể bột dừa trước khi đưa trồng trong nhà kính Nghiên cứu này thực hiện trên chi Lilium nói chung, không thấy đề cập đến bất kỳ một loài nào cụ thể Không thấy có thí nghiệm về các giá thể và điều

kiện chăm sóc khi đưa cây ra ex vitro Khi kết luận đưa cây ra trên giá thể là bột xơ

dừa cũng không thấy có thông số cụ thể về tỉ lệ sống của cây

Cũng năm 2009, Tao Lian và cộng sự ở trường Đại học Tứ Xuyên, Trung Quốc đã công bố kết quả của nghiên cứu kỹ thuật nuôi cấy mô và nhân nhanh loài

Lilium regale Nhóm nghiên cứu lấy mẫu là những hành con của cây trưởng thành ở

Nhã An (Yaan) làm mẫu ban đầu đưa vào nghiên cứu Kết quả nghiên cứu về ảnh hưởng của các phần vảy khác nhau và cách cấy đến khả năng tái sinh chồi bất định, tác giả kết luận: lớp vảy ngoài cùng có khả năng tái sinh chồi cao hơn lớp vảy ở giữa, và lớp vảy trong cùng khả năng cho khả năng tái sinh là kém nhất Phần vẩy phía trên có khả năng tái sinh chồi và tạo được nhiều chồi hơn so với phần bên dưới (sát gốc củ) Đối với lớp vảy ở bên ngoài và ở giữa, môi trường tối ưu hình thành chồi bất định là môi trường MS + KT1,0 mg/l + NAA0,2mg/l + than hoạt tính 0,5g/l Tỉ lệ tạo chồi đạt 100% và từ mỗi mẫu cấy có thể tạo ra 12,7 chồi mới Còn đối với lớp vảy phía trong, môi trường thích hợp để tái sinh chồi là MS + ZT 1,5 mg/l + than hoạt tính 0,5 g/l hoặc MS + KT 1,5 mg/l + 0,5 g/l than hoạt tính Môi trường nhân nhanh cũng đồng thời là môi trường tạo rễ là môi trường MS + KT 0,5mg/l + NAA 0,1mg/l + than hoạt tính 0,5g/l Hệ số nhân giống từ môi trường này

là 7,3 lần cao nhất so với các công thức còn lại

được công bố như: Nhóm tác giả ThS Đoàn Thị Thuỳ Vân, Viện nghiên cứu rau quả

đã áp dụng kết quả nghiên cứu của đề tài “Nghiên cứu, ứng dụng công nghệ tiên tiến của Hà Lan trong chọn, tạo, nhân giốnng và đìêu khiển ra hoa chi Lilium (lily,

loa kèn) ở Việt Nam‟‟ cho việc nhân in vitro giống hoa lily Manissa Tác giả đã đưa

ra quy trình nhân giống gồm 5 giai đoạn là: Khử trùng cẩy củ bằng H2O2 30% trong thời gian 15 phút lần 1 và 5 phút lần 2; tạo củ nhỏ trực tiếp từ vảy củ và nhân nhanh củ trên môi trường MS+0,5 mg/l NAA + 0,5 mg/l BAP; nuôi lớn củ trên môi

trường không có chất điều hòa sinh trưởng và cuối cùng là ươm củ in vitro đạt trọng

lượng > 1g trên khay chứa giá thể xơ dừa nghiền nhỏ, và phun ẩm hang ngày Tác giả không cho biết con số tỉ lệ sống là bao nhiêu khi đưa ra

Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội cũng đã có công bố kết quả của nghiên

cứu nhân nhanh in vitro cây hoa loa kèn Lilium poilanel Gapnep (một trong 3 loài

thuộc chi Lilium mọc hoang dại ở Việt Nam) trên tạp chí Khoa học và phát triển (2011), nhóm tác giả cũng đã sử dụng vẩy củ làm nguồn mẫu đưa vào nuôi cấy, và

đã xác định được môi trường tái sinh chồi thích hợp cho mô nuôi cấy là MS + 0,5mg/l BA + 0,5 mg/l NAA (giống như thành phần của môi trường nuôi cấy hoa lili Manissa của tác giả Đoàn Thị Thuỳ Vân ở trên), trên môi trường này tỉ lệ chồi tái sinh là 83,33%, 2,67 chồi/mẫu sau 8 tuần nuôi cấy Hệ số nhân chồi đạt cao nhất 4,13 lần, chiều cao trung bình cụm chồi đạt 2,64cm trên môi trường MS chứa 1mg/l

BA và 0,25mg/l NAA (nồng độ BA tăng lên gấo đôi còn nồng độ auxin NAA giảm

đi một nửa so với nghiên cứu của Đoàn Thị Thuỳ Vân) Các chồi có chiều cao

4-5cm được sử dụng để tạo rễ in vitro Tỷ lệ chồi ra rễ đạt được cao nhất (93,33%)

trên môi trường MS chứa 1g/l than hoạt tính sau 4 tuần nuôi cấy (cũng không sử dụng chất điều hòa sinh trưởng thực vật giống tác giả Thuỳ Vân) Tác giả kết luận

rằng đây là những thông số kỹ thuật thích hợp cho quy trình nhân in vitro cây

Lilium poilanei Gapnep làm cơ sở cho việc nhân nhanh các nguồn gen ưu tú phục

vụ công tác chọn tạo giống mới Chưa thấy tác giả đưa ra kết quả nghiên cứu về tỉ lệ sống của cây khi đưa ra vườn ươm

Dường như đây vẫn là một sự bế tắc ở nhìêu phòng nuôi cấy mô trên toàn quốc, đặc biệt đối với cây Lilium ở cả các loài hoang dại và những con lai Vì cho đến nay, hàng năm nước ta vẫn phải nhập một lượng lớn củ giống hoa ly từ nước ngoài về trồng ở những nơi có khí hậu thích hợp để cho cây ra hoa, cắt hoa bán

Như trên đã nói, nguồn bách hợp tự nhiên hiện nay ở nước ta đã trở nên khan hiếm rõ rệt Từ những năm 1980 cây đã bị khai thác nhiều để lấy nguyên liệu làm thuốc và xuất khẩu tiểu ngạch qua biên giới, bên cạnh đó còn do nạn phá rừng ngày một gia tăng làm mất đi môi trường sống của nó Trong tự nhiên, cây tái sinh được

bằng hạt, nhưng chỉ có những hạt khi phát tán, tiếp xúc được với mặt đất ẩm hay hốc đá có mùn mới có cơ hội nẩy mầm Do vậy, nó liên tục được đưa vào danh lục

Đỏ Việt Nam các năm 1996, 2001 và 2006 và Nghị định số 32/2006/NĐ-CP của chính phủ (30/3/2006) Quyết định số 88/2000/QĐ-BTM của bộ trưởng Bộ Thương mại từ ngày 18 tháng 1 năm 2000 đã ban hành danh mục chi tiết hàng hoá cấm lưu thông qua biên giới có danh mục cây bách hợp này

PHẦN III ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Đối tượng

Cây bách hợp (Lilium brownii F.E Brown) có nguồn gốc từ Hà Giang do đề

tài Bảo tồn nguồn gen cây thuốc, Khoa Tài nguyên Dược liệu (Viện Dược liệu) cung cấp

Vật liệu khởi đầu cho nhân giống là vẩy thân hành và đốt thân cây bách hợp

3.2 Địa điểm nghiên cứu

Phòng thí nghiệm Nuôi cấy mô - Bộ môn Giống và CNSH - Trung tâm Nghiên cứu trồng và chế biến cây thuốc Hà Nội - Viện Dược liệu

3.3 Nội dung và phương pháp nghiên cứu

3.3.1 Nội dung nghiên cứu

- Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian khử trùng đến hiệu quả khử trùng mẫu

- Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất điều tiết sinh trường đến khả năng tái sinh in vitro cây Bách hợp

+ Nghiên cứu ảnh hưởng của BAP đến khả năng tái sinh in vitro cây Bách hợp

+ Nghiên cứu ảnh hưởng của NAA đến khả năng tái sinh in vitro từ đốt thân

và vẩy củ

- Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất đến khả năng hình thành củ cây

Bách hợp in vitro

+ Nghiên cứu ảnh hưởng của Kinetin đến sự hành thành củ in vitro

+ Nghiên cứu ảnh hưởng của NAA đến sự hành thành củ in vitro

+ Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng đường đến sự hành thành củ in vitro

- Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng đến khả năng nhân nhanh củ Bách

hợp in vitro

+ Nghiên cứu ảnh hưởng của loại lát cắt đến khả năng nhân nhanh củ

+ Nghiên cứu ảnh hưởng của NAA đến khả năng nhân nhanh củ

+ Nghiên cứu ảnh hưởng của NAA vầ BAP đến khả năng nhân nhanh củ

- Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất điều tiết sinh trưởng đến khả năng

ra rễ tạo cây hoàn chỉnh

- Nghiên cứu đưa cây ra vườn ươm

3.3.2 Phương pháp nghiên cứu

3.3.2.1 Phương pháp khử trùng vật liệu

Vẩy thân hành và đốt thân cây in vivo được rửa sạch đất cát dưới vòi nước

máy, sau đó chúng được ngâm trong nước xà phòng loãng 10 phút, rồi tráng lại nhiều lần bằng nước sạch Tiếp đó, ngâm mẫu trong thuốc diệt nấm 20 phút rồi tráng lại bằng nước cất Sau đó đưa mẫu vào phòng cấy, trong tủ cấy laminair các mẫu được tráng bằng cồn 700 trong 30 giây, liền đó mẫu được xử lý với HgCl2 0,1% với các khoảng thời gian khác nhau (8 phút, 10 phút, 12 phút và 15 phút), sau đó tráng lại nhiều lần bằng nước cất vô trùng Rồi cấy vào môi trường dinh dưỡng có chứa thành phần muối cơ bản của môi trường MS (Murashige và Skoog, 1962) có chứa 20g/l đường nhưng không có chất điều hòa sinh trưởng

Cách tiến hành:

Môi trường nền nuôi cấy: MS (Murashige and Skoog) + 30 g/l succrose + 6 g/l agar, pH = 5,8 – 5,9

Môi trường hấp khử trùng ở 1210C trong 20 phút

Điều kiện nuôi cấy: cường độ ánh sáng 2000 lux

Độ ẩm 60%

Nhiệt độ 24 ± 20C

Chu kỳ chiếu sáng 14h sáng/10h tối

Các thí nghiệm bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, nhắc lại 3 lần mỗi lần 10 mẫu

− Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của BAP đến sinh in vitro cây Bách hợp

- Thí nghiệm 5: Nghiên cứu ảnh hưởng của NAA đến sự hành thành củ in vitro

Giai đoạn nhân nhanh củ nhỏ từ củ nhỏ sơ cấp: Củ nhỏ in vitro được hình

thành sau 2 tháng được dùng làm mẫu cho nghiên cứu nhân nhanh củ tiếp theo Thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của 4 loại mẫu (củ đơn sơ cấp, vẩy củ, 1/2 củ sơ cấp, 1/4 củ sơ cấp (bổ theo chiều dọc) được nuôi cấy trên môi trường khoáng MS chứa 0,5 mg/l NAA, 60g/l đường Bổ củ theo chiều dọc 1/2 hoặc 1/4 tùy củ to nhỏ được dùng làm mẫu cấy cho thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của chất điều hòa sinh NAA (0 - 1 mg/l) và BAP (0,3 mg/l) trên nền môi trường MS có bổ sung 60 g/l đường

- Thí nghiệm 7 Nghiên cứu ảnh hưởng của loại lát cắt đến khả năng nhân nhanh củ

- Thí nghiệm 10: Nghiên cúu ảnh hưởng của NAA và BAP đến sự tạo rễ in vitro

Các chỉ tiêu được theo dõi định kỳ 2 tuần/lần, bao gồm: tỷ lệ tái sinh (%); tỉ

lệ tạo củ nhỏ (%); Tỷ lệ tạo cụm chồi (%); Tỷ lệ tạo rễ (%); Tỷ lệ sống khi đưa ra ngoài nhà lưới (%); Chiều cao cây trung bình (cm); Số lá/cây (lá); Số rễ/cây (rễ);

PHẦN IV KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

4.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian khử trùng đến hiệu quả khử trùng mẫu

Khử trùng mẫu là giai đoạn tiên quyết, là nền tảng tạo nên sự thành công của

quá trình nuôi cấy in vitro Quá trình này cần đảm bảo các yêu cầu như tỷ lệ mẫu

sống cao, tỷ lệ mẫu nhiễm thấp, mô nuôi cấy sinh trưởng tốt và tạo chồi phát triển khỏe mạnh HgCl2 là hóa chất có tính khử trùng mạnh, hiệu quả và được sử dụng

phổ biến với hầu hết các mẫu nhân giống in vitro Kết quả khử trùng vẩy hành và

đốt thân bách hợp bằng HgCl2 0,1% sau 15 ngày được thể hiện ở bảng 4.1:

Bảng 4.1 Ảnh hưởng của thời gian xử lý HgCl 2 0,1%

đến hiệu quả khử trùng mẫu cấy

CT HgCl 2

(%)

Thời gian (Phút)

Đối với vật liệu khử trùng là vẩy củ thì khi thời gian khử trùng tăng thì tỷ lệ mẫu nhiễm giảm dần từ 60% xuống còn 10%, tỷ lệ mẫu chết lại tăng dần từ 10% lên

75% trong khi đó tỷ lệ mẫu sống tăng từ 30% lên đến 70% rồi lại giảm xuống còn 15% Như vậy, đối với vật liệu là vẩy củ bách hợp khi khử trùng với thời gian 10 phút thì tỷ lệ sống đạt cao nhất là 70% sau đó giảm xuống còn 15% khi khử trùng với thời gian là 15 phút Theo kết quả thu được thì đối với mẫu vẩy củ bách hợp thì khử trùng bằng HgCl2 0,1% ở khoảng thời gian là 10 phút là tốt nhất

Đối với mẫu đốt thân bách hợp thì cũng tương tự khi tăng thời gian khử trùng lên thì tỷ lệ mẫu giảm dần từ 50% xuống còn 20%, tỷ lệ mẫu chết lại giảm dần từ 10% xuống còn 0% sau đó lại tăng lên 50% trong khi đó tỷ lệ mẫu sống tăng

từ 40% lên đến 80% rồi lại giảm xuống còn 30% Như vậy, đối với vật liệu là đốt thân bách hợp khi khử trùng với thời gian 10 phút thì tỷ lệ sống đạt cao nhất là 80% sau đó giảm xuống còn 30% khi khử trùng với thời gian là 15 phút Theo kết quả thu được thì đối với mẫu đốt thân bách hợp thì khử trùng bằng HgCl2 0,1% ở khoảng thời gian là 10 phút là tốt nhất

Như vậy, cả 2 loại mẫu là vẩy hành và đốt thân, tỷ lệ mẫu sống đều tăng và đạt cao nhất lần lượt là 70% và 80% ở công thức thứ 2 (CT2) khi xử lý HgCl2 trong

10 phút Vượt qua thời gian này, tỷ lệ sống của cả hai loại mẫu đều có xu hướng giảm dần Và ở công thức thời gian xử lý lâu nhất CT4 (15 phút) tỷ lệ mẫu sống của đốt thân giảm xuống còn 30%, cao gấp đôi so với mẫu là vẩy hành (15%) Các chỉ

số về tỷ lệ sống của mẫu là vẩy củ thấp hơn đáng kể so với mẫu là đốt thân Điều này có thể được giải thích rằng đốt thân là phần trên mặt đất sạch hơn phần vẩy thân hành là bộ phận nằm dưới mặt đất Bên cạnh đó, còn do cấu tạo của các tế bào vẩy hành tạo nên nhiều mô mềm dẫn đến nó dễ bị tổn thương hơn so đốt thân Như vậy, trong các công thức thí nghiệm thời gian thích hợp nhất để khử trùng vẩy thân hành

và đốt thân cây bách hợp bằng HgCl2 là 10 phút

Vật liệu tốt nhất để tiến hành khử trùng là đốt thân cây bách hợp khi khử trùng HgCl2 0,1% ở khoảng thời gian là 10 phút đạt tỷ lệ mẫu sống cao nhất là 80%

4.2 Kết quả nghiên tái sinh in vitro từ đốt thân và vẩy củ

4.2.1 Ảnh hưởng của BAP đến tái sinh in vitro từ đốt thân và vẩy củ

Trong nuôi cấy mô tế bào thì chất kích thích sinh trưởng nhóm cytokinin và auxin có tác động chính đến khả năng tạo chồi trên mẫu cấy Chúng có tác dụng kích thích mạnh mẽ lên sự phân chia tế bào, ảnh hưởng đến sự hình thành và phân

hóa cơ quan, kích thích sự phát sinh chồi/rễ trong in vitro Tuy vậy, mỗi loại chất

điều hòa sinh trưởng khác nhau sẽ cho hiệu quả khác nhau ở mỗi loại cây và ở từng vật liệu nuôi cấy

Quá trình tái sinh chồi đóng vai trò quan trọng trong việc bước đầu nuôi cấy khởi động Đây được coi là một quá trình khảo sát nồng độ các chất cytokinin và auxin nội sinh trong cây từ đó có thể đưa ra tỷ lệ bổ sung auxin và cytokinin thích hợp để tiến hành các bước nhân nhanh chồi và tạo cây hoàn chỉnh Ở đây, mẫu là vẩy củ và đốt thân sạch nấm khuẩn được cấy vào các môi trường nền MS + 30 g/l đường có bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng khác nhau để nghiên cứu khả năng

tái sinh và sự phát sinh hình thái trong điều kiện in vitro Kết quả được trình bày ở

bảng 4.2 như sau:

Bảng 4.2 Ảnh hưởng của BAP đến tái sinh in vitro

Công thức

Nồng độ BAP (mg/l)

Tỉ lệ tái sinh (sau 45 ngày, %)

Chiều cao chồi (sau 45 ngày, cm) Vẩy hành Đốt thân Vẩy hành Đốt thân

Khả năng tái sinh chồi in vitro từ các mẫu vật liệu thu từ cây bách hợp trên

môi trường MS không bổ sung chất điều tiết sinh trưởng thì mẫu không có tái sinh đối với mẫu là vảy củ còn đối với mẫu là đốt thân tỷ lệ tái sinh thấp là 23,33% sau

45 ngày nuôi cấy Bổ sung BAP với các nồng độ 0,25; 0,5; 0,75 và 1,0 mg/l vào môi trường nuôi cấy đã làm tăng đáng kể tỷ lệ tái sinh và chiều cao TB chồi Khi bổ sung BAP các nồng độ khác nhau thì tỷ lệ tái sinh và chiều cao TB chồi đối với các mẫu khác nhau là khác nhau

Đối với mẫu vẩy củ cây bách hợp ở nồng độ 0,25 mg/l BAP thì tỷ lệ tái sinh đạt 9%, chiều cao TB chồi đạt 1,45 cm Khi tăng nồng độ BAP lên đến 0,5 mg/l thì

tỷ lệ tái sinh đạt được cao nhất là 18,33% và chiều cao TB chồi cũng tăng lên đạt cao nhất là 2,1 cm nhưng sau đó càng tăng nồng độ BAP lên thì tỷ lệ tái sinh và

chiều cao chồi đều giảm xuống: ở nồng độ BAP 1,0 mg/l thì tỷ lệ tái sinh chỉ đạt 8,33% và chiều cao TB chồi 1,91 cm

Đối với mẫu đốt thân cây bách hợp thì khi bổ sung BAP thì tỷ lệ tái sinh chồi đạt cao nhất là 70% ở nồng độ 0,5 mg/l BAP sau đó thì tỷ lệ tái sinh giảm dần xuống còn 53,33% ở nồng độ BAP 1,0 mg/l Chiều cao TB chồi thì tăng dần khi tăng nồng độ BAP và đạt cao nhất là 5,39 cm ở nồng độ 1,0 mg/l BAP

Kết quả trên cho thấy, BAP có tác động tích cực đến khả năng tái sinh chồi cây bách hợp tuy nhiên đối với mẫu đốt thân cây bách hợp thì khả năng tái sinh chồi tốt hơn rất nhiều so với mẫu là vảy củ bách hợp: ở bổ sung cùng nồng độ BAP 0,5 mg/l thì mẫu đốt thân cho tỷ lệ tái sinh chồi cao nhất là 70%, chiều cao TB chồi đạt 3,71 cm trong khi đó đối với mẫu vảy củ thì tỷ lệ tái sinh chồi chỉ đạt 18,33%, chiều cao TB chồi chỉ đạt 2,1 cm

Như vậy môi trường tái sinh chồi tốt nhất là môi trường có bổ sung 0,5 mg/l BAP khi sử dụng vật liệu tái sinh là đốt thân bách hợp với tỷ lệ tái sinh đạt 70%

4.2.2 Ảnh hưởng của NAA đến tái sinh in vitro từ đốt thân và vẩy củ

Ở đây, mẫu là vẩy củ và đốt thân sạch nấm khuẩn được cấy vào các môi trường nền MS + 30 g/l đường có bổ sung NAA với các nồng độ khác nhau để

nghiên cứu khả năng tái sinh và sự phát sinh hình thái trong điều kiện in vitro Kết

quả được trình bày ở bảng 4.3 như sau:

Bảng 4.3 Ảnh hưởng của NAA đến tái sinh in vitro

Công

thức Nồng độ

NAA (mg/l)

Tỉ lệ tái sinh (sau 45 ngày, %)

Chiều cao chồi (sau 45 ngày, cm) Vẩy hành Đốt thân Vẩy hành Đốt thân

Khả năng tái sinh chồi in vitro từ các mẫu vật liệu thu từ cây bách hợp trên

môi trường MS không bổ sung chất điều tiết sinh trưởng thì mẫu không có tái sinh đối với mẫu là vảy củ còn đối với mẫu là đốt thân tỷ lệ tái sinh thấp là 23,33% sau

45 ngày nuôi cấy Bổ sung α-NAA với các nồng độ 0,25; 0,5; 0,75 và 1,0 mg/l vào môi trường nuôi cấy đã làm tăng đáng kể tỷ lệ tái sinh và chiều cao TB chồi Khi bổ sung α-NAA các nồng độ khác nhau thì tỷ lệ tái sinh và chiều cao TB chồi đối với các mẫu nuôi cấy khác nhau là khác nhau

Đối với mẫu vẩy củ cây bách hợp ở nồng độ 0,25 mg/l α-NAA thì tỷ lệ tái sinh đạt 35%, chiều cao TB chồi đạt 1,98 cm Khi tăng nồng độ α-NAA lên đến 0,5 mg/l thì tỷ lệ tái sinh đạt được cao nhất là 86,67% và chiều cao TB chồi cũng tăng lên đạt cao nhất là 3,99 cm nhưng sau đó càng tăng nồng độ α-NAA lên thì tỷ lệ tái

sinh và chiều cao chồi đều giảm xuống: ở nồng độ α-NAA 1,0 mg/l thì tỷ lệ tái sinh chỉ đạt 60,00% và chiều cao TB chồi 2,85 cm

Đối với mẫu đốt thân cây bách hợp thì khi bổ sung α-NAA thì tỷ lệ tái sinh chồi đạt cao nhất là 26,67% ở nồng độ 0,25 mg/l α-NAA sau đó khi tăng nồng độ α-NAA lên thì tỷ lệ tái sinh giảm dần xuống còn 13,33% ở nồng độ α-NAA 1,0 mg/l Chiều cao TB chồi thì tăng dần khi tăng nồng độ α-NAA và đạt cao nhất là 4,23 cm

ở nồng độ 0,5 mg/l α-NAA sau đó giảm xuống còn 2,99 cm ở nồng độ 1,0 mg/l α-NAA

Kết quả trên cho thấy, α-NAA có tác động tích cực đến khả năng tái sinh chồi cây bách hợp tuy nhiên đối với mẫu vảy củ bách hợp thì khả năng tái sinh chồi tốt hơn rất nhiều so với mẫu đốt thân cây bách hợp: ở bổ sung α-NAA nồng độ 0,25 mg/l thì mẫu đốt thân cho tỷ lệ tái sinh chồi cao nhất là 26,67%, chiều cao TB chồi đạt 2,54 cm trong khi đó đối với mẫu vảy củ thì tỷ lệ tái sinh chồi đạt cao nhất là 86,67%, chiều cao TB chồi đạt 3,99 cm khi bổ sung α-NAA nồng độ 0,5 mg/l Như vậy khi bổ sung α-NAA vào môi trường nuôi cấy thì môi trường tái sinh chồi tốt

nhất là môi trường có bổ sung 0,5 mg/l α-NAA tái simh từ vẩy củ in vitro với tỷ lệ

tái sinh đạt 86,67%

Kết quả cho thấy sau 45 ngày cả 2 loại mẫu cấy là vẩy hành và đốt thân

cây in vivo đều có khả năng tái sinh in vitro Tuy vậy, mỗi loại mẫu cấy lại thích

hợp với loại chất điều hòa sinh trưởng khác nhau Đốt thân in vivo có khả năng tái sinh tốt trên môi trường MS (1962) có bổ sung 0,5 mg/l BAP với tỉ lệ tái sinh đạt 70% Trong khi đó, tỷ lệ tái sinh của mẫu từ vẩy hành in vivo đạt cao hơn so với đốt thân và môi trường thích hợp là MS (1962) có bổ sung 0,5 mg/l NAA Các giống/loài hoa ly lai và thường chủ yếu được tái sinh và nhân giống từ vẩy

củ Kết quả bài báo này cho thấy cây bách hợp hoang dại này có khả năng tái

sinh in vitro từ đốt thân in vivo

4.3 Nghiên cứu hình thành củ nhỏ

4.3.1 Ảnh hưởng của Kinetin đến sự hình thành củ nhỏ

Nghiên cứu ảnh hưởng của kinetin đến sự hình thành củ nhỏ in vitro bách

hợp được tiến hành trên 4.4 loại nồng độ từ 0 – 1 mg/l Kết quả thu được sau 45 ngày nuôi cấy được thể hiện ở bảng 4.4

Bảng 4.4 Ảnh hưởng của Kinetin đến sự hình thành củ nhỏ

CT Nồng độ Kinetin

(mg/l)

TL tạo củ (%)

Số củ/mẫu (củ)

Chiều cao chồi (cm)

Theo bảng 4.4 cho thấy:

Kinetin làm tăng hiệu quả tạo củ in vitro cây bách hợp Trên môi trường MS

không bổ sung kinetin thì chồi không tạo củ, chiều cao TB chồi thấp đạt 4,08 cm Khi bổ sung kinetin vào môi trường nuôi cấy thì chồi bách hợp phát triển tốt hơn và hình thành củ Theo như kết quả thu được thì càng tăng nồng độ kinetin thì tỷ lệ tạo

củ in vitro và chiều cao TB tăng lên Khi bổ sung kinetin nồng độ 0,2; 0,5 và 1,0

mg/l thì tỷ lệ tạo củ đạt cao nhất là 36,67%, hệ số nhân củ cao nhất là 1,37 lần và chiều cao TB cây đạt cao nhất là 5,46 cm ở nồng độ 1,0 mg/l kinetin

Với mức sai khác nhỏ nhất có ý nghĩa LSD 5 %, thì 1,37 lần chính là hệ số tạo củ cao nhất khi nuôi cấy chồi cây bách hợp trên môi trường bổ sung 1,0 mg/l kinetin Tuy vậy, trong thí nghiệm này, ở mức nồng độ cao nhất 1 mg/l kinetin tỉ lệ

củ nhỏ tạo thành chỉ đạt dưới 40 % Như vậy, có thể kết luận Kinetin không thích

hợp cho nuôi cấy tạo củ nhỏ in vitro cây bách hợp

4.3.2 Ảnh hưởng của NAA đến sự hình thành củ nhỏ in vitro

Để nghiên cứu ảnh hưởng của NAA đến khả năng hình thành củ nhỏ, chồi lấy từ môi trường tái sinh được cắt bỏ lá và phần đế cũ, hỏng (chỉ để lại 0,7-1,0 cm tính từ phần gốc lên) cấy vào 4 công thức nồng độ NAA Kết quả sau 45 ngày nuôi cấy thu được ở bảng sau

Bảng 4.5 Ảnh hưởng của NAA đến khả năng hình thành củ nhỏ in vitro